胶原生物衍生骨材料植入桡骨临界骨缺损的成骨能力☆

梁军，辛景义，曹红彬

课题背景：骨缺损的广泛存在使骨组织工程的研究成迫切需要，Ⅰ型胶原可作为植骨材料单独应用，但是存在较多的缺陷。因此，胶原基复合材料的研究一直是骨组织工程研究的热点，复合材料用于骨移植已成为目前植骨材料的研究方向。

应用要点：①实验以新鲜人（捐献骨）为支架，应用Ⅰ型胶原的优良特性，对生物衍生骨进行表面修饰，获得的复合材料具有良好的表面相容性，以及天然网状孔隙和三维结构，应用其修复临界骨缺损取得了较好的效果。。②实验结果提示，胶原生物衍生骨复合材料植入兔桡骨临界骨缺损后，未见明显免疫反应，X射线、组织学均表明其具有促进骨组织再生的效果。

偏倚或不足：本实验在胶原与生物衍生骨材料复合方法方面还有待进一步探讨；另外，复合材料在大型动物骨缺损修复的效果有待研究。

梁军☆，男，1966年生，吉林省白山市人，汉族，2005年四川大学毕业，博士，副主任医师，主要从事骨与关节损伤的研究。
liangjun9696@ yahoo.com.cn

摘要
背景：各种基质材料单独应用时成骨能力有限，为增强材料的成骨能力，应用复合材料修复骨缺损是组织工程的发展方向。
目的：探讨胶原生物衍生骨复合材料植入动物体内的成骨能力。
设计、时间及地点：随机分组动物对照实验，于2004-01/04在四川大学华西医学中心组织工程实验室完成。
材料：新西兰大白兔16只，制备兔桡骨中段1.5 cm骨缺损模型。患者自愿捐献手术截除人体骨，Ⅰ型胶原为美国Sigma公司产品。
方法：按随机数字表法将模型兔分为2组，实验组和对照组，每组8只。手术截除人体骨经脱脂、脱细胞和脱蛋白后制备为单纯生物衍生骨支架。胶原真空吸附在单纯生物衍生骨支架内外制备胶原生物衍生骨材料。实验组兔桡骨缺损部位植入胶原生物衍生骨，对照组植入单纯生物衍生骨。
主要观察指标：术后6，12周X射线观察和组织学检测缺损部位的成骨情况。
结果：模型兔16只均进入结果分析。①X射线结果显示，术后12周实验组整个缺损区均可见到骨痂生成，成骨现象较术后6周更加明显，已明显形成骨缺损区的桥接。对照组仍仅在缺损两端有骨痂生成，缺损区中央部分无明显骨生成影像。②组织学结果表明，术后6周实验组在材料内部孔隙区可见到新生的类骨质形成，对照组缺损区没有骨组织形成，在支架材料的孔隙内有大量的纤维结缔组织充填；术后12周实验组可见大量的编织骨样组织，形成小梁样结构，对照组缺损区可见有骨样组织形成。
结论：单纯生物衍生骨与胶原生物衍生骨材料均可促进骨再生，但胶原生物衍生骨材料成骨效果更好。
关键词：胶原；骨缺损；组织工程；生物材料

梁军，辛景义，曹红彬.胶原生物衍生骨材料植入桡骨临界骨缺损的成骨能力[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3629-3632 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3629(ps).pdf]

Osteogenesis of collagen loaded bio-derived bone in repair of radial critical defect

