兔髂骨生长板细胞和脱钙骨基质共培养构建组织工程生长板

王德元，高文魁，李智钢，邓永忠

应用要点：本实验以体外扩增培养的髂骨生长板软骨细胞为种子细胞，结合同种异体脱钙骨基质体外构建组织工程生长板，观察到细胞和材料有良好的生物相容性，生长板软骨细胞可于材料增殖、分泌基质，为自体髂骨生长板细胞和组织工程方法应用于长骨生长板损伤治疗作出了有益的探索。

同行评价：骨骺板是未成年人很重要的结构，损伤后导致生长受阻，组织工程的兴起有望通过组织工程的方法来解决这一难题。作者初步构建了组织工程化骨骺板，为解决这一难题作了有益的探索，具有一定创新性。文章如果能跟正常骨骺板进行对照会更好，也希望作者能进一步深入研究并进入动物试验研究，检测组织工程骨骺板的治疗效果。

相关链接：生长板损伤修复是小儿矫形外科实验研究和临床治疗面临的一大难题。游离生长板软骨移植，因缺乏血供而应用困难；血管化生长板移植解决了血循环问题，但是自体移植供体来源有限；异体移植存在免疫排斥；非软骨组织材料只能阻止小面积生长板缺损内骨桥形成，无再生修复能力。软骨细胞及组织工程软骨移植可能是生长板损伤修复的最佳选择。

王德元，男，1971年生，青海省西宁市人，土族，1997年青海大学医学院毕业，主治医师，主要从事创伤骨科研究。
xbdxxdeyuanwang@yahoo.com.cn

摘要
目的: 由创伤、感染等引起的长骨生长板损伤会导致肢体的短缩与成角畸形,组织工程学科的兴起为治疗生长板损伤提供了契机。采用组织工程技术，旨在探索兔髂骨生长板细胞和同种异体脱钙骨基质共培养构建组织工程生长板的可行性。　
方法：实验于2005-06/2006-06在解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所完成。①实验材料：清洁级3周龄新西兰白兔2只，雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg。②实验过程：自兔髂嵴处切取部分髂骨生长板软骨经机械剪切和Ⅱ型胶原酶消化后培养生长板软骨细胞，收集传代培养的第3代兔髂骨生长板细胞体外扩增后接种到同种异体脱钙骨基质上，混合培养。③实验评估：于联合培养24 h，第7，14，21天进行扫描电镜、组织学、免疫组化染色，观察细胞在材料中的生长情况。
结果：①体外单层培养的兔髂骨生长板细胞呈多角形，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。②扫描电镜检查显示体外复合培养24 h,软骨细胞即开始贴附于脱钙骨基质网架上；第7天分布于支架材料上的生长板细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质；第21天细胞长满支架，重叠生长。③苏木精-伊红染色示，复合培养14 d后，生长板细胞很好地贴附于脱钙骨基质网架上，细胞多为球形，胞浆丰富。
结论：同种异体脱钙骨基质和髂骨生长板细胞共同培养可成功构建出组织工程生长板。
关键词：组织工程；生长板；脱钙骨基质；细胞培养；组织构建

王德元，高文魁，李智钢，邓永忠. 兔髂骨生长板细胞和脱钙骨基质共培养构建组织工程生长板[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):227-230 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-227(ps).pdf]

Constructing tissue-engineered growth plate by allograft demineralized bone matrix cocultured with rabbit iliac growth-plate cells

AIM: Long bone growth plate injury induced by wound and infection may cause limb reduction or angular deformity. Tissue engineering provides a promising treatment of growth plate injuries. In this study, we investigated the feasibility of establishing tissue-engineered growth-plate by allograft demineralized bone matrix (DBM) co-cultured with rabbit iliac growth-plate cells.
METHODS: The experiment was performed at Department of Orthopaedics, Fourth Military Medical University of Chinese PLA from June 2005 to June 2006. ①Two 3-week-old New Zealand rabbits irrespective of gender (clean grade, 2.0-2.5 kg) were selected. Growth plate cells were harvested from iliac crest epiphyseal cartilage of the rabbits by dissection and digestion with type Ⅱ collagenase. The third passage cells cultured were collected and incubated on allograft demineralized bone matrix. ② Histology, immunohistochemical staining and electronic scanning microscope (SEM) examinations were performed to observe cell growth on DBM 24 hours, 7, 14 and 21 days after culture.
RESULTS: ①Growth plate chondrocytes exhibited polygonal in monolayer culture, and immunohistochemical staining for type Ⅱ collagen was positive. ②SEM examination showed that twenty-four hours after coculture, the cells adhered to DBM scaffolds; Seven days after culture, the growth-plate chondrocytes rapidly proliferated and began to secret extracellular matrix; cells covered the whole scaffold and became overlapped on the 21st day. ③HE staining showed after 14 days of culture, growth plate cells adhered DBM scaffold in spherical shape with abundant cytoplasm.
CONCLUSION: Tissue-engineered growth-plate is successfully constructed by allograft mineralized bone matrix co-cultured with rabbit iliac growth-plate cells.

