丝素蛋白膜对犬不同长度尿道缺损的修复效果*☆

刘春晓，陈伟豪，郑少波，李虎林

刘春晓☆，男，1957年生，山东省文登市人，汉族，1991年中山医科大学毕业，博士，博士生导师，教授，主要从事泌尿系统肿瘤防治的研究。Liuchx888@
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摘要
背景：天然丝素蛋白膜是较为理想的尿道缺损修复材料，其修复缺损尿道是否存在着长度问题，作者未查到确切的证实性资料。
目的：实验拟进一步观察丝素蛋白膜修复不同长度尿道缺损的效果。
设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验，于2007-06/08在南方医科大学附属南方医院动物实验室完成。
材料：成年雄性比格犬14只，按随机数字表法分为3组，1.5 cm尿道缺损组（n=6），3.0 cm尿道缺损组（n =6），对照组(n =2)；丝素蛋白膜由浙江大学闵思佳教授惠赠，孔径150~250μm，孔隙率85％~95％。
方法：1.5 cm尿道缺损组和3.0 cm尿道缺损组：切开犬阴茎皮肤及皮下组织，游离出尿道海绵体，将尿道海绵体分别切除1.5，3.0 cm，再分别用1.5，3.0 cm丝素蛋白支架修复尿道缺损。对照组犬行尿道海绵体游离后即逐层缝合海绵体包膜、皮下组织及皮肤。
主要观察指标：术后6，12周逆行尿道造影，免疫组织化学染色观察尿道组织再生情况。
结果：1.5 cm尿道缺损组6只动物未见尿瘘及明显尿道狭窄梗阻，术后6周时修复区稍粗糙、不光滑，术后12周与对照组无明显差异；3.0 cm尿道缺损组6只动物均出现尿瘘或修复区管腔狭小、部分充盈缺损，术后6周和12周无明显差异。免疫组织化学染色证实1.5 cm尿道缺损组修复区腔面为尿道移行细胞覆盖；3.0 cm尿道缺损组修复区尿道外观呈苍白、致密坚硬且管腔狭小，免疫组织化学染色证实修复区腔面无尿道移行细胞覆盖。
结论：单纯丝素蛋白膜能修复1.5 cm短距离尿道缺损，对3.0 cm以上长距离缺损的修复效果不理想。
关键词：丝素蛋白膜；尿道；组织工程；生物材料

刘春晓，陈伟豪,郑少波，李虎林.丝素蛋白膜对犬不同长度尿道缺损的修复效果[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3613-3616 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3613(ps).pdf]

中图分类号: R318.08
文献标识码: B
文章编号: 1673-8225
(2008)19-03613-04

BACKGROUND:Natural silk fibroin film may be a good way to repair urethral defect, but the confirmation of the repair effect requires the length difference is absent.
OBJECTIVE: To estimate the effect of different lengths of urethral defect repaired with silk fibroin film.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was carried out at the Animal Laboratory in Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, China) between June and August in 2007.
MATERIALS: Fourteen adult male dogs were randomly divided into three groups, experimental group of 1.5-cm defect (n =6), experimental group of 3.0-cm defect (n =6) and control group (n =2). Silk fibroin film was presented by Professor Min Si-jia from Zhejiang University (China), with the pore size of 150-250 μm and the porosity of 85%-95%.
METHODS: In two experimental groups, dog penis skin and subcutaneous tissue were excised to free cavernous body of urethra, and then two segmental defects of 1.5 cm and 3.0 cm were induced in the urethra of each dog. The defects were repaired with silk fibroin film with the corresponding lengths. Control group of two dogs underwent a sham operation.
MAIN OUTCOME MEASURES: Immunohistochemistry was used to observe the regeneration of urethra at weeks 6 and 12 after operation.
RESULTS: No fistulae were found among six animals in the experimental group of 1.5-cm defects, and serial urethrograms confirmed the maintenance of a wide urethral caliber without any signs of strictures. At week 12 postoperatively, there were no significant differences compared to the control group; fistula or strictures were observed in the 3-cm repair section of the experimental group. Silk fibroin film degraded completely at week 12, and the defect was repaired by mucous membrane of urethra and smooth muscle cells regularly in the 1.5-cm section. The cells were confirmed to be urethral epithelial cells analyzed with immunohistochemistry. Pale, dense and rigid appearance of the urethra was found in the 3-cm repair section, with the narrow cavity.
CONCLUSION: Silk fibroin film can repair a short-length defect within 1.5 cm, while it is unpredictable to repair defect longer than 3.0 cm only by the materials.

