骨形态发生蛋白2对移植肌腱在骨隧道内愈合的影响：界面组织学特点★

曹红彬1，沈灏2，蒋垚2，辛景义1

课题背景：前交叉韧带重建移植肌腱在骨隧道内多为间接愈合，即直接由Sharpey’s纤维固定，且时间长，通常在12周左右，因此早期功能锻炼受到了限制。

应用要点：实验在前交叉韧带重建过程中在骨隧道内加入骨形态发生蛋白2，术后4周发现有类Sharpey纤维和新骨形成，8周时证实有典型的Sharpey’s纤维形成，比以往12周明显提前。

同行评价：骨形态发生蛋白2在前交叉韧带重建过程中对肌腱在骨隧道内的愈合有明显促进作用，促进腱-骨之间形成间接连接，具有重要的临床应用前景。

1天津医院创伤骨科五病区，天津市 300211； 2上海市第六人民医院关节外科，上海市
200233

曹红彬★，1973年生，河南省登封市人，汉族，2005年上海第二医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科与运动医学方面的研究。
doc_cao@126.com

摘要
目的: 前交叉韧带重建移植肌腱在骨隧道内多为间接愈合，即在肌腱与骨之间没有纤维软骨带而直接由Sharpey’s纤维固定。观察人重组骨形态发生蛋白2对移植肌腱在骨隧道内愈合的影响。
方法：实验于2004-06/09在上海市第六人民医院动物实验室完成，动物实验方法符合动物伦理学要求。①实验材料及分组：选用新西兰大白兔36只，按随机数字表法分为3组，即空白对照组、胶原海绵组及骨形态发生蛋白2组，每组12只。②实验方法：采用兔膝关节自体半腱肌重建前交叉韧带悬吊固定模型，骨形态发生蛋白2组在骨隧道内加入人重组骨形态发生蛋白2和胶原海绵，胶原海绵组仅在骨隧道内加入胶原海绵。③实验评估：术后4，8，12周在移植物周围取材进行苏木精-伊红、天狼猩红和Masson染色，观察骨隧道和肌腱移植物间的界面组织学变化，采用Yamakado分类评价界面形态愈合类型，并对Masson染色切片作肌腱周围新骨形成的形态学定量评估。
结果：空白对照组2只白兔于术后第10周脱失。①术后4周空白对照组腱骨间有腱-骨分离，骨形态发生蛋白2组腱-骨间充满结缔组织；术后8周骨形态发生蛋白2组形成Sharpey’s纤维，而空白对照组术后12周时开始出现Sharpey’s纤维。②术后4，8，12周骨形态发生蛋白2组白兔新骨形成面积均显著大于空白对照组、胶原海绵组（P < 0.01）。
结论：人重组骨形态发生蛋白2可促进移植肌腱在骨隧道内的愈合，促进腱-骨之间形成间接连接。
关键词：腱/移植；骨形态发生蛋白质类；骨生成；组织移植

曹红彬，沈灏，蒋垚，辛景义.骨形态发生蛋白2对移植肌腱在骨隧道内愈合的影响：界面组织学特点[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):205-208 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-205(ps).pdf]

中图分类号:R329.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)02-00205-04

Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on autograft tendon healing in bone tunnel: Interface histological characteristics

AIM:Anterior cruciate ligament reconstruction with semitendonous tendon in bone tunnel always indirectly heals, i.e. there is no fibrocartilagous zone between tendon and bone but Sharpey fiber. The study investigated the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (BM-2) on tendon healing in bone tunnel.
METHODS: The experiment was performed in the animal laboratory, Shanghai Sixth People's Hospital from June to September 2004. All the experiment procedures were accorded with the animal ethical requirements. ①Thirty-six New Zealand rabbits were randomly divided into blank control group, collagen sponge group and BMP-2 group with 12 animals in each group. ②Anterior cruciate ligament reconstruction with semitendonous tendon was done in knee joints of rabbits by suspend fixation model. Recombinant human BMP-2 and collagen sponge were implanted in bone tunnel of rats in BMP-2 group, and only collagen sponge was given to collagen sponge group. ③Specimens were collected at 4, 8 and 12 weeks after surgery. Sections were stained with HE, Sirius Red and Masson to observe the changes of interface tissue between bone tunnel and tendon graft. Interface types were classified according to Yamakado method. The amount of new bone formation over the grafted tendon was measured in section with Masson stain for histomorphometry.
RESULTS: Two rabbits in control group dropped from the study at the tenth week. ①At 4 weeks after surgery, tendon-bone separation occurred in control group, while the connective tissue was filled in tendon and bone in BMP-2 group. At 8 weeks, abundant penetrating Sharpey fibers appeared in BMP-2 group but appeared in control group at 12 weeks. ②New bone formation area in BMP-2 group was significantly larger than that in control group and collagen sponge group at 4, 8 and 12 weeks after surgery (P < 0.01).
CONCLUSION: Recombinant human BMP-2 can enhance tendon healing in bone tunnel, and promote the connection between tendon and bone.

