在琼脂糖表面无支架条件下构建组织工程软骨★

王金良，赵建宁，郭亭，岳鹏举，何劼，何志伟

课题背景：关节软骨缺损的修复是南京军区骨科研究所全军“十一五”资助项目，目前进行了系列研究，主要围绕支架材料复合不同细胞修复软骨缺损。取得了一定成就，但材料对机体的负面效应限制其在临床的应用，在此情况下，本实验进行了无支架条件下构建组织工程软骨研究。

应用要点: 实验初步在琼脂糖表面构建了组织工程软骨，是无支架条件下构建组织工程软骨的新方法。应用该方法构建的组织工程软骨与三维支架构建组织工程软骨相比，有其自身的优势和研究价值。

相关链接：目前常用的细胞-材料复合物构建组织工程软骨还存在以下问题：①接种细胞时的温度、pH及剪切应力等环境影响。②复合物生长阶段，细胞的形态和表型改变。③凝胶类材料对机械刺激的应力遮蔽效应。④细胞材料复合物在体内的降解产物安全性等。

南方医科大学南京临床学院，解放军南京军区总医院骨科，江苏省南京市 210002

王金良★，男，1981年生，河南省南阳市人，汉族，南方医科大学在读硕士，从事关节外科研究
Wjlny319@tom. com

摘要
背景：实验表明，软骨细胞在体外培养时，经常发生表型的丢失。但形成软骨细胞团块时可以维持软骨细胞表型，由此人们探讨无支架结构培养组织工程软骨的技术。
目的：拟建立软骨细胞聚集培养体系，观察在琼脂糖表面培养软骨细胞，无支架条件下构建组织工程软骨的特点。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2006-10/2007-04在解放军南京军区总医院骨科研究所完成。
材料：SPF级新西兰白兔4只，2周龄，雌雄不限。
方法：分离、提取兔关节软骨原代软骨细胞，将低熔点琼脂糖铺于24孔培养板表面，按每孔2.5×105接种提取的兔原代软骨细胞，在培养箱内培养，定期换液。
主要观察指标：取10 d标本行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。
结果：10 d时，软骨细胞自聚集形成有一定形状、大小的类软骨组织，苏木精-伊红染色可见软骨陷窝结构，甲苯胺蓝染色见紫红色异染，说明有蛋白聚糖的分泌。钙染色未见钙化，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色有棕黄色颗粒，说明有Ⅱ型胶原分泌。
结论：在琼脂糖表面构建组织工程软骨的培养体系，琼脂糖膜阻止软骨细胞的黏附和伸展，从而保持软骨细胞的圆形形态；软骨细胞在琼脂糖表面直接接触，加强了细胞之间的信息交流，有利于维持细胞的表型，维持软骨细胞分泌细胞外基质的特征。
关键词：无支架；组织工程软骨；琼脂糖；免疫组织化学；组织构建

王金良，赵建宁，郭亭，岳鹏举，何劼，何志伟.在琼脂糖表面无支架条件下构建组织工程软骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3625-3628 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3625(ps).pdf]

中图分类号: R318
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)19-03625-04

Constructing tissue engineering cartilage on the agarose surface without scaffolds

Abstract
BACKGROUND: Studies demonstrate that, the phenotype loss frequently occurs during chondrocytes are cultured in vitro. However, chondrocyte aggregation can maintain the phenotype of chondrocytes, thus exploring the techniques of culturing tissue engineering cartilages without scaffold.
OBJECTIVE: To establish the chondrocyte aggregation culture system, to observe the culture of chondrocytes on the agarose surface, and to explore a new method to construct tissue engineering cartilage without scaffold.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was carried out in the Orthopaedics Institute, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA between October 2006 and April 2007.
MATERIALS: Four New Zealand rabbits were adopted, SPF grade, two months old, irrespective of genders.
METHODS: Primary chondrocytes were isolated from rabbit articular cartilages, and then the low melting-point agarose spread the surface of 24-well culture plate, and 2.5×105 chondrocytes were introduced to each well. Chondrocytes were cultivated in incubator, and medium was changed regularly.
MAIN OUTCOME MEASURES: The examples were detected with histology and collagen type Ⅱ immunohistochemistry at day 10.
RESULTS: Chondrocytes formed cartilage-like tissues with proper shape and size at day 10. Hematoxylin-eosin staining appeared cartilage lacuna, and toluidine blue staining showed metachromatic prunosus reaction, which indicated the secretion of proteoglycans. Calcium staining presented no calcification, and collagen type Ⅱ immunohistochemistry was stained as yellow, which indicated the secretion of collagen type Ⅱ.
CONCLUSION: During the construction of tissue engineering cartilage on the agarose surface without scaffold, the agarose membrane may prevent the attachment and extension of chondrocytes, thus sustaining the round shape of chondrocytes; the direct contact of chondrocytes on the agarose surface leads to enhance the communication between cells, and benefit for the phenotype stabilization; the chondrocytes also keep their secretion function of extracellular matrix.