Wang DY, Gao WK, Li ZG, Deng YZ. Constructing tissue-engineered growth plate by allograft demineralized bone matrix cocultured with rabbit iliac growth-plate cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):227-230(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-227(ps).pdf]

由外伤、感染等引起的长骨生长板损伤一直没有完善有效的治疗方案。20世纪80年代以来，随着组织工程学的兴起，人们尝试用组织工程学的方法来修复损伤骨骺并取得一定进展[1-13]。组织工程的研究方向之一是理想的载体材料的获得，经系统处理后的脱钙骨基质具有天然的立体空间结构和良好的生物相容性，本实验以兔髂骨生长板细胞作为种子细胞，同种异体脱钙骨基质作为支架材料，于体外联合培养，观察细胞在材料上的生长情况，探索体外构建组织工程生长板的可行性。

设计：单一样本观察。
单位：解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所。
材料：实验于2005-06/2006-06在解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所完成。动物：选用清洁级3周龄新西兰白兔2只，雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。常温常湿环境下饲养。主要试剂：DMEM培养基（美中Sigma公司），胎牛血清（北京欣经科试剂公司），青霉素（华北制药股份有限公司），链霉素（河南新乡华星药厂）,Ⅱ型胶原一抗采用小鼠抗兔单克隆抗体（CHEMICON,1∶50），二抗为生物素化山羊抗小鼠IgG(博士德公司)。主要实验仪器：CO2培养箱（D-62450,美国Heraens Ins GmbH&CoKG）,超净工作台（苏州净化设备厂），Olympus倒置显微镜（日本奥林巴斯光学工业株式会社）。
设计、实施、评估者：均为全部作者，全部接受正规培训，未使用盲法评估。
技术路线：
软骨细胞的分离和培养：将3周龄雄性新西兰兔麻醉下引颈处死后灭菌，从髂嵴处切取生长板软骨（附带部分骨组织），于培养皿中用手术刀仔细刮除纤维组织及软骨膜，切取附带骨组织，磷酸盐缓冲液(含青霉素2×105 U/L,链霉素200 mg/L)漂洗3次,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小, 磷酸盐缓冲液漂洗2次,软骨碎片置于 10 mL离心管中,加入5倍体积的Ⅱ型胶原酶(2.5 g/L，SIGMA)，37 ℃消化过夜,至完全消化,过滤,加未含血清的DMEM(SIGMA)漂洗,离心（1 000 r/min），5 min 3次, 2 mL DMEM培养液(含体积分数为0.2的新生牛血清,青霉素2×105 U/L,链霉素200 mg/L)悬浮细胞,血细胞计数器计数,调整细胞密度为3×105/cm2,接种于50 cm2的培养瓶中,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2的恒温培养箱中培养。
兔同种异体脱钙骨基质的制备：取新鲜健康新西兰兔四肢干骺端骨质，去除软组织，修成直径小于1.5 cm的骨块，流水冲洗4.0~5.0 h，无水乙醇脱水2 h，乙醚脱脂1 h后通风处过夜干燥，置-80 ℃冰箱冻存，依松质骨骨小梁纵向方向制成约7 mm×7 mm的颗粒，按改良的Urist方法依次操作制备：①无水乙醇浸泡2 h。②乙醚浸泡1 h。③蒸馏水冲洗3次。④0.6 mol/L盐酸浸泡4.0~5.0 h。⑤蒸馏水冲洗3~5次。⑥无水乙醇脱水2 h。⑦乙醚脱脂1 h。⑧通风厨内通风过夜干燥。⑨得兔脱钙骨基质，负压抽空分装。⑩钴源射线万拉德辐射消毒，置冰箱保存备用。
脱钙骨基质与传代培养兔髂骨生长板细胞的联合培养：在无菌条件下，收集传代培养的第3代兔髂骨生长板细胞制成1×1010 L-1浓度的细胞悬液，用滴管将悬液滴入置于24孔板中消毒备用的脱钙骨基质中，轻晃，使细胞悬液充分渗入到脱钙骨基质孔隙中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2,饱合湿度条件下联合培养，8 h后加入培养液，其后每日更换培养液。
免疫细胞化学观察：每代细胞接种于盖玻片上，培养两三天后，取出盖玻片，固定后0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液漂洗5 min。体积分数为0.03的H2O2室温下灭活 10 min,蒸馏水漂洗3 min,3次。滴加正常山羊血清封闭液，至37 ℃ 20 min后弃去多余液体。滴加Ⅱ型胶原一抗，4 ℃过夜，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3 min,3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37 ℃ 20 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3 min,3次。滴加链菌素生物素-过氧化物酶标记物试剂，37 ℃ 20 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3 min,4次。3，3’ -二氨基联苯胺显色10~15min,镜下控制。苏木精复染，封固观察。
扫描电镜及组织切片检查：分别于联合培养第1，7，21天取出标本，用20 g/L戊二醛固定、脱水、真空干燥及喷金后电镜观察。部分标本以40 g/L中性甲醛固定1周，常规乙醇逐级脱水、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色。
主要观察指标：①单层培养细胞形态学及免疫细胞化学观察结果。②扫描电镜观察结果。③苏木精-伊红染色观察结果。

