经硅胶管缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子对失神经骨骼肌的作用★

许蕙，辛畅泰

课题背景：失神经骨骼肌萎缩，影响肢体功能恢复，一直是临床急待解决的一个难题。尤其是周围神经支配的小肌肉，在神经重新支配之前已经发生不可逆性肌萎缩，严重影响肢体的精细活动。延缓不可逆性肌萎缩的发生，是问题存在的关键。

应用要点：实验通过在大鼠腓肠肌内置入装有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管，缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子激活肌卫星细胞，并促使肌卫星细胞增殖。细胞增生状态，有助于判断肌萎缩是否可逆及推测神经修复术的预后。增加失神经支配骨骼肌中的肌卫星细胞的含量，可以提高周围神经手术的疗效。实验对延缓肌萎缩为再生神经到达靶器官争取时间的临床应用有重要的意义。

术语解析：肌卫星细胞是一种潜能细胞，是肌组织的干细胞，能转化为成肌细胞。肌卫星细胞在骨骼肌细胞生长和再生时，可提供肌细胞核。

许蕙★，女，1974年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2005年中国医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事手外科研究。
letibe1120@ yahoo.com.cn

摘要
背景：失神经骨骼肌最大的变化，就是失去神经营养因子，导致肌肉萎缩变性和纤维化。
目的：通过在腓肠肌中置入缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管，观察其对肌卫星细胞增殖和肌萎缩的作用。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-11在沈阳医学院奉天医院动物实验室完成。
材料：体质量为250~300 g的健康雄性Wistar大鼠28只；硅胶管制备：将碱性成纤维细胞生长因子和生理盐水分别装入硅胶管内，管两端用501硅胶封闭。
方法：切断大鼠左肢坐骨神经的腓肠肌28条，随机分2组，每组14条。实验组肌肉内置入装有碱性成纤维细胞生长因子硅胶管，对照组置入装有生理盐水的硅胶管。
主要观察指标：术后30 d进行：①腓肠肌湿重及肌纤颤电位波幅。②光镜观察肌纤维表面的增殖细胞核抗原阳性细胞核、腓肠肌肌纤维直径和肌纤维截面积。③电镜观察腓肠肌超微结构。
结果：①实验组肌肉的肌卫星细胞核数多于对照组（P < 0.01）。②实验组肌肉内的萎缩肌纤维出现变细、横纹不清，肌动蛋白淡染及肌丝排列紊乱和线粒体空泡化等变化较对照组少（P < 0.01）。③实验组肌纤维间结缔组织增生轻于对照组。④实验组肌肉湿重明显重于对照组（P < 0.01），肌纤维纤颤电位波幅明显大于对照组（P < 0.05）。
结论：经硅胶管中缓慢释放的碱性成纤维细胞生长因子有促进失神经腓肠肌的肌卫星细胞增殖﹑延缓肌纤维萎缩和抑制肌纤维向结缔组织增生的作用。
关键词：纤维细胞生长因子2；肌卫星细胞；肌萎缩；大鼠；生物材料

许蕙，辛畅泰.经硅胶管缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子对失神经骨骼肌的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(19):3738-3742 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3738(ps).pdf]

Effect of basic fibroblast growth factor through silicon tube on denervated skeletal muscle