Wang JL, Zhao JN, Guo T, Yue PJ, He J, He ZW.Constructing tissue engineering cartilage on the agarose surface without scaffolds.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3625-3628(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3625(ps).pdf]

关节软骨是覆盖在骨端的透明软骨，有抵抗磨损、分散应力等作用，它自身没有血管和淋巴管，靠关节液营养自身。由于疾病或者损伤后很难自我修复[1]，严重时甚至影响关节的功能。组织工程的出现为软骨的修复带来希望，而细胞-材料复合物构建的组织工程软骨由于诸多的缺点而限制着它的继续发展和应用[2]。本实验探讨在无支架条件下构建组织工程软骨，以满足软骨缺损修复的需要。

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2006-10/2007-04在解放军南京军区总医院骨科研究所完成。
材料：SPF级新西兰白兔4只，2周龄，雌雄不限（由解放军南京军区总医院实验动物中心提供）。
技术路线：
软骨细胞的分离培养:取约两周龄新西兰大白兔的双侧膝关节软骨，严格无菌条件下削取表面软骨层,用眼科剪剪切成1 mm ×1 mm ×1 mm大小的碎块。磷酸盐缓冲液冲洗3遍。用质量分数为2.5 g/L的胰蛋白酶(Hyclone公司)37 ℃ 消化30 min，磷酸盐缓冲液冲洗2次，再用质量分数为2g/L Ⅱ型胶原酶(Gilbco公司)37 ℃ 消化6~8 h，取上清液，150目筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清，管底细胞以磷酸盐缓冲液悬浮，离心洗涤3次，去除残余胶原酶，加入DMEM（由南京大学生命科学院提供）培养基，计数细胞，经锥虫蓝染色，活力在98％以上。以每孔2.5×105细胞种植于24孔板中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度条件下进行培养。每天换液，每次1/3量。培养3 d、10 d后取标本进行各项指标的检测。
铺板：取低熔点琼脂糖，蒸馏水配制成2%浓度,水浴加热溶解，加入24孔板中,每空加入300 μL,超净台内自然风干备用。
指标检测：①大体观察及组织学检测：取培养3 d标本行大体和苏木精-伊红染色观察。取培养10 d标本，首先进行大体观察，然后用40 g/L中性甲醛固定液固定，经脱水、石蜡包埋，切成5 μm厚切片，分别行苏木精-伊红染色、钙染色、甲苯胺蓝染色。②免疫组织化学检测：应用II型胶原单克隆抗体行免疫组织化学检测，一抗（Calbiochem）为鼠抗人‖型胶原单克隆抗体（工作浓度1∶100）。二抗为：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多克隆抗体（博士德公司），采用3-3-二氨基联苯胺显色。
主要观察指标：①软骨细胞大体及显微镜下观察。②软骨细胞组织学观察。③软骨细胞免疫组织化学观察。
设计、实施、评估者：设计为第一、四、五、六作者，实施为第一作者，评估为第二、三作者，均受过专业培训。

2.1 软骨细胞大体及显微镜下观察软骨细胞在琼脂糖表面不贴壁、不伸展，呈圆形形态，并逐渐向培养板中心聚集。24 h即形成肉眼可见细胞团，呈圆饼状，体积较大，结构疏松，其后该组织结构收缩。3 d时形成外表似软骨的细胞团块，直径约3 mm，以后团块逐渐增大，10 d形成直径约6 mm大小的组织团块，见图1，外观透明，类似软骨组织。

2.2 软骨细胞组织学观察培养3 d时，苏木精-伊红染色，可观察到软骨细胞呈圆形，周围有基质包绕，观察到陷窝结构，同时细胞之间有空隙，形成空泡结构，见图2；10 d时，苏木精-伊红染色，软骨细胞分布密集，圆形细胞增多，可见多核细胞，陷窝结构增多，细胞之间空泡减少并变小，见图3；甲苯胺蓝可见软骨陷窝清楚，基质蓝染，并有紫红色异染，表明细胞功能良好，分泌蛋白聚糖，见图4；钙染色未见蓝色结节，见图5。