Cao HB, Shen H, Jiang Y, Xin JY.Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on autograft tendon healing in bone tunnel: Interface histological characteristics.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):205-208(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-205(ps).pdf]

前交叉韧带损伤是膝关节常见的外伤，损伤后很难自愈，随着关节镜技术和运动医学的发展以及诊断技术的提高，越来越多的韧带重建手术得以开展。髌腱移植后，存在供区缺损、股四头肌无力以及跪地痛等并发症，异体移植则有传播疾病风险和潜在的免疫排斥反应，因而目前国内外越来越多学者采用半腱肌和股薄肌重建前交叉韧带，但应用肌腱移植重建前交叉韧带后移植物在骨隧道内愈合的时间长，术后移植物在骨隧道内愈合成为前交叉韧带重建的薄弱环节。本实验在前交叉韧带重建时在骨隧道内加入人重组骨形态发生蛋白2，观察其对移植肌腱在骨隧道内愈合的影响。

设计：随机对照动物实验。
单位：上海市第六人民医院。
材料：实验于2004-06/09在上海市第六人民医院动物实验室完成。选用新西兰兔大白兔36只，雌雄不限，体质量（2 500±300）g，购于上海车登动物良种场。按随机数字表法分为3组，即空白对照组、胶原海绵组及骨形态发生蛋白2组，每组12只。所有动物实验前双侧膝关节做骨科检查均为正常。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，未采用盲法评估。
方法：应用25 g/L硫喷妥钠25 mg/kg对动物行静脉注射麻醉。常规备皮、消毒、铺无菌巾。取右膝关节内侧切口，关节囊内侧切开，髌骨外侧脱位，切除前交叉韧带，取其半腱肌对折后做为移植肌腱重建前交叉韧带，沿原前交叉韧带方向做直径为2.5 mm的股骨和胫骨隧道，以贝朗公司2#不可吸收线编织缝合肌腱两端拉入隧道。骨形态发生蛋白2组分别在胫骨、股骨隧道内置入胶原海绵（上海其盛生物公司），然后用1 mL注射器注入含有2 μg人重组骨形态发生蛋白2（美国R&D公司，购自北京友谊生物公司）的溶液0.5 mL，胫骨和股骨隧道各0.25 mL。胶原海绵组在隧道内置入同等数量的胶原海绵，先于股骨隧道反复打结以嵌压于股骨隧道皮质外，再拉紧胫骨侧缝线收紧在胫骨隧道外口反复打结嵌压于胫骨隧道皮质外。空白对照组在钻取骨隧道后，将编织缝合的移植肌腱置入骨隧道，其余操作同胶原海绵组。复位髌骨，缝合支持带和皮肤。
组织学观察：各组分别在术后4周、8周和12周处死4只大白兔。取下胫骨和股骨标本置体积分数为0.1的甲醛溶液固定后脱钙、石蜡包埋。平行于肌腱和隧道方向作纵行切片。分别采用苏木精-伊红、Masson和天狼星红染色。观察骨隧道和肌腱移植物间的界面组织，界面形态采用Yamakado分型[1]方法，分为腱骨分离、疏松结缔组织连接、Sharpey’s纤维连接和直接连接。每个标本包含股骨和胫骨侧，每组每个时段取8个标本。在同一标本上如发现上一种界面形态则归于上一类。
形态学定量评估： Masson染色切片应用IMS/DNA 彩色图像分析综合系统（上海申腾信息技术有限公司）作图像分析。新骨在肌腱周围形成的定量测定是将肌腱移植物置于视野中央，以100倍放大率测量视野中1 mm×1 mm区域内的新骨量，每组每个时段取8个标本，每个标本随机选取5个区域测量。
主要观察指标：各组白兔移植物周围的组织学观察结果、Yamakado界面形态学分型结果及移植物周围新骨形成面积评估结果。
统计学分析：由本文作者采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，所有指标数据用_x±s表示，统计方法选用单因素方差分析。