BACKGROUND:The denervated skeletal muscle is chiefly characteristic as the loss of neurotrophic factor, which may cause the muscle atrophy degeneration and fibrosis.
OBJECTIVE: To investigate the effect on the muscle satellite cells and muscle atrophy by the implantation of basic fibroblast growth factor (bFGF) released through silicon tube in the gastrocnemius.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomly control animal experiment was finished at the Animal Experiment Laboratory of Shenyang Medical College Fengtian Hospital in November 2006.
MATERIALS: Twenty-eight Wistar healthy male rats (weighing 250-300 g) were adopted. Silicon tube was prepared by the encapsulation with bFGF or physiological saline, and sealed with 502 glue.
METHODS: The sciatic nerve of left lower limb was cut off, and then gastrocnemius was taken out. All of 28 Wistar rats were divided into experiment group and control group randomly, each group involved 14 rats. The experimental gastrocnemius was encapsulated with silicon tube containing bFGF, while the control group with physiological saline.
MAIN OUTCOME MEASURES: At day 30 postoperatively, the following indicators were evaluated: wet weight of gastrocnemius and wave amplitude of muscle fibrillation potential; proliferating cell nuclear antigen positive nuclei on surface of muscle fibers, diameter and section area of gastrocnemius fiber under light microscope; ultrastructure of gastrocnemius under electron microscope.
RESULTS: The number of muscle satellite cell nuclei in the experimental group was more than that in the control group (P < 0.01). Compared with control group, the thin muscle fiber, unclear transverse striate, light stain of actin, disordered myofilament and mitochondrial vacuolization all emerged less in the experimental group (P < 0.01). In the experimental group, the connective tissue proliferations between fibers were obviously less than that in the control group. Both wet weight of gastrocnemius and wave amplitude of muscle fibrillation potential were obviously greater in the experimental group compared with the control group (P < 0.01, P < 0.05).
