课题背景：本课题受国家自然科学基金支持，主要研究肝脏细胞和不同材料之间的相互作用。重点是研究肝脏细胞和生物可降解支架复合构建可植入工程化肝组织。目前已经用液态生物支架如胶原和纤维蛋白胶构建了可注射的工程化肝组织，分别植入皮下、腹腔和肝脏原位，证实肝细胞能够存活并表达功能。

应用要点：因为肝脏构造及功能极其复杂，工程化肝组织的构建在国内很少涉及。国外有部分学者进行了工程化肝组织的构建研究，但多使用聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物等硬质材料。作者选用了液态生物材料，从而使得构建的工程化肝组织具有简便、高效的优点。而选用的种子细胞，因其成分、功能的多样性，也为进一步的细胞共移植研究提供了良好的模型。

同行评价：实验采用新生大鼠肝细胞及胶原构建工程化肝组织，一旦在体内实验中获得成功，将为临床治疗肝衰竭等疾病提供新的思路。

解放军总医院普通外科研究所，北京市 100853

张博峰，男，1978年生，湖北省罗田县人，汉族，2001年解放军第三军医大学毕业，医师，主要从事肝组织工程的研究。
1978zbf@163.com

通讯作者：徐迎新，硕士，研究员，解放军总医院普外研究所，北京市 100853
xuyingx@126.com

国家自然科学基金（50573091）*

摘要
目的: 在供体肝短缺的情况下，构建可植入的工程化肝组织具有重要的临床意义。实验尝试以新生大鼠肝细胞为种子细胞体外构建工程化肝组织，以期进一步的体内植入。
方法：实验于2007-04/08在解放军总医院普通外科研究所完成。①实验材料：SPF级、出生24 h以内的雄性SD新生大鼠。②实验过程：采用胰酶消化法获取新生大鼠肝细胞；以2×L-DMEM液（添加地塞米松10 μg/L、表皮生长因子20 μg/L、肝细胞生长因子40 μg/L及胰岛素0.04 U/mL）与液态鼠尾胶原等比例混合；再将肝细胞与胶原凝胶复合构建细胞/凝胶复合物，接种于培养板进行培养。③实验评估：培养后第1，3，5，7，9天，采用相差显微镜观察、四甲基偶氮唑盐比色法、苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色分别对工程化组织的生长情况及组织形态特征进行观察，并对工程化组织的白蛋白合成功能及尿素的代谢水平进行评价。
结果：①肝细胞与胶原凝胶复合后，细胞均匀的分布在复合物中。在整个培养过程中，肝细胞保持着稳定的细胞形态。②四甲基偶氮唑盐检测显示肝细胞活性在生长初期平缓下降，直至第5天时仍然保持75%的细胞活性，之后快速下降。③体外培养5 d后，相差显微镜下观察显示肝细胞在胶原凝胶中呈三维立体生长，并保持肝细胞胞体圆形，核大而圆的特异形态；免疫组织化学证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性。④对培养上清中白蛋白和尿素的含量测定表明胶原凝胶中的肝细胞在培养初期保持着稳定的代谢合成功能。
结论：用新生大鼠肝细胞及胶原构建出一种有功能的工程化肝组织模型，这种模型可以应用于今后的工程化肝组织研究。
关键词：组织工程，胶原；凝胶类，大鼠，肝细胞

张博峰，赵云山，刘巨超，张兰，李荣，徐迎新．用新生大鼠肝细胞体外构建工程化肝组织[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):201-204 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-201(ps).pdf]

中图分类号: R329.4
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)02-00201-04

收稿日期：2007-09-21
修回日期：2007-12-06
(07-50-9-5197/W·A)