Abstract
BACKGROUND: Each matrix material alone possesses the limited ability of osteogenesis, so it is a future direction of tissue engineering that apply composite materials on the repair of bone defect by enhancing osteogenesis.
OBJECTIVE: To study the osteogenesis ability of collagen loaded bio-derived bone implanted in animals.
DESIGN, TIME AND SETTING: A random controlled animal experiment was completed in Tissue Engineering Laboratory of West China Center of Medical Sciences, Sichuan University between January and April in 2004.
MATERIALS: Sixteen New Zealand white rabbits were adopted to prepare 1.5-cm segmental defect model at the middle part of radius. Human bone was extirpated from donators, and collagen Ⅰ was the product of Sigma Company.
METHODS: Rabbit models were divided into 2 groups by randomization, experimental group and control group, with 8 rabbits in each group. The extirpated bone was made into pure bio-derived bone by means of defatting, decellularization and deproteinization. Collagen loaded bio-derived bone was established by the vacuum absorption of collagen on pure bio-derived bone. Collagen loaded bio-derived bone was implanted into the defects of experimental group, while pure bio-derived bone for the control group.
MAIN OUTCOME MEASURES: At 6 and 12 weeks after operation, all specimens were examined by X-ray and histological methods.
RESULTS: The result analysis included all of 16 rabbit models. X-ray results showed that, osteotylus was seen in the whole defect area of experimental group at 12 weeks postoperatively, at this time osteogenesis was more obvious compared with 6 weeks, the bridge grafting of defect area was obviously visible. In the control group, osteotylus was only observed on two ends of the defects, no osteogenesis was found in the central part of defect area. Histological results showed that, new osteoid formation could be seen in internal porous zone of the experimental group at 6 weeks postoperatively, while in control group fibrous connective tissue filled internal porous zone and no new bone formed; at 12 weeks, much more woven bone-like tissues were visible and trabecular-like structure had formed in the experimental group, while osteoid tissue could be seen in bone defect area of control group.
CONCLUSION: Both pure bio-derived bone and collagen bio-derived bone can enhance osteanagenesis, but collagen loaded bio-derived bone scaffold material is more effective.

Liang J, Xin JY, Cao HB.Osteogenesis of collagen loaded bio-derived bone in repair of radial critical defect.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3629-3632
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3629(ps).pdf]

组织工程学是应用生物学和工程学原理研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门科学。支架材料的研究是骨组织工程研究的核心，骨组织工程支架材料植入到动物体内骨缺损处，形成具有新的骨组织。

设计：随机分组设计、对照动物实验。
时间及地点：实验于2004-01/04在四川大学华西医学中心组织工程实验室完成。
材料：选择清洁级新西兰大白兔16只，雌雄不拘，体质量2.5~3.0 kg，由四川大学动物中心提供。
实验用材料：手术截除人体骨（患者自愿捐献，并对实验知情同意），Ⅰ型胶原（美国Sigma公司）。仪器：深低温冰箱（日本SANYO公司），真空低温冷冻干燥机(德国Heto公司)。
单纯生物衍生骨支架材料的制备：取手术截除人体骨，剔除周围软组织、骨膜和关节软骨，保留一侧皮质，制成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm骨条，生理盐水反复冲洗，去除骨髓和残血，经过系列脱脂、脱细胞和脱蛋白过程，-80 ℃深低温冰箱预冻，最后经真空低温冷冻干燥机冻干备用。
胶原生物衍生骨材料的制备：配制2.5 g/LⅠ型胶原溶液，将冻干的生物衍生骨浸入溶液中，真空吸附使胶原充分涂于材料的内外，将复合材料取出，用蒸馏水冲洗，-80 ℃深低温冰箱预冻，经真空冷冻干燥机抽干备用，环氧乙烷灭菌备用。
动物模型制备：新西兰大白兔16只，按随机数字表法分为2组，实验组和对照组，每组8只。体积分数为0.1的水合氯醛腹腔内麻醉，双前肢消毒，铺无菌巾。取兔桡骨中段切口，切开皮肤，从肌间隙进入，切取桡骨中段包括骨膜1.5 cm，实验组将胶原生物衍生骨材料植入骨缺损处，对照组植入单纯生物衍生骨支架材料，术中不予固定，逐层缝合。术后未予外固定，兔自由活动。
主要观察指标：①大体标本观察：术后6，12周动物麻醉后处死，取材。取动物前肢并去除周围软组织，观察植入材料与宿主的连接情况。②放射学检查：术后 6，12周取动物前肢拍片，观察缺损部位成骨情况。③组织学检查：术后6，12周取骨缺损部位标本，40 g/L多聚甲醛固定，乙二胺四乙酸脱钙，切片行苏木精－伊红染色。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一作者，评估者经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5进行数据处理，数据以_x±s表示，组间分析应用配对t检验，P < 0.05为差异有显著性。

2.1 实验动物数量分析纳入动物16只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 骨缺损部位大体标本观察

实验组：
术后6周，缺损部位周围有软组织包裹，有骨痂形成，缺损部位完全为类骨样组织充填，有一定强度。
术后12周，缺损部位骨形成更加明显，质地较硬。

对照组：
术后6周，可见缺损部位为纤维结缔组织充填，支架材料大部分已降解，质地较软，两端有少量骨痂生成。
术后12周，缺损部位周围有软组织包裹，有骨痂形成，有一定强度。