Liu CX, Chen WH, Zheng SB, Li HL.Different lengths of dog urethral defects repaired with silk fibroin film.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3613-3616(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3613(ps).pdf]

尿道先天畸形及各种原因引起的尿道狭窄缺损是泌尿外科常见病，由于尿道黏膜组织有限，给尿道的修复带来了相当的困难。目前临床上常采用自体非尿道组织(如皮肤、颊黏膜、膀胱黏膜、睾丸鞘膜和腹膜等组织)[1]修复，并取得较好的临床效果，但仍存在感染、尿瘘、毛发生长、再狭窄、结石形成、憩室产生等并发症，常需反复治疗。这种以“牺牲健康组织去修复病损组织的治疗方式已受到严峻挑战”[2]。
组织工程方法是尿道缺损修复的一个方向，并取得了突破性进展，Italiano 等[3]用一种由透明质酸合成的可降解的支架材料来修复兔尿道，7个月后尿道放射学检查见移植物消失，尿道重建，再生组织在一定压力下具有良好的伸展性，组织学观察见再生尿道组织中有过度的上皮细胞形成，并有丰富的弹性纤维。Sievert等[4]用同种异体脱细胞尿道基质修复兔长达1 cm左右的缺损，术后10 d，上皮细胞从宿主迁移至基质支架，术后3 周基质支架的尿道管腔完全由上皮细胞覆盖，3个月时可见平滑肌细胞束长入到基质，6个月时平滑肌细胞束覆盖了1/3的基质支架，尿道动力学示实验组及对照组无差别，8个月时行尿道造影未能辨别宿主及移植物，他们认为该材料可用于一期尿道重建。傅强等[5]利用脱细胞膀胱黏膜下筋膜修复分别修复兔的尿道1 cm左右及2.0~3.0 cm缺损，其中1 cm缺损修复效果良好，他们也认为单纯用细胞外膀胱黏膜下筋膜无法修复2.0~3.0 cm以上缺损。寻找理想的尿道材料一直是医学界的研究热点之一。
蚕丝作为一种天然的高分子材料近年来受到人们的广泛重视。蚕丝主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成，其中丝素蛋白约占75%，其无毒性、无抗原刺激作用，具有良好的生物相容性及可降解性，对机体细胞黏附能力强，能促进细胞的生长[6-7]。刘春晓等[8]用丝素蛋白膜修复兔尿道1.5 cm缺损取得良好的效果。

设计：随机分组设计，动物对照实验。
时间及地点：实验于2007-08/12在南方医科大学附属南方医院动物实验室完成。
材料：选择成年雄性比格犬14只，体质量10.0~ 12.9 kg，由广东肇庆市实验动物科技研究中心提供（实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2007-0081）；丝素蛋白膜由浙江大学闵思佳教授惠赠，孔径150~250 μm，孔隙率85%~95%。
实验方法：14只成年比格犬按随机数字表法分成3组：1.5 cm尿道缺损组（n=6），3.0 cm尿道缺损组（n=6），对照组（n =2）。麻醉方式：应用3％戊巴比妥溶液麻醉，剂量为0.5~1.0 mL/kg，后退静脉注射麻醉。手术方式：①1.5 cm尿道缺损组和3.0 cm尿道缺损组：切开犬阴茎皮肤及皮下组织，游离出尿道海绵体，将尿道海绵体分别切除1.5，3.0 cm，再分别用1.5，3.0 cm丝素蛋白支架修复尿道缺损，分别选取3，9及12点。以5-0肠线缝合两端两吻合口，再以5-0丝线作为标记，再逐层缝合海绵体包膜、皮下组织及皮肤，术后留置8F导尿管，2周后拔除。②对照组：行尿道海绵体游离后即逐层缝合海绵体包膜、皮下组织及皮肤，术后留置8F导尿管，2周后拔除。
主要观察指标：1.5 cm尿道缺损组、3.0 cm尿道缺损组于术后6，12周每次取3只，对照组术后6，12周每次取1只，行逆行尿道造影，然后取材行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色观察组织再生情况。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第二作者，评估为全部作者，评估者经过正规培训。