In vitro liver tissue construction using neonatal rat hepatocytes

Abstract

AIM:Donator liver is insufficient, so it is clinically significant to construct implantable engineered liver tissue. This study investigated the feasibility of constructing engineered liver tissue using neonate rat hepatocytes as seed cells in vitro.
METHODS: The experiment was performed at the Institute of General Surgery, General Hospital of Chinese PLA from April to August 2007. ①The livers of male neonate SPF rats (within 24 hours) were digested by trypsin to isolate hepatocytes. 2×L-DMEM solution containing 10μg/L dexamethasone, 20μg/L epidermal growth factor, 40μg/L hepatocyte growth factor, and 0.04 U/mL insulin was mixed with liquid collagen from rat tail at a ratio of 1∶ 1. A collagen-based gel matrix as carrier for neonate rat hepatocytes was constructed in vitro. Collagen-immobilized hepatocytes were seeded onto plastic culture dishes. ②On the first, third, fifth, seventh, and ninth days, phase contrast microscopy was used to observe the morphology of the hepatocytes/collagen gel construct; Cell proliferation was estimated using MTT method. Hepatocyte histology was evaluated by hematoxylin and eosin (HE) staining, and differentiation was evaluated by immunohistology for albumin.
RESULTS: ①The hepatocytes distributed evenly in the composite and remained round-shape throughout the in vitro culture. ②MTT assay demonstrated that the highly viability of hepatocytes (75%) was maintained up to 5 days, and then decreased rapidly. ③Phase contrast microscopy showed the culture in a collagen matrix allowed stable cell numbers and specific morphous, and permitted three-dimensional neotissue formation. Immunohistology showed preservation of liver-specific markers albumin in vitro. ④The levels of albumin and urea from the supernatant of the culture showed collagen-immobilized hepatocytes maintained liver function stably.
CONCLUSION: A novel approach to construct functional engineered liver tissue using neonate rat hepatocytes as seed cells has been developed. This engineered liver tissue is an attractive tool for the development of liver tissue engineering.

Zhang BF, Zhao YS, Liu JC, Zhang L, Li R, Xu YX. In vitro liver tissue construction using neonatal rat hepatocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):201-204(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-201(ps).pdf]

0 引言

对于肝功能衰竭及肝代谢紊乱疾病，采用组织工程技术构建可植入的工程化肝细胞移植物有望成为一种新的治疗途径[1]。人们尝试采用生物可降解材料构建不同的工程化肝细胞移植物，并将其植入腹腔、皮下等多个肝外位点，显示出潜在的治疗效果[2-4]。然而，在目前的肝组织工程研究中主要采用成熟的肝细胞，这种细胞虽然具有成熟的肝细胞功能，但存活及增殖能力有限。因此研究者们正在努力寻找新的细胞来源。新生动物肝细胞不仅有一定的肝细胞功能，而且具有分化增殖能力，正在受到人们的关注[5-6]。
本实验尝试采用新生大鼠肝细胞及胶原构建工程化肝组织，为今后进一步研究提供一种模型。

