先天性胫骨假关节骨膜组织中基质金属蛋白酶对骨生成的影响*☆
李叔强1，扬 帆2，张 新1，王 萍3
课题背景：①先天性胫骨假关节是一种先天性的胫骨骨不连。有关它的病因和病理不完全清楚，治疗方法多，但效果不佳，复发率高，致残率高，40%左右的患者虽经多次手术但仍难逃截肢的厄运，是骨科界公认的一个难题。有关先天性胫骨假关节免疫组织化学、分子生物学及染色体方面的研究少有报道。②骨改建是一个复杂的多步骤过程，破骨细胞和成骨细胞的作用最为关键。而成骨细胞和破骨细胞不仅依赖基质金属蛋白酶对骨基质成分的直接降解，而且需要基质金属蛋白酶参与介导成骨细胞对成熟破骨细胞的活化以及破骨细胞的迁移和贴附等过程。
应用要点：本组结果发现假关节病变部位骨膜基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达量与创伤后骨折断端的骨膜相似，都高于正常骨膜，二者表达程度正相关性。说明在病理状态下基质内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9活性增强，水解基质内胶原，在骨重建过程中骨的降解加快，加速骨吸收，导致骨吸收及骨生成失衡，是假关节不愈合的重要原因，为假关节的治疗提出了理论基础。
同行评价：正如其他许多先天性疾病的发病基础研究一样，先天性胫骨假关节的详细发病原因尚无统一的认识。了解基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节中的作用和表达情况，可能对深入研究其作用机制具有一定的意义。
1吉林大学第一临床医院骨关节二科，吉林省长春市 130021； 2榆树市医院骨科，吉林省榆树市 130400；3吉林大学第一医院耳鼻咽喉学－头颈外科，吉林省长春市 130021
李叔强☆，男，1973年生,吉林省长春市人，汉族，讲师，吉林大学在读博士，主要从事骨科创伤及人工关节的基础及临床研究。
shuqiangli3@
hotmail.com
通讯作者：王 萍，博士，副教授，吉林大学第一医院耳鼻咽喉－头颈外科，吉林省长春市 130021
吉林省科技厅科技发展计划资助课题（990567-1）*��
摘要
目的: 基质金属蛋白酶在骨胚胎发育、改建及病理过程中所起的关键作用已引起人们的重视。明确基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节病变处骨膜组织中的含量，探讨其与发病机制的关系。
方法：标本来自1990-01/2004-12年吉林大学第一临床医院骨关节二科收治的先天性胫骨假关节患者19例，年龄4~13岁，取材部位为假关节病变处骨膜组织；以10例正常骨膜做阴性对照，年龄10~15岁；15例胫骨闭合骨折断端周围骨膜做阳性对照。所取标本均经家属及本人同意。采用免疫组织化学方法观察上述标本骨膜组织内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达。
结果：①基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9主要在血管内皮细胞胞浆中表达。②基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在假关节病变骨膜内表达的阳性程度与创伤后骨折断端骨膜无明显差异（P > 0.05），但都明显高于正常骨膜（P < 0.05，P < 0.01）；二者在骨膜内的表达水平具有明显相关性（P < 0.01）。
结论：先天性胫骨假关节骨膜组织中基质内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在病理条件下表达增强影响骨生成，是形成假关节的重要原因。
关键词：胫骨/畸形；基质金属蛋白酶类；免疫组织化学；组织构建
李叔强，扬帆，张新，王萍.先天性胫骨假关节骨膜组织中基质金属蛋白酶对骨生成的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):213-216 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-213(ps).pdf]
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中图分类号:R329.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)02-00213-04
收稿日期：2007-03-10
修回日期：2007-09-28
(07-50-3-1390/W·Q)
Influence of matrix metalloproteinase on osteogenesis in the tibial periosteum of congenital pseudarthrosis
Abstract
AIM:We have paid more attentions on matrix metalloproteinase that has great roles in bone embryonic development, reestablishment and pathological process. This article defines the levels of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 in periosteum of the congenital pseudarthrosis of tibia, and elucidate the pathogenesis.