2.1 实验动物数量分析实验用新西兰大白兔36只，随机分为3组，空白对照组有2只实验新西兰大白兔于术后第10周因为腹泻死亡。
2.2 组织学观察结果术后4周骨形态发生蛋白2组显示移植物周围有大量新骨形成。肌腱周围部分成纤维细胞出现而移植肌腱中央部分发生坏死（图1a）。新骨组织内形成许多腔隙，在8个标本中有1个出现类似Sharpey’s纤维形态的胶原纤维穿透肌腱和新骨。在空白对照组（图1b）、胶原海绵组（图1c）移植物和隧道壁之间是疏松结缔组织，无定型的连接纤维；新骨形成量明显少于骨形态发生蛋白2组，部分标本表现为腱骨分离形态。

术后8周骨形态发生蛋白2组显示肌腱移植物和隧道壁间有明显的Sharpey’s纤维连接（图2a），但无软骨样细胞和软骨改变，也没有典型的直接连接形态。在空白对照组（图2b）、胶原海绵组（图2c）腱骨之间以结缔组织为主，部分标本出现类Sharpey’s纤维结构，未发现软骨样细胞，但有新骨形成；新骨形成少于骨形态发生蛋白2组。

术后12周骨形态发生蛋白2组均显示肌腱移植物与隧道间有明显的Sharpey’s纤维连接，无直接连接形成（图3a）。在空白对照组（图3b）、胶原海绵组（图3c）部分标本出现Sharpey’s纤维，结缔组织和新骨形成较8周增加，也未出现直接连接的形态。

前交叉韧带重建采用肌腱移植可以使移植物充满隧道，且刚度接近正常前交叉韧带，有足够的强度，但其固定比较困难，腱-骨的愈合远比骨-骨愈合慢。肌腱在骨上的附着分为直接愈合和间接愈合。目前的大多数实验研究表明，移植肌腱在隧道内多为间接愈合，即在肌腱与骨之间没有纤维软骨带而直接由Sharpey’s纤维固定[2]。多数动物实验显示植入后12周开始形成Sharpey’s纤维[3]，24周时可以形成直接连接[4]。但Robert 等[5]在人体研究发现在隧道的尖端要形成成熟的间接固定要10~12个月，远大于在动物实验中提出的时限。越来越多的研究者认识到加强移植物在隧道内愈合的强度，加快愈合的时间非常重要。
目前对于促进移植肌腱在骨隧道内愈合的方法有很多报道，热点集中在骨膜[6]、细胞因子[7-12]、骨髓间充质细胞[13-14]和在骨隧道内注入钙磷陶瓷等材料[15-16]，但均处于动物实验阶段。Youn等[6]用新鲜骨膜处理移植肌腱后，12周时发现腱骨之间有骨长入及纤维软骨形成。Ouyang等[13]认为骨髓间充质细胞对腱骨之间的早期愈合起促进作用，可以形成软骨样连接，但其观察的时间仅有4周，远期效果还需要进一步观察。
骨形态发生蛋白2最初因其成骨活性而被发现，最近又发现它有较强的成软骨特性[17]，已广泛应用于骨缺损治疗，但对前交叉韧带重建时腱骨愈合作用的研究很少。关节外模型研究中，Rodeo等[18-19]用骨形态发生蛋白2处理移植肌腱，植入骨隧道，结果显示，骨隧道内的新生骨长入移植肌腱，腱-骨之间的愈合明显优于对照组，8周时腱-骨之间有直接连接，他们认为腱-骨间形成直接连接可能是通过骨形态发生蛋白2诱导单核细胞向成骨细胞分化，以膜内化骨的方式诱导新生骨形成，促进骨组织长入移植肌腱促进腱-骨愈合。
本实验在前交叉韧带重建中在骨隧道内加入骨形态发生蛋白2，处理组在骨形态发生蛋白2植入后4周可以发现穿透性的类Sharpey纤维和大量的新骨形成，8周时证实有典型的Sharpey’s纤维形成，而对照组12周时才可见Sharpey’s纤维形成，结果证实加入骨形态发生蛋白2后可以明显促进腱骨间的愈合，可以在腱骨间形成间接连接。但是与单纯关节外模型中腱-骨之间出现直接连接不同的是，实验中骨形态发生蛋白2组在各时间段内虽然均有大量新骨形成，12周时腱-骨之间只是形成间接连接，无直接连接出现。这可能与前交叉韧带重建时移植肌腱受关节滑液、关节活动和移植肌腱所受应力分布，以及破骨细胞和关节腔内其他的细胞因子的影响等有关，也可能无法保持骨形态发生蛋白2在骨隧道内的有效浓度，以及实验观察时间较短和不同的固定方式等多种因素有关，具体原因尚需进一步研究。在本实验中没有观察到明显的膜内化骨，因而对于骨形态发生蛋白2促进腱-骨愈合的机制也有待于深入研究。实验还发现空白对照组和胶原海绵组在新生骨形成量和Sharpey’s纤维出现时间上无明显差异，表明胶原海绵可以作为骨形态发生蛋白2的载体行前交叉韧带重建。
本实验结果提示，骨形态发生蛋白2在前交叉韧带重建中对肌腱在骨隧道内的愈合有明显促进作用，可以在腱-骨之间形成间接连接。但如何保持其在关节内的有效浓度以及其促进腱骨愈合的机制方面仍有待进一步研究。