1 材料和方法

设计：非随机对照的实验。
单位：解放军总医院普通外科研究所。
材料: 实验于2007-04/08在解放军总医院普通外科研究所完成。主要试剂及仪器：胰蛋白酶（北方同正生物公司），L-DMEM液（Hyclone公司），肝细胞培养液HepatoZYME-SFM（Sigma公司），胎牛血清（Sigma公司）。白蛋白含量测定试剂盒及尿素含量测定试剂盒（中生北控公司）。兔抗人白蛋白单克隆抗体(Dako公司)，小鼠抗兔单克隆抗体（迈新公司）。重组小鼠肝细胞生长因子(R&D公司)，重组大鼠上皮生长因子(R&D公司)。鼠尾胶原溶液自制（2 g/L）。倒置显微镜（Nikon TE2000-U），酶标分析仪（DNM-9602G，北京普朗）。SPF级、出生24 h以内的雄性SD新生大鼠购于军事医学科学院动物中心（许可证号：SCXK-（军）2002-001）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、六作者，干预实施为第一、二、三、四作者，评估者为第五作者。
方法：
肝细胞的获取：用胰蛋白酶冷消化法获取肝细胞：新生大鼠以体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒5 min，无菌条件下取出肝脏，剪碎，用无血清L-DMEM液清洗3次，加入10倍肝组织体积的胰蛋白酶消化液（无血清L-DMEM液及2.5 g/L胰蛋白酶溶液等体积混合），4 ℃消化12 h后取出，加入1倍肝组织体积的血清终止消化，用10 mL吸管轻柔吹打分散细胞，100目网筛过滤，240 g离心5 min，收集细胞沉淀，加入完全培养基30 mL重悬后60 g、5 min离心1次，再用含体积分数为0.1的胎牛血清L-DMEM液清洗2遍（15 g，3 min）。
工程化肝组织小块的制备：操作在冰盒上进行以使胶原保持液态：2×L-DMEM液（添加地塞米松10μg/L、表皮生长因子20 μg/L、肝细胞生长因子40μg/L及胰岛素0.04 U/mL[7]）与液态鼠尾胶原等比例混合，再用 0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.4。将调制好的胶原溶液与肝细胞均匀混合，调整肝细胞密度为1×1010 L–1备用。
体外接种及培养：将调制好的液态的肝细胞/胶原复合物按需接种到各培养板中，37 ℃孵育20 min，待其转变为凝胶后加入培养液。细胞培养使用肝细胞培养液，添加地塞米松10 μg/L、表皮细胞生长因子20 μg/L、肝细胞生长因子40 μg/L和胰岛素0.02U/mL。培养液每24 h更换1次。培养环境为37 ℃、体积分数为0.05的CO2和95%湿度。采用相差显微镜观察肝细胞生长情况。
四甲基偶氮唑盐试验：细胞/胶原复合物接种到96孔板，每孔50 μL，37 ℃孵育20 min后加入培养液0.1 mL，共5板，每板设立3个平行孔及1个无细胞的胶原空白对照孔。分别在培养后第1，3，5，7，9天各取1板，每孔加入四甲基偶氮唑盐溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，吸弃孔内培养上清液，加入150μL二甲基亚砜，振荡10 min后，吸取各孔上清100 μL移入另一96孔板。499 nm波长测定光吸收值。
组织学和白蛋白染色：分别于植入后5 d取材，用体积分数为0.1的中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切成5 μm厚切片，按标准流程行苏木精-伊红染色，光镜下观察。白蛋白染色采用S-P法：微波抗原修复，室温下样品与体积分数为0.003的H2O2溶液孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶。磷酸盐缓冲液冲洗后，封闭血清作用10 min。弃去血清，加1∶200兔抗人白蛋白抗体，置4 ℃过夜。磷酸盐缓冲液漂洗，加入生物素标记的二抗，室温下孵育10 min；磷酸盐缓冲液漂洗，室温下加入辣根酶标记的链霉卵白素孵育10 min。磷酸盐缓冲液漂洗，二氨基联苯胺显色，自来水洗，复染，脱水透明，封固。
培养上清白蛋白及尿素含量：肝细胞/胶原复合物接种到48孔板，每孔0.2 mL，孵育20 min后加入培养液0.4 mL，共6孔，并设立1个无细胞的胶原空白对照孔。分别收集各孔第1，3，5，7，9天的培养上清，采用溴甲酚绿法（白蛋白试剂盒）在630 nm波长处测定光吸收值，调零后根据标准曲线计算白蛋白含量。采用脲酶法（尿素试剂盒）在570 nm波长处测定样品及标准品的光吸收值，调零后根据公式尿素浓度=A样品×标准浓度/A标准计算尿素含量。
主要观察指标：①胶原凝胶中新生肝细胞的生长形态。②肝细胞的活性。③肝细胞/胶原复合物的组织学及免疫组织化学。④肝细胞的白蛋白及尿素合成能力。
统计学分析：由第五作者完成。四甲基偶氮唑盐测定结果、培养上清白蛋白及尿素浓度用t检验进行统计分析并作图。统计、作图软件为Excel 2003。

2 结果

2.1 新生肝细胞的获取及光镜观察 收获的肝细胞数量为（1.0~2.0）×106 /鼠肝，锥虫蓝染色活性95％以上。肝细胞呈卵圆形或圆形，大小较为一致，核大胞浆饱满。肝细胞与胶原凝胶复合后，细胞呈三维立体分散在复合物中，部分细胞聚集成团 ，见图1。体外培养5 d后，肝细胞在胶原凝胶中保持着稳定的形态和数量。

2.2 肝细胞活性 四甲基偶氮唑盐检测显示肝细胞活性在生长初期平缓下降，直至第5天时仍然保持75%的数值（P=0.057），之后快速下降，第7天降为初始值的25.6%，差异有统计学意义（P=0.001），第9天降为14.4%（P=0.000），见图2。