CONCLUSION: The bFGF released through silicon tube can stimulate the proliferation of muscle satellite cell, delay the muscle fiber atrophy and inhibit the connective tissues proliferation in denervated gastrocnemius.

Xu H, Xin CT.Effect of basic fibroblast growth factor through silicon tube on denervated skeletal muscle.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(19):3738-3742
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-19/19k-3738(ps).pdf]

失神经骨骼肌萎缩，影响肢体功能恢复，一直是临床急待解决的难题之一[1,2]。国内外学者曾用电刺激，被动运动，药物，感觉神经元置入和组织工程等方法[3,4]，对延缓和防治失神经肌萎缩进行了诸多研究，但迄今无突破性进展。失神经骨骼肌最大的变化，就是失去神经营养因子，导致肌肉结构、生理生化和新陈代谢等方面的改变，神经元与靶器官-骨骼肌存在相互依存的营养关系，两者失去联系，神经元会发生营养障碍或变性，而骨骼肌失去营养会发生退化，萎缩变性和纤维化[5]。由此本实验试图通过在腓肠肌肉置入盛有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管，以验证失神经骨骼肌外源性神经营养因子-碱性成纤维细胞生长因子保持肌肉正常结构和延缓肌萎缩进程的作用。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2006-11在沈阳医学院奉天医院动物实验室完成。
材料：清洁级体质量250~300 g的Wistar大鼠28只，健康雄性(选购于中国医科大学实验动物饲养中心，SCXK(辽)2003-0009)，切断左下肢坐骨神经后，制做失神经支配的动物模型。采用随机数字法将动物分成两组：实验组在腓肠肌肉置入盛有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管，对照组置入盛有生理盐水的硅胶管，每组14只。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）为珠海生物制品有限公司产品；硅胶管为丹麦产品购自沈阳市计划生育研究所。
技术路线：
硅胶管制备：在无菌条件下，将碱性成纤维细胞生长因子（0.1g）和生理盐水分别装入硅胶管内，管两端用501硅胶封闭。
手术方法：10 g/L硫喷妥钠（5 mL/kg）腹腔麻醉，动物俯卧位固定于实验台上，术区常规剃毛﹑消毒、切皮和暴露左下肢坐骨神经，在梨状肌下缘10 mm处横断坐骨神经，两断端分别反折固定于邻近组织，然后再将装有不同试剂硅胶管，分别放入同侧腓肠肌内，术后14 d和30 d进行不同指标观察处理。
电生理指标测试：观察实验组与对照组腓肠肌的纤颤电位波幅变化。
腓肠肌湿重测试：将腓肠肌从股骨内外踝起点至跟骨结节止点完整取下，称量各组肌肉的质量。
组织学切片标本：在左下肢腓肠肌肌腹中央处切成远、近两部分，分别制成标本连续切片，进行苏木精-伊红和Mallory染色，观察各组肌纤维结构萎缩和肌纤维间结缔组织增生情况。
维生素C银染：维生素C被染成黑色颗粒。主要观察两组肌肉内维生素C浓度高低差异，了解肌纤维间结缔组织合成胶原纤维的功能状态情况。
增殖细胞核抗原（ABC）染色：了解两组肌肉细胞增殖状态与肌萎缩变化。
肌动蛋白免疫组织化学染色：按常规ABC染色法，均设有阴性对照，在相同条件下，测量腓肠肌远侧部分肌纤维的肌动蛋白染色的灰度，邻近阴性部位的灰度作为背景灰度，两者的差值表示检测部位的实际灰度。
透射电镜观察：观察腓肠肌超微结构。
图像分析仪测定：术后30 d，取各7只动物增殖细胞核抗原染色横断面切片，用400倍光镜，分别计数每只动物相应一致的3个视野，靠肌纤维表面的增殖细胞核抗原阳性细胞核。术后14 d及30 d，取两组腓肠肌横断面切片，用400倍光学显微镜，测定同一单位面积内肌纤维直径（μm）和肌纤维截面积（μm2）。
主要观察指标：①大体观察两组失神经腓肠肌。②两组腓肠肌湿重及肌纤颤电位波幅。③光镜观察肌纤维表面的增殖细胞核抗原阳性细胞核、腓肠肌肌纤维直径和肌纤维截面积。④电镜观察腓肠肌超微结构。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预实施为第一作者，评估为第二作者。经过正规培训，未采用盲法评估。
统计学方法：数据以_x±s表示，由第一作者采用SPSS统计软件包进行分析，两两比较采用配对t检验，P值< 0.05为有统计学意义。

