四种新型仿生骨组织工程支架材料生物安全性评价*☆

张梅霞1，姚瑶1，李妙1，靳安民2

重要的概念：生物玻璃是一种具有优良生物相容性及生物活性的硅酸盐材料。它能够在植入部位迅速发生一系列表面反应,形成能与骨和软组织良好结合碳酸盐羟基磷灰石。Ⅰ型胶原是天然骨基质的主要有机成分,具有良好的生物相容性和生物降解性。透明质酸是一种结构最简单的糖氨聚糖,它的结构疏松,含水及多孔性,特别适于细胞的迁移及增殖。磷酸丝氨酸作为磷蛋白的重要组成成分,是生物矿化的重要调节剂,也是细胞生物膜结构的重要组成成分，为细胞分化、增殖和再生所必需,可维持和促进多种膜结合蛋白和受体的生物活性。

应用要点：通过冷冻干燥和仿生矿化技术，以改性生物活性玻璃粉体和胶原、透明质酸钠、磷酸丝氨酸等天然生物分子复合制备的生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白4种仿生复合骨组织工程三维支架材料无毒性，无刺激性，生物安全性能良好。

偏倚或不足：由于骨组织工程材料是长期植入体内，在进入临床试验前，有必要对其遗传毒性、致癌性方面进行相关试验，此项研究工作有待进一步完成。

南方医科大学珠江医院，1血液科，2骨科，广东省广州市 510282

张梅霞☆，女，1962年生，山东省牟平市人，汉族，2006年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事干细胞与组织工程学的研究。
meixiaz88@
yahoo.com.cn

通讯作者：靳安民，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学珠江医院骨科，广东省广州市 510282

摘要
背景：制备仿生骨组织工程支架材料材料的原材料生物活性玻璃已被临床广泛应用于软骨、骨组织的修复、替代，已通过生物安全性评价。
目的：利用生物活性玻璃和胶原蛋白、透明质酸、磷酸丝氨酸等天然大分子复合制备4种新型仿生骨组织工程支架材料，观察4种新型仿生骨组织工程支架材料的生物安全性。
设计、时间及地点：随机分组设计、动物对照实验，于2006-03/08在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成。
材料：健康昆明系小鼠60只，健康成年家兔11只。采用冷冻干燥和仿生矿化技术，以改性生物活性玻璃粉体和胶原、透明质酸钠、磷酸丝氨酸等天然生物分子复合制备生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白4种仿生复合骨组织工程三维支架材料。
方法：对4种新型仿生骨组织工程支架材料进行生物安全性试验：全身急性毒性试验观察小鼠中毒症状，按50 mL/kg尾静脉注射4种材料的浸提液。支架材料加入新鲜兔血进行溶血试验，离心后取上清液，测定吸光度值，计算溶血率。兔脊柱两侧皮内注射浸提液观察皮肤刺激反应。
主要观察指标：注入浸提液后24，48，72 h观察小鼠全身急性毒性反应和皮肤刺激反应，测定溶血率。
结果：全身急性毒性试验结果表明，4组小鼠无死亡，无明显毒性表现、体质量下降等不良反应。溶血试验结果表明，4组支架材料的溶血率均＜5%，满足医用生物材料的应用要求。皮内刺激反应试验结果表明，4组均未见任何刺激反应，无红斑、焦痂、水肿等皮肤反应现象。
结论：仿生复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白无毒性，无刺激性，生物安全性能良好。
关键词：仿生；生物活性玻璃；胶原蛋白；透明质酸；磷酸丝氨酸；复合支架；生物安全性；生物材料

张梅霞，姚瑶，李妙，靳安民. 四种新型仿生骨组织工程支架材料生物安全性评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3641-3644 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3641(ps).pdf]

Biological safety of four kinds of new biomimetic composite scaffolds for bone tissue engineering