2.3 组织学和免疫组织化学染色 苏木精-伊红染色显示：培养第5天肝细胞保持其特异的细胞形态：胞体圆形，核大而圆形，并可见双核细胞，细胞高密度相互联结聚集生长，见图3。免疫组织化学证实这些肝细胞抗白蛋白抗体染色呈强阳性，见图4。
2.4 白蛋白及尿素合成 为确定胶原凝胶中肝细胞的代谢合成水平，对不同培养时间点的培养上清中的白蛋白和尿素含量进行测定。结果表明肝细胞在培养初期维持稳定的白蛋白合成水平，直至第5天时仍保持81.5%合成能力，与第1天相比差异无显著性（P =0.100），之后则迅速下降，见图5。相比之下，尿素的含量在培养第3天略有上升，之后则成直线下降，但到第5天时仍为第1天的96.7％，差异无显著性意义（P=0.411），见图6。

3 讨论

在肝供体严重不足的情况下，构建可植入的工程化肝组织具有重要的临床治疗前景。同传统的肝细胞移植相比，工程化肝组织为移植的肝细胞提供了细胞外基质以及其他必需成分，有利于移植细胞的成活和分化；体内植入后可与宿主整合，从而可以提供较持久地肝功能支持[1]。
目前，在肝组织工程研究中主要使用成熟肝细胞，它虽然具有成熟的肝细胞功能，但增殖能力有限。因此骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、胎肝细胞及小肝细胞等具有很强的增殖能力的干／祖细胞日益受到研究者们的重视，但是这些干／祖细胞均不同程度存在分化效率低下、分化得到的肝细胞活性不高、功能不强等问题[8-11]。最近有研究者将骨髓间充质干细胞与成熟肝细胞共培养，发现干细胞很快向肝细胞分化表达较强的肝功能，并且长期保持良好的活性及增殖能力[12]。这意味着在构建工程化肝组织时可以尝试同时应用干细胞与成熟肝细胞作为种子细胞，其中肝细胞提供微环境，干细胞增殖并向肝细胞分化成熟。作者在实验中选择新生肝细胞作为种子细胞，是因为有研究表明新生肝细胞同时存在不同的肝细胞群，其中一部分具有肝干细胞的特征，而另一部分具有肝细胞的特征[5，13]。这种特性使其成为研究肝/干细胞共移植的良好工具。研究表明包含两种不同性质细胞群的新生肝细胞不仅具有一定的肝功能，还表现出很强的增殖分化能力 [14-16]。这一结果为研究种子细胞的“共移植”提供了有用的佐证。
胶原是一种重要的细胞外基质，在肝脏中广泛分布，为肝细胞的生长、分化提供合适的环境。体外研究表明胶原对长期维持培养细胞的功能具有重要的作用。大量的研究表明胶原凝胶非常适合作为组织工程支架材料，在肝脏、骨、软骨、肌腱及心肌组织工程研究中广泛应用 [17-20]。本实验证实新生大鼠肝细胞在胶原凝胶中能维持5 d左右的活性及分化功能，表明胶原凝胶为固定其中的肝细胞提供了良好的支架，有利于肝细胞的黏附和存活。在培养末期肝细胞的活性迅速下降，可能是随着肝细胞在胶原凝胶中的生长分化，原有的静态培养环境已经无法提供充足的氧气及营养因子，不能维持进一步生长。因此，模拟体内培养环境，创建一种动态的培养环境对维持肝细胞的存活具有重要的意义。
本实验证实采用新生大鼠肝细胞作为种子细胞可在体外构建一种有功能的工程化肝组织，主要表现在以下几个方面：①新生肝细胞在胶原凝胶中形成高细胞密度的三维立体组织，并保持肝细胞的特异形态。②免疫组织化学染色证实新生肝细胞具有较强的白蛋白合成功能。③对培养上清中白蛋白和尿素的含量进行检测表明新生肝细胞具有较强的合成功能。这些结果表明其具有类肝组织的结构和功能，是一种工程化的肝组织。
综上所述，本实验采用新生大鼠的肝细胞作为种子细胞、以胶原作为支架材料构建了一种工程化肝组织的模型，这种模型有助于近一步的研究工作。