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠28只，分为2组，实验动物无脱失，进入结果分析28只。
2.2 两组失神经腓肠肌大体观察结果切开皮肤，肉眼可见两组失神经腓肠肌均发生较明显萎缩，尤其术后30 d对照组更为显著，不同程度的均与其周围结缔组织相连粘，两组腓肠肌对比，术后14 d对照组腓肠肌较实验组变小﹑与周围结缔组织粘连也较重，但差异远不如术后30 d显著。
2.3 两组腓肠肌湿重及肌纤颤电位波幅失神经30 d后实验组腓肠肌湿重及肌纤颤电位波幅均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。

2.4 两组肌纤维光镜观察结果实验组与对照组术后不同时间和不同染色切片，均可见：
①实验组在苏木精-伊红染色的腓肠肌内，肌卫星细胞核(紧贴肌纤维表面)明显增多，异染色质分布核膜下，着色淡，圆形细胞核和增殖细胞核抗原免疫组织化学染色呈阳性反应着棕黄色细胞核都明显增多。特别是术后30 d增殖细胞核抗原阳性核尤为明显，见图1，2。

②肌纤维变细﹑横纹不清和圆形变肌纤维等萎缩肌纤维，随术后时间后延而逐渐明显增多。
③肌纤维间着银染呈黑色颗粒的维生素C和Mallory染成蓝色的结缔组织均明显地逐渐增多，见图3，4；神经纤维束均溃变为结缔组织，偶见梭内肌变细的肌梭存在。

实验组具有肌卫星细胞核特点的细胞核和增殖细胞核抗原阳性细胞核，不但数量明显多于对照组，而且持续时间也较长。实验组肌纤维明显较对照组排列更规则，萎缩肌纤维明显少于对照组。实验组肌纤维间维生素C浓度和结缔组织增生均明显较对照组的低和轻。
2.5 腓肠肌超微结构在失神经支配后14 d和30 d两组腓肠肌透射电镜均可见肌丝和线粒体等超微结构改变的肌纤维存在。实验与对照组腓肠肌对比，①对照组肌丝排列紊乱或模糊不清，线粒体嵴溶解，空泡化以及糖原和脂滴减少、细胞核电子密度低、胞质空泡化等萎缩改变的肌纤维明显多于实验组，见图5，6。表明对照组失去功能肌纤维较多。②实验组肌纤维间的胶原纤维明显少于对照组。

