藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化☆

雷鸣1，刘世清1，刘宇兰2，彭昊1，汪喆1

实验室介绍：实验在口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。该实验室建筑面积1 800平方米，总资产 2 500万元人民币，拥有一批特色和大型仪器设备,是全国口腔医学院校重要的研究基地之一，主要承担国家和湖北省有关的科研项目，具有完成细胞生物学实验的良好条件。

偏倚或不足：实验未将三维立体诱导分化的软骨细胞与壳聚糖材料结合而形成的组织工程软骨在动物体内进行组织学、生物力学等性能的检测。其次，应检测软骨细胞和壳聚糖复合支架的体外培养的合适期限，以缩短不必要的体外培养时间。

同行评价：作者采用转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I联合定向诱导藻酸钠微球包被的骨髓基质干细胞诱导成软骨。实验结果显示诱导后细胞具有软骨细胞的特征，不会发生去分化等。该方法能较好地解决软骨种子细胞来源问题。课题具有创新性，对软骨组织工程种子细胞研究具有指导意义。

1 武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060；2武汉市第三医院整形外科，湖北省武汉市 430060

雷鸣☆，男，1976年生，湖北省新洲市人，汉族，武汉大学在读博士，主要从事骨关节炎的基础研究。
doc_leiming@
yahoo.com.cn

通讯作者：刘世清，教授，武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060 doc_liusq@yahoo.com.cn

摘要
背景：传统的体外诱导干细胞向软骨细胞定向分化的方法有高密度细胞团块培养和平面培养。细胞团块诱导方式培养过程易损害细胞活性，而平面培养获得的细胞数量有限。
目的：观察藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化潜力，及其在壳聚糖复合支架上的生长情况。
设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。
材料：SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只。壳聚糖复合支架材料由武汉大学资源与环境学院研制。藻酸钠盐、转化生长因子β3、胰岛素样生长因子Ⅰ均为Sigma公司产品。
方法：取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓，体外扩增培养骨髓间充质干细胞。实验组用转化生长因子β3和胰岛素样生长因子Ⅰ联合定向诱导藻酸钠微球包被的骨髓间充质干细胞3周，对照组培养条件中无转化生长因子β3和胰岛素样生长因子Ⅰ。诱导3周后，免疫组织化学方法和反转录-聚合酶链反应法检测Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan的表达。从微球中释放诱导的软骨细胞并接种于壳聚糖复合支架，扫描电镜观察其生长情况。
主要观察指标：软骨特异性的Ⅱ型胶原、aggrecan的表达以及软骨细胞的三维形态。
结果：实验组藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞表达的Ⅱ型胶原和aggrecan明显高于对照组(P < 0.05)，与原代软骨细胞比较差异无显著性意义(P > 0.05)。壳聚糖复合支架支持分化软骨细胞的贴壁、伸展、增殖和迁徙，并呈典型的软骨细胞生长形态。
结论：转化生长因子β3和胰岛素样生长因子Ⅰ能诱导藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞定向分化成软骨细胞，并与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性。
关键词：骨髓间充质干细胞；软骨分化；壳聚糖；组织工程；生物材料

雷鸣，刘世清，刘宇兰，彭昊，汪喆.藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3659-3662 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3659(ps).pdf]

中图分类号: R318
文献标识码: B
文章编号: 1673-8225
(2008)19-03659-04

Abstract
BACKGROUND:Conventionally, the stem cells are induced to differentiate into chondrocytes in vitro by means of high-density cell aggregation culture or plane culture. But the cell aggregation is prone to damage the cell activity, and plane culture is limited in the number of harvesting cells.
OBJECTIVE: To investigate the differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to chondrocytes in alginate microspheres, and observe the growth of chondrocytes on chitosan composite scaffolds.
DESIGN, TIME AND SETTING: An observation study was carried out in the Key Laboratory of Biomedical Engineering of the State Education Bureau, School of Stomatology, Wuhan University (Wuhan, Hubei, China) from March to October in 2007.
MATERIALS: Seven Wistar rats of SPF grade and one month old were used in this study. Chitosan composite scaffolds were provided by College of Resource and Environment in Wuhan University (China). Transforming growth factor (TGF) β3 and insulin-like growth factor (IGF) Ⅰ were the products of Sigma Company (USA).
METHODS: Bone marrow was harvested from rat femur and tibia, and then were amplified to culture MSCs in vitro. MSCs capsulated in alginate microspheres were induced by TGF-β3 and IGF-I, serving as the experiment group. While those cultured without TGF-β3 and IGF-I were taken as controls. Three weeks later, the expressions of collagen type II and Aggrecan were evaluated by immunohistochemistry staining and reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. After the induced chondrocytes were seeded on the chitosan composite scaffolds, their morphology was evaluated by scanning electron microscope.
MAIN OUTCOME MEASURES: The expressions of collagen type II and aggrecan, together with the morphology of chondrocytes were all observed.
RESULTS: The MSCs capsulated in alginate microspheres were induced to express the higher levels of collagen type II and aggrecan by TGF-β3 and IGF-I than those without any growth factor (P < 0.05). No significant differences were found in the experiment group compared to the primarily cultured chondrocytes (P > 0.05). The chitosan composite scaffolds supported the adhesion, proliferation and migration of the induced chondrocytes, which exhibited typical growth of chondrocytes.
CONCLUSION: Combination TGF-β3 with IGF-I can induce the MSCs capsulated in alginate microspheres to differentiate into chondrocytes, and chitosan-based scaffold is biocompatible with the induced chondrocytes.