骨缺损组织X射线观察结果—
实验组：
术后6周，桡骨缺损区可见明显的骨生成影像，呈云雾状，均匀分布在骨缺损区。
术后12周，整个缺损区均可见到骨痂生成，成骨现象较6周更加明显，已明显形成骨缺损区的桥接。

对照组：
术后6周，仅在缺损两端有少量的云雾状骨痂生成，缺损区中央部分无骨生成影像。
术后12周，对照组仍仅在缺损两端有骨痂生成，缺损区中央部分无明显骨生成影像。

骨缺损区组织学改变—
实验组：
术后6周，在材料内部孔隙区可见到新生的类骨质形成，类骨质内成骨细胞大量存在，细胞肥大，细胞排列紧密，并有骨陷窝形成，血管形成明显。
术后12周，可见大量的编织骨样组织，形成小梁样结构，含有大量的成骨细胞，骨陷窝形成非常明显，骨组织内的胶原含量较6周时有明显增加。

对照组：
术后6周，缺损区没有骨组织形成，在支架材料的孔隙内有大量的纤维结缔组织充填，支架材料已部分降解，有大量新生血管形成，少量炎性细胞浸润。
术后12周，缺损区可见有骨样组织形成，支架材料已绝大部分降解，血管丰富。

组织工程骨支架材料应具有良好组织相容性、生物降解性、三维立体结构及良好的力学性能，还要具有良好的表面活性，有利于种植细胞的黏附和增殖。胶原为骨组织细胞外基质的主要成分，并且具有利于细胞的黏附和增殖，以及改变材料表面的性质的特性[1-3]。Ⅰ型胶原可作为骨黏附分子和骨特异性生长因子的良好载体，其与基质材料复合构建的支架材料具有良好的促进新骨组织形成的能力[4-10]。本实验应用Ⅰ型胶原对单纯生物衍生骨孔隙表面进行修饰，研究证明胶原生物衍生骨材料与成骨细胞具有良好的生物相容性。
大体观察可见单纯生物衍生骨材料与胶原生物衍生骨材料植入到动物体内后，胶原生物衍生骨材料组在术后的各时间点均表现出更加良好的成骨性能。
术后各个时间点X射线检查证实实验组骨缺损区范围内均可见骨痂生成，而对照组仅在植入材料与宿主结合部位可见骨痂，表明胶原修饰后增加了单纯生物衍生骨材料的表面性质，增加了材料的成骨能力。
从组织学观察发现，实验组材料表面和孔隙内均可见骨样组织、编织骨和板层骨形成，而对照组仅在材料与宿主骨的桥接部形成骨样组织和新生骨。对照组术后12周骨缺损愈合明显低于实验组。研究表明胶原的修饰增加了材料的生物相容性，促进了骨缺损愈合的速度[11-12]。
各种基质材料单独应用时成骨能力有限，为增强材料的成骨能力，应用复合材料修复骨缺损是组织工程的发展方向。郭洪刚等[13]为研究证实，胶原膜与同种异体骨复合明显地促进了兔桡骨骨折愈合。Ⅰ型胶原mRNA在不同代次种子细胞内均有表达，并随传代次数增加而逐渐减弱，表明在骨组织工程中需提供Ⅰ型胶原这一细胞外基质成分[14-16]。同种异体生物衍生骨作为天然的生物衍生材料具有良好的骨传导性能，并具有成骨诱导能力[17-19]。国内杨志明等[20]将经组织工程技术构建的组织工程骨修复合并软组织和肋骨缺损的患者获得成功。
结论：本实验构建的胶原生物衍生骨材料，具有天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，研究证明胶原修饰后的单纯生物衍生骨材料植入兔桡骨临界骨缺损后，未见明显免疫反应，表现出良好的生物相容性，是一种理想的组织工程骨材料。