4 参考文献

1 Kulig KM, Vacanti JP.Hepatic tissue engineering. Transplant Immunology 2004;12(3-4): 303-310
2 Lee H, Cusick RA, Utsunomiya H,et al.Effect of implantation site on hepatocytes heterotopically transplanted on biodegradable polymer scaffolds.Tissue Eng 2003;9(6):1227-1232
3 Ohashi K, Waugh JM, Dake MD,et al. Liver tissue engineering at extrahepatic sites in mice as a potential new therapy for genetic liver diseases.Hepatology 2005;41(1):132-140
4 Nishio R, Nakayama M, Ikekita M,et al. Auxiliary liver organ formation by implantation of spleen-encapsulated hepatocytes.Tissue Eng 2006;12(9):2565-2572
5 Okamura A, Zheng YW, Hirochika R, et al.In-vitro reconstitution of hepatic tissue architectures with neonatal mouse liver cells using three-dimensional culture 2007;7(3):721-725
6 Garkavenko O, Emerich DF, Muzina M,et al. Xenotransplantation of neonatal porcine liver cells.Transplant Proc 2005;37(1):477-480
7 Bruns H, Kneser U, Holzhüter S, et al. Injectable liver: a novel approach using fibrin gel as a matrix for culture and intrahepatic transplantation of hepatocytes.Tissue Eng 2005; 11:1718-1726
8 Walkup MH, Gerber DA. Hepatic stem cells: in search of. Stem Cells. 2006;24(8):1833-1840
9 Yoshizato K. Growth potential of adult hepatocytes in mammals: highly replicative small hepatocytes with liver progenitor-like traits.Dev Growth Differ 2007;49(2):171-184
10 Okumoto K, Saito T, Hattori E,et al. Differentiation of rat bone marrow cells cultured on artificial basement membrane containing extracellular matrix into a liver cell lineage. J Hepatol 2005;43(1):110-116
11 Malhi H, Irani AN, Gagandeep S,et al.Isolation of human progenitor liver epithelial cells with extensive replication capacity and differentiation into mature hepatocytes.J Cell Sci 2002;115:2679-2688
12 Qihao Z, Xigu C, Guanghui C,et al. Spheroid formation and differentiation into hepatocyte-like cells of rat mesenchymal stem cell induced by co-culture with liver cells.DNA Cell Biol 2007;26(7):497-503
13 Fiegel HC, Park JJ, Lioznov MV,et al.Characterization of cell types during rat liver development .Hepatology 2003;37（1）:148-154
14 Wang L,Xu JB,Tian Y,et al.Zhongguo Yousheng yu Yichuan Zazhi
王琳, 徐建波, 田元，等.一种分离新生小鼠肝细胞的简单方法[J].中国优生与遗传杂志,2007;15(1):10-12
15 Liu Q,Yuan G.Zhonghua Ganzangbing Zazhi 2004;12(1)：53-54
刘杞,袁刚.新生大鼠肝细胞的分离纯化及冻存条件分析[J].中华肝脏病杂志,2004,12(1)：53-54
16 Yang J,Wang YJ,Liu HL.Disan Junyi Daxue Xuebao 2003;25(6):475-477
杨杰,王英杰,刘鸿凌. 三明治培养新生实验小型猪肝细胞的功能与形态[J].第三军医大学学报, 2003;25(6):475-477
17 Ueno Y, Nagai H, Watanabe G, et al. Transplantation of rat hepatic stem-like (HSL) cells with collagen matrices. Hepatology Res 2005；33: 277-284
18 Zhao YS,Wang CY,Guo XM,et al.Zhonghua Yixue Zazhi 2004;84(9):766-770
赵云山，王常勇，郭希民，等.以液态胶原为支架构建组织工程化心肌组织的实验研究[J].中华医学杂志,2004，84(9):766-770
19 Hosseinkhani H, Hosseinkhani M, Tian F,et al. Bone regeneration on a collagen sponge self-assembled peptide-amphiphile nanofiber hybrid scaffold.Tissue Eng 2007;13(1):11-19
20 Zhao YS,Xu YX,Zhang BF,et al.Zhonghua Yixue Zazhi 2007，87(29):2065-2068
赵云山，徐迎新，张博峰，等.以胶原凝胶为支架构建可植入工程化肝组织的实验研究[J].中华医学杂志，2007，87(29):2065-2068