METHODS: The periosteum of the tibia of 19 patients aged 4-13 years with congenital pseudarthrosis were studied at Second Department of Bone and Joint, First Clinical Hospital, Jilin University from January 1990 to December 2004. Ten normal periosteum from the healing site after tibia fracture of subjects aged 10–15 years and fifteen fresh periosteum from the close tibia fracture were taken as negative group and positive group. The subjects and their family members signed an informed consent. The expressions of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 were determined by immunohistochemical method.
RESULTS: ①Matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 were found in vascular endothelial kytoplasm of pseudarthrosis. ②The levels of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 on the congenital pseudarthrosis of tibia were similar to the periosteum of broken ends of the fractured bone (P > 0.05), but significantly higher than the normal periosteum（P < 0.05, P < 0.01）. The levels of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 on periosteum had significant correlation（P < 0.01）.
CONCLUSION: The higher levels of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 on periosteum leads bone building slowly and may be the reason related to the congenital pseudarthrosis of tibia.
Li SQ, Yang F, Zhang X, Wang P.Influence of matrix metalloproteinase on osteogenesis in the tibial periosteum of congenital pseudarthrosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):213-216(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-213(ps).pdf]
0 引言
先天性胫骨假关节是一种罕见的小儿肢体畸形，假关节通常并不是出生时就存在，多数为生后轻微暴力致胫骨骨折后骨折不愈合，其发病病因目前尚不清楚，治疗方法比较多，但效果不佳[1-3]。基质金属蛋白酶是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族。基质金属蛋白酶参与了全身组织的发育、改建以及疾病的病理过程。如胚胎发育、组织改建、创伤愈合、风湿性关节炎的关节破坏、牙周炎、肿瘤侵袭转移等。随着国内外学者对基质金属蛋白酶的研究日益深入，基质金属蛋白酶在骨胚胎发育、改建及病理过程中所起的关键作用引起人们的重视[4-5]。近年来对于假关节病变周围组织与创伤后骨折断端周围参与修复的细胞因子含量是否存在差异成为研究热点[6-7]，本实验目的是通过检测基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节骨膜中的表达，了解基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节中的表达量及其与发病机制的关系。
1 材料和方法
设计：对比观察。
单位：吉林大学第一临床医院骨科。
对象：标本来自1990-01/2004-12吉林大学第一临床医院骨关节二科收治的19例先天性胫骨假关节患者，男12例，女7 例；年龄4~13岁。发病部位均为胫骨中下1/3处，左侧7例，右侧12例。其中2例为2次手术，1例为3次手术，取材部位为假关节病变处骨膜组织（标本为本院病理科保存的蜡块）。阴性对照组正常骨膜10例，均为10~15岁儿童胫骨骨折正常骨性愈合后取内固定时局部骨膜；阳性对照组15例，标本取自闭合胫骨骨折后骨折断端周围骨膜；所取标本均经家属及本人同意。
设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为通讯作者，均受过专业培训。
技术路线：①标本离体后2 h内放入40 g/L中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，应用免疫组织化学技术，取闭合小腿骨折后骨折断端附近骨膜15例作为阳性对照，小腿骨折骨性愈合后取内固定时局部骨膜10例作为阴性对照。设磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。②结果判定：基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节病变处骨膜组织中表达相似，二者均主要在血管内皮细胞胞浆中表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，纤维细胞胞浆中有少量表达。每张切片任选5个视野，用Leica Qwin 分析软件分析灰度值，同时记录平均值。灰度值随表达量的增多而减少。