3.1 置入盛有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管有促进骨骼肌肌卫星细胞增殖作用骨骼肌损伤和失神经支配后的细胞核增多，并非是高度分化的功能性肌纤维（肌细胞）分裂，而是肌膜与基膜之间低分化肌卫星细胞增殖所致，肌卫星细胞是成体能干细胞，是肌组织干细胞，具有分裂增殖和分化潜能细胞[6]。碱性成纤维细胞生长因子广泛分布于人体组织中, 是人体内含有的一种微量活性蛋白[7]。当细胞受损时可大量释放碱性成纤维细胞生长因子, 它对源于中胚层和神经外胚层的细胞和组织具有促进丝裂、分化和调节作用, 是创伤愈合和上皮形成的重要调节物[8]。外源性碱性成纤维细胞生长因子与内源性碱性成纤维细胞生长因子在体内同样起神经营养因子和中胚层来源细胞的致分裂剂作用。碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层的肌卫星细胞是否有促进分裂增殖作用[9,10]，迄今罕见有这方面研究报道。通过大鼠实验证明由于失神经支配和置入试剂对肌肉损伤的刺激，使两组腓肠肌的肌卫星细胞核均有明显增多。特别是实验组置入加有碱性成纤维细胞生长因子的半通透性硅胶管，碱性成纤维细胞生长因子可以从硅胶管中缓慢释放。具有增殖标志的增殖细胞核抗原阳性反应肌卫星细胞明显较加入生理盐水对照组的多并持续时间也较长[11-12]，表明碱性成纤维细胞生长因子有激活肌组织干细胞，分裂增殖的作用。碱性成纤维细胞生长因子应用还可能增强了内源性生长因子的分泌，从而进一步促进细胞增殖[13]。研究认为激活的肌卫星细胞，可跨越基膜形成并行的肌纤维，参与附近肌细胞增殖，替代损伤和变性肌纤维[14]，故作者提出用碱性成纤维细胞生长因子激活肌组织干细胞分裂增殖，这可能成为延缓和恢复失神经肌萎缩一个研究新思路。
3.2 置入盛有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管有延缓失神经肌萎缩和抑制肌纤维间结缔组织增生作用外周神经损伤后，由于神经元对肌细胞的营养作用中断，导致肌肉萎缩，玻璃样变，运动终板消失。这种病理改变从神经损伤时开始，随着时间推移逐渐加重，而且不可逆转[15]。外源性碱性成纤维细胞生长因子是一种重要的神经营养因子，在机体内与内源性碱性成纤维细胞生长因子有同样作用，中枢神经得不到来自靶器官的神经营养因子，从而会打破中枢神经元与外周靶器官一体化的平衡，80%~90%运动神经元，在缺乏肌肉或许旺细胞来源的神经营养因子时而死亡。
失神经支配的最大变化，就是神经营养因子丢失，导致肌肉形态结构，生理生化和新陈代谢等方面的改变[5,16]。外用生长因子对激活内源性生长因子活性或上调生长因子受体表达均有明显作用[17]。外源性应用碱性成纤维细胞生长因子能够通过提高转化生长因子β的分泌, 进而协同其他生长因子对肌成纤维细胞形成和凋亡发挥作用, 最终影响骨骼肌细胞的结局[18]。
3.3 失神经腓肠肌的肌卫星细胞，萎缩肌纤维和肌纤维间结缔组织增生的相关性骨骼肌损伤修复过程中促进许多细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子的释放，许多学者的实验表明[19-20]，碱性成纤维细胞生长因子与骨骼肌损伤和增殖有着非常密切的关系。研究表明，肌卫星细胞移植能很好的维持骨骼肌的湿重、肌纤维横截面积及肌动蛋白的含量[21]，可延缓骨骼肌萎缩的速度，为神经修复后肌肉运动功能的恢复提供基础。运用经不同时间失神经萎缩的骨骼肌进行游离肌移植，检测肌卫星细胞发现，长期失神经支配骨骼肌中肌卫星细胞含量下降，成为神经修复手术疗效欠佳的重要原因。实验证实[22]，碱性成纤维细胞生长因子可促进骨骼肌肌卫星细胞的增殖，因此可以将其用作增殖细胞的有效手段。失神经骨骼肌的不可逆性肌萎缩是治周围神经损伤领域中一个尚未解决的问题，迄今罕见有关肌卫星细胞增多与组成肌肉的高分化功能性肌纤维萎缩和肌纤维间结缔组织增生变化关系的研究报道。本实验发现：①肌卫星细胞含量高时，萎缩肌纤维数量和肌纤维间结缔组织含量均少，反之肌卫星细胞含量低时，肌纤维萎缩和肌纤维间结缔组织含量均多。②萎缩肌纤维多时，肌纤维间结缔组织增生的就多，反之肌纤维间结缔组织含量就少，由此可知，失神经腓肠肌的肌卫星细胞含量与萎缩肌纤维数量呈负相关性，而萎缩肌纤维数量与肌纤维间结缔组织增生呈正相关性。虽然实验组与对照组腓肠肌同是失神经支配的肌肉，但实验组的肌卫星细胞含量明显高于对照组，同时萎缩肌纤维和肌纤维间结缔组织增生均明显少于对照组，表明肌卫星细胞增多可能有延缓肌萎缩和抑制结缔组织增生的作用。另外，萎缩肌纤维多，则结缔组织增生就多，反之减少。作者认为肌萎缩可能与肌纤维间结缔组织增生有关。对照组肌肉内银染黑色颗粒的维生素C明显较实验组的多，维生素C参与结缔组织成纤维细胞合成胶原，维生素C浓度越高，成纤维细胞合成胶原纤维的功能越旺盛。由此对照组肌纤维间的结缔组织增生明显较实验组多，同时对照组萎缩肌纤维也相应的较实验组的多。因此作者认为萎缩肌纤维增加，可能与结缔组织增生有关。应用碱性成纤维细胞生长因子延缓骨骼肌萎缩目前国内外报道较少。
根据本实验结果，作者认为置入盛有碱性成纤维细胞生长因子的硅胶管，具有缓慢释放神经营养因子和致分裂剂碱性成纤维细胞生长因子使失神经支配腓肠肌的肌卫星细胞增多，同时降低肌肉局部维生素C浓度的作用，这可能是延缓失神经肌萎缩或防止不可逆性肌萎缩的一个研究新思路。