2.3 软骨细胞免疫组织化学观察 10 d标本Ⅱ型胶原免疫组织化学，胞浆和细胞外有棕黄色颗粒，见图6；表明软骨细胞有分泌Ⅱ型胶原的能力。

实验观察到软骨细胞在高密度单层培养时，随着时间增长，软骨细胞持续分泌基质，不断增厚[3]，同时软骨细胞团块可以维持软骨细胞表型[4]，由此人们探讨无支架构建组织工程软骨技术。常用的离心管内无支架构建组织工程软骨技术首先是由日本学者建立[5],他将肋骨骺板软骨细胞在离心管内离心,形成软骨细胞团培养,形成软骨样组织, 随后中国学者颜炜群[6]、杨志明等[7]对此进行了研究。杨志明等将构建的组织工程软骨用于生长板软骨缺损的修复，可以有效防止4周内生长板缺损并发早期肢体畸形[8]。近来国外学者除了继续用离心管内构建组织工程软骨之外，还在旋转系统中培养软骨细胞，细胞聚集形成组织工程软骨[9]。Kandell[10]将构建的组织物植入兔模型，植入物未能成活，Mainil-Varlet[11]将在生物反应器中无支架构建的组织工程软骨修复全层缺损，基本得到修复。
本实验探讨无支架条件下构建组织工程软骨的新方法，在琼脂糖表面培养软骨细胞，细胞经历自我聚集过程形成组织团块，外观、组织学和组织化学与正常软骨组织相似。软骨细胞在体外培养时常发生表型的丢失，而Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是软骨细胞较为特异的标志。本试验中10 d时，行免疫组织化学检测，有棕黄色颗粒，说明Ⅱ型胶原的分泌；甲苯胺蓝染色有强烈的异染反应，说明蛋白聚糖的分泌。同时行组织学检测，见软骨细胞周围有基质环绕，软骨细胞位于陷窝内，这于正常的软骨结构相似。
该组织工程软骨的形成机制可能如下：软骨细胞的圆形形态对维持细胞的表型是必要的，本实验方法中软骨细胞的聚集培养过程中，琼脂糖膜阻止软骨细胞的黏附和伸展，从而保持软骨细胞的圆形形态。软骨细胞在琼脂糖表面与其直接接触的只有软骨细胞，这有利于加强细胞之间的信息交流，对维持细胞的表型是必要的。细胞维持其功能分泌细胞外基质，基质在细胞周围沉积形成网架结构为细胞的生长提供了三维空间，同时细胞有自分泌功能，分泌生长因子[12],在聚集培养过程中，局部细胞因子的浓度得到提高，有利于细胞表型的维持[13,14] 。
目前常用的细胞-材料复合物构建组织工程软骨并用于软骨缺损的修复存在如下的问题：首先在接种细胞时，可能暴露于毒性的化学物质、改变的温度、pH及剪切应力等环境下[15]，其次在复合物生长阶段，有些材料会引起细胞的形态的改变或者表型的丧失[16]；凝胶类材料将细胞锚定于一个位置，组织细胞间的交流并对机械刺激起到应力遮蔽的效应；最后，细胞材料复合物在体内的降解产物安全性及其他细胞掺入其间。而在无支架条件下构建组织工程软骨用于软骨缺损的修复将使上述的问题得到解决。
除此之外，构建的组织团块可以用于检测细胞因子及机械刺激等对软骨细胞生长的影响，此时组织团块作为一个独立的处理单元，使研究结果更接近于体内软骨组织，研究更有意义。有学者用添加转化生长因子β的培养液沉淀聚集培养人软骨细胞，可以维持软骨细胞表型的稳定[17]；Elder等[18]研究对软骨细胞团块施加流动的静水压力的影响，发现蛋白聚糖的分泌明显增加。同时这一培养技术也是研究软骨发生、生长代谢和软骨疾病的良好体外模型[19-20]。
本试验结果初步验证了在琼脂糖表面构建组织工程软骨，是无支架条件下构建组织工程软骨的新方法。应用该方法构建的组织工程软骨于三维支架构建组织工程软骨相比，有其自身的优势和研究价值。

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