1 Douglas T, Hempel U, Mietrach C, et al. Fibrils of different collagen types containing immobilised proteoglycans (PGs) as coatings: characterisation and influence on osteoblast behaviour.Biomol Eng 2007;24(5):455-458
2 Yl?nen R, Kyr?nlahti T, Sund M, et al. Type XIII collagen strongly affects bone formation in transgenic mice.J Bone Miner Res 2005;20(8):1381-1393
3 Schumann D, Ekaputra AK, Lam CX, et al. Biomaterials/scaffolds. Design of bioactive, multiphasic PCL/collagen type I and type II-PCL-TCP/collagen composite scaffolds for functional tissue engineering of osteochondral repair tissue by using electrospinning and FDM techniques.Methods Mol Med 2007;140:101-124
4 Roehlecke C, Witt M, Kasper M, et al. Synergistic effect of titanium alloy and collagen type I on cell adhesion, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells. Cells Tissues Organs 2001;168(3):178-187
5 Boo JS, Yamada Y, Okazaki Y,et al. Tissue-engineered bone using mesenchymal stem cells and a biodegradable scaffold. J Craniofac Surg 2002;13(2):231-239
6 Kanemaru S. Regenerative medicine in the fields of otolaryngology; head and neck regions. Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho 2006;109(1):1-7
7 Kim CS, Kim JI, Kim J,et al. Ectopic bone formation associated with recombinant human bone morphogenetic proteins-2 using absorbable collagen sponge and beta tricalcium phosphate as carriers.Biomaterials 2005;26(15):2501-2507
8 Pekkarinen T, Lindholm TS, Hietala O,et al. The effect of different mineral frames on ectopic bone formation in mouse hind leg muscles induced by native reindeer bone morphogenetic protein.Arch Orthop Trauma Surg 2005;125(1):10-15
9 Matsuno T, Nakamura T, Kuremoto K, et al. Development of beta-tricalcium phosphate/collagen sponge composite for bone regeneration.Dent Mater J 2006;25(1):138-144
10 Brodie JC, Merry J, Grant MH. The mechanical properties of calcium phospate ceramics modified by collagen coating and populated by osteoblasts.J Mater Sci Mater Med 2006;17(1):43-48
11 Chen DF，Tian W，Xing YG，et al.Zhongguo Jiaoxing Waike Zazhi 2006；14（18）：1410-1412
陈大福，田伟，行勇刚，等.胶原支架增强自固化磷酸钙骨水泥的力学及成骨性能研究[J].中国矫形外科杂志，2006，14（18）：1410-1412
12 Liang J，Xin JY，Lan X，et al.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007；11(26):5070-5073
梁军，辛景义，兰旭，等.胶原-生物衍生骨材料与兔成骨细胞的相容性及其体外附着特点[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(26):5070-5073
13 Guo HG，Gu YW，Zhang ZR.Zhonghua Chuangshang Zazhi 1999；15(1):15-16
郭洪刚，顾云伍，张正饶.胶原膜及同种异体骨引导兔桡骨再生的特点及机制[J].中华创伤杂志，1999,15(1):15-16
14 Roehlecke C, Witt M, Kasper M, et al. Synergistic effect of titanium alloy and collagen type I on cell adhesion, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells.Cells Tissues Organs 2001;168(3):178-187
15 Hao W, Hu YY, Wei YY,et al. Collagen I gel can facilitate homogenous bone formation of adipose-derived stem cells in PLGA-beta-TCP scaffold.Cells Tissues Organs 2008;187(2):89-102
16 von Arx T, Cochran DL, Hermann JS, et al. Lateral ridge augmentation and implant placement: an experimental study evaluating implant osseointegration in different augmentation materials in the canine mandible.Int J Oral Maxillofac Implants 2001;16(3):343-354
17 Kishimoto M, Kanemaru S, Yamashita M, et al. Cranial bone regeneration using a composite scaffold of Beta-tricalcium phosphate, collagen, and autologous bone fragments.Laryngoscope 2006;116(2):212-216
18 Zou C, Weng W, Deng X, et al. Preparation and characterization of porous beta-tricalcium phosphate/collagen composites with an integrated structure.Biomaterials 2005;26(26):5276-5284
19 Yang ZM，Li YB，Qin TW.Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao 2003；25(1):2-6
杨志明，李裕标，秦廷武.含缓释生物活性因子的组织工程骨异位成骨[J].中国医学科学院学报，2003，25(1):2-6
20 Yang ZM，Zhao YF，Xie HQ，et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi 2000；14（6）:365-368
杨志明，赵雍凡，解慧琪，等.组织工程肋骨移植修复胸壁巨大缺损[J].中国修复重建外科杂志, 2000, 14（6）:365-368