1 Yamakado K, Kitaoka K, Yamada H. The influence of mechanical stress on graft healing in a bone tunnel. Arthroscopy 2002;18(9):82-90
2 Koski JA, Ibarra C, Rodeo SA. Tissue-engineered Ligament. Orthop Clin North Am 2000;31(3):437-452
3 Goradia VK, Rochat MC, Grana WA. Tendon-to-bone healing of a semi-tendinosus tendon autograft used for anterior cruciate ligament reconstruction in a sheep model. Am J Knee Surg 2000;13(3):143-151
4 Hunt P, Rehm O, Weiler A. Soft tissue graft interference fit fixation: observations on graft insertion site healing and tunnel remodeling 2 years after ACL reconstruction in sheep. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2006;14(12):1245-1251
5 Robert H, Es-Sayeh J, Heymann D. Hamstring insertion site healing after anterior cruciate ligament reconstruction in patients with symptomatic hardware or repeat rupture: a histologic study in 12 patients. Arthroscopy 2003;19(9):948-954
6 Youn I, Jones DG, Andrews PJ. Periosteal augmentation of a tendon graft improves tendon healing in the bone tunnel. Clin Orthop 2004;419: 223-231
7 Mihelic R, Pecina M, Jelic M. Bone morphogenetic protein-7 (osteogenic protein-1) promotes tendon graft integration in anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Am J Sports Med 2004;32(7):1619-1625
8 Yamazaki S, Yasuda K, Tomita F. The effect of transforming growth factor-beta1 on intraosseous healing of flexor tendon autograft replacement of anterior cruciate ligament in dogs. Arthroscopy 2005;21(9):1034-1041
9 Rodeo SA, Kawamura S, Ma CB, et al. The effect of osteoclastic activity on tendon-to-bone healing: an experimental study in rabbits. J Bone Joint Surg Am 2007;89(10):2250-2259
10 Demirag B, Sarisozen B, Ozer O, et al. Enhancement of tendon-bone healing of anterior cruciate ligament grafts by blockage of matrix metalloproteinases. J Bone Joint Surg Am 2005;87(11):2401-2410
11 Kohno T, Ishibashi Y, Tsuda E. Immunohistochemical demonstration of growth factors at the tendon-bone interface in anterior cruciate ligament reconstruction using a rabbit model. J Orthop Sci 2007;12(1):67-73
12 Yamazaki S, Yasuda K, Tomita F, et al. The effect of transforming growth factor-beta1 on intraosseous healing of flexor tendon autograft replacement of anterior cruciate ligament in dogs. Arthroscopy 2005;21(9):1034-1041
13 Ouyang HW, Goh JC, Lee EH. Use of bone marrow stromal cells for tendon graft-to-bone healing: histologicaland immunohistochemical studies in a rabbit model. Am J Sports Med 2004;32(2):321-327
14 Soon MY, Hassan A, Hui JH, et al. An analysis of soft tissue allograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model: a short-term study of the use of mesenchymal stem cells to enhance tendon osteointegration. Am J Sports Med 2007;35(6):962-971
15 Huangfu X, Zhao J. Tendon-bone healing enhancement using injectable tricalcium phosphate in a dog anterior cruciate ligament reconstruction model. Arthroscopy 2007;23(5):455-462
16 Wang CJ, Wang FS, Yang KD, et al. The effect of shock wave treatment at the tendon-bone interface-an histomorphological and biomechanical study in rabbits. J Orthop Res 2005;23(2):274-280
17 Higuchi C, Myoui A, Hashimoto N. Continuous inhibition of MAPK signaling promotes the early osteoblastic differentiation and mineralization of the extracellular matrix. J Bone Miner Res 2002;17(10):1785-1794
18 Rodeo A, Suzuki K, Deng XH. Use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 to enhance tendon healing in a bone tunnel. Am J Sports Med 1999;27(4):476-488
19 Ma CB, Kawamura S, Deng XH, et al. Bone morphogenetic proteins-signaling plays a role in tendon-to-bone healing: a study of rhBMP-2 and noggin. Am J Sports Med 2007;35(4):597-604