主要观察指标：①基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在先天性胫骨假关节骨膜中的表达。②基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的灰度值测定及二者相关性。
统计学分析：由本文作者应用Statgraphric系统软件通过t检验比较基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9阳性表达量在正常人胫骨骨膜、创伤后骨折断端骨膜及先天性胫骨假关节病变处骨膜的差异；Spearman秩相关进行相关性分析。
2 结果
2.1 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在不同组织骨膜的表达 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9主要在血管内皮细胞胞浆中表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，纤维细胞胞浆中也有少量表达。免疫组织化学结果显示基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9分别在先天性胫骨假关节、骨折、正常骨膜内的表达量不同。见图1。
2.2 基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的灰度值测定及二者相关性 在假关节病变部位骨膜基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达量与创伤后骨折断端的骨膜差异无显著（P > 0.05），二者均高于正常骨膜（P < 0.05，P < 0.01），见表1。基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9在3种组织内表达有一致性（r =0.425，P < 0.01）。
3 讨论
细胞和基质的相互作用在生理和病理过程如组织改造、血管生成、细胞生存和肿瘤生成中起关键作用，这些相互作用的必要步骤是细胞外基质成分的水解[8]。骨改建是一个复杂的多步骤过程，多种细胞参与了此过程，其中破骨细胞和成骨细胞的作用最为关键。而成骨细胞和破骨细胞不仅依赖基质金属蛋白酶对骨基质成分的直接降解，而且需要基质金属蛋白酶参与介导成骨细胞对成熟破骨细胞的活化以及破骨细胞的迁移和贴附等过程。
基质金属蛋白酶是一组锌离子依赖性内肽酶，同一种基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种基质金属蛋白酶降解，不同种酶的降解效率可有不同。理论上，在细胞外基质降解过程中，无需每一种基质金属蛋白酶均参加，只要其中几种，至于哪几种基质金属蛋白酶参与某一降解过程，不同细胞、组织类型和具体环境可有不同[9-10]。本实验应用的基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的主要作用底物为Ⅳ、Ⅴ胶原，也参与其他胶原的代谢[11]。骨折愈合各个阶段以不同胶原为主，Ⅲ型胶原基因表达的峰值发生于骨折的炎性阶段，Ⅱ型胶原基因转录表达的高峰值位于骨折的软骨修复期，在骨化高峰以及骨折愈合的重建阶段，都有Ⅰ型胶原表达。Ⅳ型胶原的基因表达规律与Ⅱ型胶原相似，因为Ⅳ型胶原主要位于胶原纤维的表面，而这种纤维又主要是由Ⅱ型胶原组成，因此两种基因的表达调节是一致的[12]。Yamagiwa等[13-14]在小鼠肋骨骨折实验中证明基质金属蛋白酶13存在于骨折修复的整个过程。骨折后第1天即可在骨膜内检测到基质金属蛋白酶13，根据基质金属蛋白酶家族酶特性，基质金属蛋白酶13的表达在骨折愈合过程中的作用是骨降解及骨痂的改造，是骨折愈合的重要环节。在骨质疏松的骨质内及松动的髋关节假体周围检测到的基质金属蛋白酶9明显高于正常骨组织[15]，其主要作用为骨降解。Henle[16]在骨折术后骨不连的患者血清中检测到基质金属蛋白酶1明显高于同时期骨折正常愈合对照组，结果直接证明了基质金属蛋白酶活性不平衡导致了骨折断端不愈合。
先天性胫骨假关节是较少见的先天性畸形，其主要特征为出生时即有胫骨中下段缺损，或出生后轻微暴力即可造成骨折[17]。假关节骨折断端由于长期不愈合，骨端硬化，呈圆锥样，是一种特殊类型的骨不愈合，致残率高，40%左右的患者虽经多次手术但仍难逃截肢的厄运，有关它的病因和病理不完全清楚[18]。
本实验结果显示，急性创伤骨折后骨膜基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9明显高于正常骨膜，这与Weiss 等 [19]、Hamano[20]实验中骨折后血清中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9显著升高结果相符。假关节病变部位骨膜基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达量与创伤后骨折断端的骨膜相似（P > 0.05），都高于正常骨膜（P < 0.05，P < 0.01），二者表达程度正相关性说明在病理状态下基质内基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9活性增强，水解基质内胶原，在骨重建过程中骨的降解加快，加速骨吸收，导致骨吸收及骨生成失衡，是假关节不愈合的重要原因。
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