Abstract
BACKGROUND: Biomimetic composite scaffolds of bone tissue engineering prepared by natural macromolecules, have achieved wide applications on the repair and substitute of cartilage and bone tissues, moreover, the biological safety has also been verified.
OBJECTIVE: To explore the biological safety on the four kinds of new biomimetic composite scaffolds prepared by bioactive glass (BG), collagen (COL), hyaluronic acid (HYA) and phosphoserine (PS).
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control animal experiment was conducted in the Hematology Laboratory of Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China from March to August in 2006.
MATERIALS: Sixty healthy Kunming mice, eleven normal adult rabbits, BG-COL-HYA-PS scaffold, BG-COL-PS scaffold, BG-COL-HYA scaffold and BG-COL scaffold.
METHODS: Biological safety detection of the four kinds of scaffold materials was performed. General toxicity test: The extracts from the materials were injected into mouse vein with the dose of 50 mL/kg. The toxic symptoms of mice were observed. Hemolytic test: The scaffold materials with fresh rabbit blood was applied. Subsequent to the centrifugation and the supernatant liquid extraction, the absorbance value and hemolysis rate were detected. Skin stimulation test: The extracts of materials were injected into the bilateral sides of rabbit spine subcutaneously. The skin reaction was observed.
MAIN OUTCOME MEASURES: General toxicity reaction and skin stimulation reaction were observed within 24, 48 and 72 hours after the injection. Hemolysis rate was also detected.
RESULTS: General toxicity test showed that there were no adverse effects in the mice, such as death, toxicity reaction or decreasing weight. Hemolytic test showed that the hemolysis rates of the four scaffold materials were all less than 5%, indicating that the requirements of biomedical material application could be satisfied. Skin stimulation test showed that no erythema, eschar or edema appeared in 4 groups.
CONCLUSION: The biomimetic BG-COL-HYA-PS, BG-COL-PS, BG-COL-HYA and BG-COL composite scaffolds present no toxicity or skin stimulation, and have good biological safety.

Zhang MX, Yao Y, Li M, Jin AM.Biological safety of four kinds of new biomimetic composite scaffolds for bone tissue engineering.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3641-3644
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3641(ps).pdf]

依据国内《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》规定[1]，植入体内的组织工程材料，必须通过临床前安全评价实验。本文采用冷冻干燥和仿生矿化技术，以改性生物活性玻璃粉体和胶原、透明质酸钠、磷酸丝氨酸等天然生物分子复合制备生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白4种仿生复合骨组织工程三维支架材料[2]，并对其生物安全性进行评价，为其临床应用提供相关实验依据。

设计：随机分组设计、动物对照实验。
时间及地点：实验于2006-03/08在南方医科大学珠江医院血液实验室完成。
材料：①全身急性毒性试验选用SPF级健康昆明系小鼠60只，雌雄不限，体质量30~ 35 g，由南方医科大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK（军）2004B023，2004A063）。60只小鼠按随机数字表法分为6组，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组10只、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸组10只、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸组10只、生物活性玻璃/胶原蛋白组10只、阴性对照组10只、阳性对照组10只。②溶血试验选用雄性健康家兔1只，体质量2.35 kg，由南方医科大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK（军）2004B018）。③皮内刺激反应试验选用健康成年家兔10只，雌雄不限，体质量2.25~2.50 kg，由南方医科大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK（军）2004B018，2004A047）。10只家兔按随机数字表法分为5组，生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸组2只、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸组2只、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸组2只、生物活性玻璃/胶原蛋白组2只、对照组2只。所有实验动物术前1周开始喂饲实验动物中心配制的颗粒饲料和自来水，并在相同条件下饲养。
实验过程：
仿生骨组织工程支架材料的制备：仿生复合支架生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白的制备方法见文后参考文献[2]。试验前用γ射线照射消毒。
材料浸提液的制备：将材料以4 g加 20 mL生理盐水的比例，37 ℃水浴箱72 h，制备标准浸提液，用0.22 μm微孔过滤器过虑除菌，置 4 ℃冰箱保存备用。
全身急性毒性试验：按50 mL/kg浸提液动物尾静脉注射，阴性对照为同批号生理盐水，阳性对照为6.4%苯酚溶液，注射后24，48，72 h称体质量变化，观察一般状态、毒性表现及死亡情况。材料毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。具体判定标准如下。无毒：无任何异常症状；轻度毒性：有呼吸困难或腹部刺激轻度症状，但无运动减少；中度毒性：呼吸困难、腹部刺激症状、运动减少、眼睑下垂、腹泻、体质量降至15~17 g；死亡：注射后死亡。
溶血试验：以电子天平称取灭菌备用的待测材料、阴性材料（聚乙烯）及阳性材料（聚氯乙烯）各 0.5 g，分别加入盛有生理盐水10 mL的1，2，3，4，5号试管中充分振荡，每种材料制备5份。将全部试管放入37 ℃恒温水浴箱中