Lei M, Liu SQ, Liu YL, Peng H, Wang Z.Chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cell in alginate microspheres.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3659-3662
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3659(ps).pdf]

在软骨组织工程中，一个重要的难题是种子细胞的来源问题。为了达到组织工程所需的细胞数量级，软骨细胞通常需要在体外进行单层扩增培养，但长期、多代的培养将会导致细胞发生去分化，失去成熟的表型[1-5]，表现为由分泌Ⅱ型胶原和aggrecan的特征向分泌Ⅰ型胶原的方向转化，这一缺点极大的限制了软骨细胞在软骨组织工程中的应用。骨髓间充质干细胞是骨髓中具有多向分化潜能的成体干细胞。骨髓间充质干细胞不仅具有取材方便，能够在体外大量增殖并且在一定的条件下能定向分化为软骨细胞的优势，同时诱导分化后的细胞在自体使用时不存在免疫排斥反应的特点，展示出该细胞在治疗软骨缺损甚至软骨退性行疾病中具有广阔的临床应用前景[6-8]。
传统的体外诱导干细胞向软骨细胞定向分化的方法包括高密度细胞团块[9-10]，以及在培养板或培养瓶进行二维平面的诱导培养等方式[11]，同时在无血清的培养基中引入特定的诱导干细胞向软骨细胞分化的生长因子，如转化生长因子β1-3, 骨形态发生蛋白2,6,7,9等[8,11-16]。细胞团块诱导方式是模拟胚胎发育时期软骨生成中干细胞高密度聚集而设计诱导培养方法[17]。这种方法的缺点在于当诱导的软骨细胞和其他生物相容性材料相结合时，需要将软骨团块进行酶消化分散细胞，而这在一定程度损害了细胞活性。有文献发现在诱导21 d后，细胞团块外围有纤维样细胞生成，说明该方法诱导软骨细胞分化的不均一性[18]。平面培养中的骨髓间充质干细胞虽然能充分接触诱导性的培养基，但所获得的细胞数量有限，同时缺乏细胞-基质间的相互作用，可能表现为软骨细胞分化不完全。近来，利用藻酸盐微球包被骨髓间充质干细胞进行软骨细胞方向的定向诱导逐渐开展[7-8,12,19-20]。在有二价阳离子的条件下，聚合的藻酸盐能形成对细胞无毒害的透明凝胶，柠檬酸钠溶液能很容易溶解微球并将细胞从中释放出来而不损害细胞活性。骨髓间充质干细胞大量扩增后再将其包被在藻酸钠微球中进行诱导分化模拟了细胞在体内基质中的生活状态，同时诱导的软骨细胞分泌的部分基质被限制在细胞周围，使细胞与基质之间发生相互作用更有利于细胞的分化。在理论上克服了上述方法的缺陷，为干细胞分化提供了另一种模式。为此，本实验在体外利用藻酸钠微球三维立体培养诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化，并与壳聚糖复合支架结合构建组织工程软骨，为组织工程应用更好的应用于临床提供理论依据。

设计：对比观察实验。
时间及地点：实验于2007-03/10在口腔生物医学工程教育部重点实验室完成。
材料：SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只，体质量300 g左右，由湖北省实验动物研究中心提供（动物中心许可证号：SCXK（鄂）2003-0005）。壳聚糖复合支架材料由武汉大学资源与环境学院研制。