2.1 实验动物数量分析 14只犬实验过程中无一例死亡。
2.2 逆行尿道造影结果 1.5 cm尿道缺损组6只动物未见尿瘘及明显尿道狭窄梗阻；术后6周时修复区稍粗糙、不光滑，术后12周与对照组无明显差异；3.0 cm尿道缺损组6只动物均出现尿瘘或修复区管腔狭小、部分充盈缺损，术后6周和12周无明显差异。
2.3 组织学检查犬尿道组织苏木精-伊红染色结果。

对照组：
术后6，12周，尿道组织结构无明显区别，尿道上皮细胞均匀覆盖，层数约四五层，排列规则，未见炎性细胞，黏膜下可见较多的平滑肌细胞，无纤维化形成。

1.5 cm尿道缺损组：
术后6周，1.5 cm修复区可见尿道上皮细胞排列不均匀，层数8~10层，可见大量的成纤维细胞，偶可见零星平滑肌细胞及口径较小的血管组织，见图1a。
术后12周，1.5 cm修复区尿道上皮细胞排列均匀，完全覆盖，层数约四五层，平滑肌细胞明显增多，胶原纤维排列规则，无明显炎性细胞浸润，可见较多管径粗大的血管，见图1b。与对照组比较无明显差异。

3.0 cm尿道缺损组：
术后6周，3.0 cm修复区黏膜下层存在较多紊乱的平滑肌肌束，肌束粗大，表面为单一上皮细胞覆盖，表面凹凸不平，见图1c。
术后12周，3.0 cm修复区未见上皮细胞，见图1d，与术后6周比较无明显异常。

2.4 免疫组织化学检查术后12周，1.5 cm尿道缺损组修复区尿道上皮细胞呈阳性棕黄色，排列规则，尿道黏膜细胞胞浆呈棕黄色，高倍镜观察可见胞浆内棕黄色网状角蛋白颗粒，见图2a；3.0 cm尿道缺损组修复区未见明显上皮细胞生长，见图2b。

丝素蛋白在生物医学领域得到广泛的应用，以其为原料制成的手术缝合线用于医疗领域已有20余年的历史，效果良好；也有报道用丝素蛋白开发皮肤创面保护膜、人工皮肤、人工血管等；其作为组织工程支架材料具有更巨大潜力，其中在软骨、骨、韧带、肌腱、人工皮肤方面研究取得重要的成就。丝素蛋白制成的网状组织作为软骨细胞的生长支架，发现丝素蛋白对软骨细胞具有良好的吸附作用及生物相容性，并能维持软骨细胞正常形态和功能[9-10]。丝素蛋白尚能诱导内皮细胞的生长、分化及血管化形成[11]，促进肝细胞的黏附[12]。
本实验应用丝素蛋白膜修复尿道缺损，实验组有4只犬（2/3）出现尿道狭窄。1.5 cm修复区逐渐由尿道黏膜细胞及平滑肌细胞修复，未见纤维化形成，术后12周时丝素蛋白膜完全降解，黏膜细胞及平滑肌细胞排列有序，与对照组无明显差异；角蛋白是上皮细胞特异性的表达蛋白，实验组尿道组织切片应用广谱细胞角蛋白单克隆抗体染色见尿道黏膜细胞胞浆呈棕黄色，高倍镜观察可见胞浆内棕黄色网状角蛋白颗粒，证实为正常的尿
道上皮细胞；3.0 cm修复区腔壁纤维化形成，可见大量的纤维组织及成纤维细胞，大部分区域上皮细胞缺失，排列紊乱，未见尿道上皮细胞及平滑肌细胞。实验结果表明，丝素蛋白膜能够诱导尿道黏膜上皮细胞及尿道平滑肌的生长，具有促进尿道缺损修复的能力，能够修复1.5 cm的尿道缺损，但单纯用丝素蛋白膜修复较长尿道缺损（如3.0 cm），和很多学者的观点一致，效果欠理想。所以寻找更为理想的修复材料或者给予适当的修饰加工（如种植细胞在材料上）是未来泌尿外科组织工程的方向。

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