30 min后取出，再加入新鲜兔血0.2 mL，轻摇，再次放入37 ℃水浴中继续60 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液在分光光度计上测定545 nm处的吸光度值(A)。并按下列公式计算溶血率：溶血率(%)=(样品吸光值－阴性吸光值）/(阳性吸光值-阴性吸光值)×100%。若材料的溶血率< 5%，则说明材料符合医用材料的溶血实验要求；若溶血率> 5%，则预示材料有溶血作用。皮内刺激反应试验：背部脊柱两侧去毛，在每只兔脊柱两侧脱毛区各选择3个点，每点至少间隔2 cm，以1 mL注射器皮内注射0.2 mL浸提液，阴性对照组皮内注射0.2 mL生理盐水，注射后即刻和24，48，72 h各时相点观察记录各注射部位的红斑和水肿状况。将每只兔在每一规定时间内注射每种浸提液后出现的红斑和水肿的原发性刺激记分相加，再除以观察点总数为试验材料原发性刺激记分。将试验材料试剂原发性刺激记分减去试剂对照的记分得出每只兔原发性刺激记分。以各时相点观察记录数据计算原发性刺激指数。皮内刺激反应评分: 0分:无红斑，无水肿;1分:红斑和水肿勉强可见;2分:红斑清晰可见，有明显隆起;3分:重度红斑，隆起约1 mm，轮廓清楚;4分:紫红色红斑并有焦痂形成，隆起> 1 mm，并有扩大。按评分标准对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分，按规定方法确定原发性刺激指数，即每只动物对材料的原发刺激指数为24，48，72 h红斑，水肿的总分除以观察的总数。平均原发刺激指数为所有动物的原发刺激指数的和除以实验动物总数。根据计算结果，0~0.4分为无刺激，0.5~1.9分为轻度刺激，2.0~4.9分为中度刺激，5.0~8.0分为强刺激。
主要观察指标：①全身急性毒性，试验结果。②溶血试验结果。③皮内刺激反应试验结果。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第二、三作者，评估为第一、四作者，均受过专业培训。
统计学分析：由第一作者利用SPSS 13.0软件对实验数据进行重复测量方差分析。

2.1 全身急性毒性试验结果 4组小鼠的全身一般状况良好，未见明显毒性表现，体质量均出现增加现象，72 h观察期内活动如常，饮食饮水均正常，无动物死亡现象(与阴性对照组一致)。不同观察期动物体质量变化情况见表1，阳性对照组第2天死亡3只。
经SPSS 13.0 软件包General Linear Model的Repeated Measures模块重复测量方差分析显示，不同实验组F值=3.227，P < 0.05，不同时间组F值=1 370.771， P < 0.001。4个实验组与阳性对照组之间LSD法两两比较差异均有显著性意义（P均 < 0.05）。说明仿生复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白无急性全身毒性反应。

2.3 皮内刺激反应试验结果各组兔各时相点注射浸提液后出现的红斑和水肿的刺激反应情况与阴性对照部位的生理盐水相似，未见任何刺激反应，无红斑、焦痂、水肿现象，24，48，72 h原发性刺激指数均为0分，结果见表3。说明仿生复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白均无刺激性。

生物材料是指与人体组织接触或取代、修复病变组织的天然或合成材料，与人体组织相容性好[3-7]。任何新材料在应用于临床之前，首先必须按照医疗器械生物学评价ISO10993和GB/T16886标准和要求进行系列生物安全性评价，而体内和体外试验是目前评价材料生物安全性的主要手段[8-13]。本实验选择的急性毒性试验、溶血试验及皮内刺激试验是《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》规定和推荐的评价生物材料生物安全性的主要体内、体外试验方法。另外，本研究用于制备新材料的原材料生物活性玻璃，已被临床广泛应用于软骨、骨组织的修复、替代等，良好的生物安全性已经得到很好的证明，故无需进行生物安全性试验[14]。
全身急性毒性试验是一种非特异性急性毒性试验，将材料的浸提液通过静脉注射到动物内，观察其生物学反应，以判定材料的急性毒性作用[15-16]。本实验采用鼠尾静脉注射途径，将无菌的材料浸提液直接注入血液循环，这是材料与动物体接触的最直接和最快速的一种方式。结果除阳性对照组(苯酚)小鼠出现寒战、体质量明显下降，死亡3只外，仿生型复合支架材料组生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白均未见任何异常，小鼠一般状况良好，体质量明显增加。
溶血试验是一项很有意义的急性毒性筛选实验，能够敏感地反映材料对红细胞膜的影响，主要是评价材料的体外溶血性能[15-16]，在材料筛选初期评价中发挥作用。该试验目的是通过试样在体外与血液直接接触，测定红细胞释放的血红蛋白量以评价材料是否对红细胞的功能和代谢造成不良影响。当材料有溶血活动时，提示材料具有细胞毒性。仿生型复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白体外试验无明显溶血反应，可满足医用生物材料的应用要求[17-23]。
皮内刺激试验也是评价生物安全性必不可少的。本试验结果显示，在观察期内仿生型复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白浸提液原发性刺激指数均为0，表明4种新型复合材料对皮肤无刺激作用。
总之，体内和体外试验结果显示，仿生型复合支架材料生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/磷酸丝氨酸、生物活性玻璃/胶原蛋白/透明质酸、生物活性玻璃/胶原蛋白无毒性，无刺激性，具有良好的生物安全性能，是理想的骨组织工程材料。支架材料长期植入体内后，其遗传毒性、致癌性等还有待进一步研究。

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