实验过程：
壳聚糖复合支架的制备：200 mg壳聚糖(脱乙酰度91%，Mr 2.7×105)溶于0.1 mol/L盐酸10 mL中备用。将含有100 mg磷酸钠的2％甲基纤维素溶液10 mL缓慢滴入壳聚糖酸性溶液中，充分溶解后分装于48孔细胞培养板中，经过4，-20，-70 ℃梯度降温后，真空冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，使用前切成3 mm高度，环氧乙烷消毒后完全培养基过夜以平衡酸碱。
骨髓间充质干细胞的分离和培养：将从1月龄Wistar大鼠股骨和胫骨抽取的骨髓以1∶2的比例与磷酸盐缓冲液混合，300 g离心10 min。去除脂肪层和部分上清后，细胞团重悬后缓慢的加入到Ficoll-Pague分离液(Pharmacia)上层，800 g离心20 min，收集交界处的单核细胞经磷酸盐缓冲液洗涤2次后重悬于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中并以5×104/cm2的密度接种于培养瓶， 3 d后更换培养基去除未贴壁的细胞继续培养，以后每隔2 d换液。大约7 d达90%汇合时，骨髓间充质干细胞以 1∶3的比例传代，直到第5代。
藻酸钠微球包被后的成软骨方向诱导：扩增的骨髓间充质干细胞以3×109 L-1的密度重悬于1.2%藻酸钠盐溶液中，用22号针头将该藻酸钠溶液缓慢滴加在102 mmol/L氯化钙溶液中，10 min后用完全培养基洗涤微球2次，实验组用成软骨诱导条件培养基进行培养3周，除无血清的高糖DMEM培养基外，其余配方如下：10 μg/L 转化生长因子β3, 100 μg/L 胰岛素样生长因子Ⅰ，100 nmol/L 地塞米松，维生素C 50 mg/L，ITS＋1 (10 mg/L胰岛素，5.5 mg/L转铁蛋白，5 μg/L亚硒酸钠，0.5 g/L牛血清白蛋白，4.7 mg/L亚油酸)。对照组除无上述2种生长因子外，余同实验组。
免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达：一抗为分装的Santa Cruz抗体，二抗为中山公司的罗丹明标记的抗体。诱导3周后，含55 mmol/L柠檬酸钠的生理盐水溶解藻酸钠微球释放细胞，接种于盖玻片上，过夜培养，40 g/L多聚甲醛固定10 min后，按中山公司SP通用试剂盒说明书操作。
反转录-聚合酶链反应：Ⅱ型胶原、aggrecan以及GAPDH引物序列如下：

严格按照Trizol (Invitrogen)试剂说明书操作提取总RNA。用ReverTra Ace-α-试剂盒(TOYOBO)将1 μg总RNA反转录为cDNA，体系20 μL。1 μL cDNA使用聚合酶链反应Master Mix (Promega)进行扩增，体系 50 μL。
扩增条件：94 ℃预变性4 min，然后30次循环：94 ℃变性1 min，退火30 s (退火温度：Ⅱ型胶原和aggrecan 56 ℃，GAPDH 65 ℃)，72 ℃延伸45 s。循环结束后72 ℃延伸5 min。聚合酶链反应产物在含溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，GeneSnap凝胶成像分析系统下照相观察并测定各条带，GAPDH为内参照，原代软骨细胞设为阳性对照。
扫描电镜观察：释放后的细胞以2×106/支架的密度接种于上述的支架上，每隔1周用扫描电镜观察细胞在支架上的生长，共3周。
主要观察指标：软骨特异性的Ⅱ型胶原、aggrecan的表达以及软骨细胞的三维形态。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为全部作者，评估为第三、第四作者，评估者经过正规培训。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.0进行数据处理，数据以_x±s表示，行t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 细胞形态观察换液去除悬浮的骨髓造血细胞后，可见大量呈梭形骨髓间充质干细胞贴壁，以后形成多个成纤维样细胞集落，逐渐增多并连接成片。原代细胞一般1周左右可传代，传代细胞4~5 d可再次传代。
2.2 免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达诱导的细胞由梭形或纺锤形变成多角形和多边形，实验组可见软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原强阳性表达，对照组则基本无表达，见图1。

2.3 反转录-聚合酶链反应检测分化Ⅱ型胶原和aggrecan的表达未加任何生长因子的对照组只见微弱的Ⅱ型胶原和aggrecan表达。在转化生长因子β3和胰岛素样生长因子Ⅰ联合诱导下，实验组骨髓间充质干细胞表达的Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA水平明显高于未诱导的对照组(P < 0.05)，与原代软骨细胞比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。
2.4 扫描电镜结果观察

接种前：壳聚糖复合支架材料冻干后成蜂窝状，孔隙直径大小约为100~300 μm，轮廓清晰，表面光滑，见图3a。
接种后7 d：细胞成圆球样贴附于蜂窝孔隙的底部，聚集生长，见图3b。
接种后14 d：细胞逐渐伸展，数量开始增多，见图3c。
接种后21 d：细胞数量明显增多，成片生长，胞体伸展成多角形并伸出足突，为典型的软骨细胞贴壁生长表现，见图3d。

在本实验中，骨髓间充质干细胞在体外扩增培养至第5代能获得大量的细胞数，基本满足软骨组织工程中种子细胞的需要。藻酸钠微球包被的骨髓间充质干细胞在诱导培养基的作用下能定向分化为较为成熟的软骨细胞。随后将诱导的软骨细胞从微球中释放出来接种在壳聚糖复合支架上，用扫描电镜观察可见软骨细胞能很好的在壳聚糖复合支架材料上贴壁、伸展、迁移和增殖，表现出典型的软骨细胞贴壁生长特征。以上结果表明这些方法能在体外成功构建具有软骨特性的工程软骨组织。
综上所述，在体外分离培养的骨髓间充质干细胞形态良好，增生活跃。在藻酸钠微球三维立体培养体系中能定向分化为软骨细胞，诱导后的软骨细胞对壳聚糖复合材料支架黏附力强，生物相容性好，为利用骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的组织工程在下一步动物实验的体内研究甚至于临床应用提供了坚实的理论基础。

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