1 Wang H,Gu YD,Xu JG,et al.Zhonghua Shouwaike Zazhi 1997，13（4）：231-234
王欢,顾玉东,徐建光,等.背根神经节感觉神经元延缓失神经支配肌肉萎缩作用的实验研究[J].中华手外科杂志，1997，13（4）：231-234
2 Sunderlaud S. Nerve injury and their repair a critical appraisal. Edinburgh: Churchill Livingstone 1991:156-167
3 Lester RL, Sanith PJ, Mott G. Intrinsic reinnervation mythor reality. J Hand Surgery 1991;241-263
4 Eberstein A.Ebersteins. Electrical stimulation of denervated muscle：is it worth while.Med Sci Sport Exere 1996;28(12)：1463-1469
5 Card DJ. Denervation sequence of neuromuscular denervation in rats and the effects of stimulation(J).Exp Neurol 1997;54(3):251-259
6 Yang ZM.Chengdu: Chemical Industry Press 2002
杨志明.组织工程[M].成都：化学工业出版社,2002
7 Chen J,Luo CQ.Zhongguo Shaoshang Chuangyang Zazhi 2005; 17(1):74-76
陈佳，罗成群.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与创伤愈合[J].中国烧伤创疡杂志, 2005, 17(1):74-76
8 Xu RX,Xiao M. Zhongguo Shaoshang Chuangyang Zazhi 2003;15 (4) : 253-261
徐荣祥, 萧摩.烧伤皮肤再生疗法与创面愈合的机制[J].中国烧伤创疡杂志, 2003 , 15 (4) : 253-261
9 Sarker KS,Ghufoor K.patel KS,et al,Nuclear DNA content using computerized image cytometry of squamous cell carcinomas of head and neck . J laryngol otol 1997;11(1): 43
10 Song HD,Xu YJ,Li WY,et al.Zhonghua Shouwaike Zazhi 1996，12（Suppl）：52
宋浩东,徐元晶,李文彦,等.人骨骼肌失神经后细胞增殖状态的变化--PCNA免疫组织化学学研究[J].中华手外科杂志，1996，12（增刊）：52
11 Dupree M A, Pollack S R, Levine E M,et al. Fibroblast growth factor-2 induced proliferation In osteoblast and bone marrow strunal cells a whole cell model. Biophys J 2006;91(8):3097-3112
12 Jeon O, Kang SW, Lin HW,et al. Long-term and zero-order release of basic fibroblast growth factor from heparin-conjugated poly(L-lactile-co-glycolide)nanospheres and fibringe. Biomaterials 2006;27(8):1598-1607
13 Wu FL,Yu L.Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi 2007；27(7):45-49
吴凤麟,宇丽.碱性成纤维细胞生长因子与胶原对组织工程软骨体外构建的影响[J].中国生物工程杂志，2007，27(7):45-49
14 Liu L,Pei FX,Tang KL.Jingyaotong Zazhi 2005;26(3):182-185
刘雷,裴福兴,唐康来.bFGF对大鼠牵张性脊髓损伤后脊髓神经元影响的实验研究[J].颈腰痛杂志, 2005,26(3):182-185
15 Wan SX,Xiao YF,Wang FB,et al.Zhonghua Xianwei Waike Zazhi 2007;2(30):47-49
万圣祥，肖颖峰,王发斌,等.神经营养因子-3转基因治疗失神经肌萎缩的实验研究[J].中华显微外科杂志,2007,2(30):47-49
16 Spangenburg EE,Chakravarthy NV, Booth FW. P27 kipl:a key regulator of skeletal muscle satellite cell(J). Clin orthop 2002; 403: 221-227
17 Boulfon AJM. Clinical promise of becaplermin gel : I. Diabetic foot ulcer18th Amual Meeting of the European. Tissue Rapair Society1998; 37 : 27-30
18 Cheng B,Fu XB,Cheng ZY,et al.Zhonghua Yixue Zazhi 2002;82(17): 1187-1191
程飚,付小兵,盛志勇,等.碱性成纤维细胞生长因子对肌成纤维细胞的作用及其对创面愈合的影响[J].中华医学杂志，2002，82(17): 1187-
1191
19 Spate U,Schulze PC. Proinflammatory cytokines and skeletal muscle[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2004,7(3):265-269
20 Li JM,Chu TW,Zhou Y.Sichuan Yixue 2007；28(11):1202-1204
李建明,初同伟,周跃.bFGF在强直性脊柱炎活动期病理性表达及意义[J].四川医学，2007,28(11):1202-1204
21 Zhao ZQ,Liu Q,Li G.Zhonghua Guke Zazhi 2006；26(1): 51-55
赵志强,刘强,李钢.骨骼肌卫星细胞移植对延缓失神经肌肉萎缩的作用[J].中华骨科杂志，2006, 26(1): 51-55
22 Wang DH,Xu JG,Zhou WJ,et al.Zhonghua Shouwaike Zazhi 2007；23(1): 1-3
王德华,徐建光,周文俊,等.神经干细胞移植防治骨骼肌失神经肌萎缩的电生理研究[J].中华手外科杂志,2007, 23(1): 1-3