2.1 单层培养细胞形态学及免疫细胞化学观察结果最初接种细胞为小圆形，呈悬浮状态，接种24~48 h，大部分细胞贴壁，细胞伸长，形成突起，呈多角形或三角形，少数略呈梭形，细胞分化、增殖，7 d后融合成单层，传代培养的第3代生长板细胞生长情况及形态学特征与原代培养相似，并且保持了旺盛的分泌Ⅱ型胶原的能力,见图1。

2.2 扫描电镜观察兔髂骨生长板软骨细胞于脱钙骨基质表面的存活和增殖情况复合培养24 h，脱钙骨基质表面可见生长板细胞散在黏附，7 d后细胞分裂、增殖，紧密帖附于材料表面，伸出伪足并可见分泌基质,见图2；3周后细胞长满脱钙骨基质表面，大多数呈球形，局部可见重叠生长，见图3。

2.3 苏木精-伊红染色观察生生长板软骨细胞与脱钙骨基质复合后增殖及基质分泌情况复合培养14 d后组织学切片显示，生长板细胞很好地贴附于脱钙骨基质网架上，细胞多为球形，胞浆丰富，核浓集，于细胞周边可见淡染细胞外基质,有些区域细胞重叠生长，见图4。

长骨生长板损伤一直是小儿矫形外科医师面临的重大挑战，至今尚无可靠的治疗方案。游离软骨和血管化生长板移植修复均存在移植物的来源受限，供、受体匹配难及移植物免疫等问题，非软骨类组织如脂肪、肌肉、骨蜡和硅胶等不能再生修复生长板，只能防止小范围生长板损伤并肢体畸形，不能改善肢体生长发育[14]。20世纪90年代以来，人们不断尝试用组织工程技术应用于治疗生长板缺损，Foster等[1]将I型胶原凝胶复合生长板细胞植入羊生长板小面积缺损，发现能防止骨桥形成。国内学者应用无支架离心管培养技术构建组织工程关节软骨植入兔生长板缺损处，对防止肢体的短缩及成角畸形收到一定效果[15-16]。总之，组织工程已经在生长板损伤治疗方面显示了出了广阔的临床应用前景。
组织工程生长板软骨的研究基础是种子细胞的获得，由于长骨生长板对肢体生长发育起重要作用，而且考虑到同种异体细胞在体内有可能引起免疫排斥等问题，已经有研究证实兔髂骨生长板细胞可在体外大量分裂增殖且可经深低温保存[17]，满足了组织工程种子细胞的基本条件，因此作者选用对身体形态及功能影响较小的髂骨生长板细胞作为种子细胞培养。
由于生长板组织工程方面的研究较少，目前尚无公认的理想的载体材料。好的细胞载体要求具有三维立体多孔结构、良好的生物相容性、良好的生物降解性以及可塑性和一定的机械强度等，因此，着眼于组织工程对细胞载体的要求及临床应用的需要，作者选用同种异体完全脱钙骨基质与生长板细胞进行体外联合培养实验研究，以期为组织工程生长板的研究寻求一种较为理想和实用的细胞载体。系统处理后的长骨干骺端脱钙骨基质，去除了抗原蛋白、脂肪及矿物质，具有一定的方向性，其主要成分为Ⅰ型胶原，可有效地为种子细胞黏附、分化提供理想场所。脱钙骨基质4周后逐渐开始被溶解吸收，8周后可被完全吸收[18]。脱钙骨基质于体内的可降解特性，符合作为构建组织工程细胞支架材料的基本要求。而且体内外的实验研究证明，脱钙骨基质经处理去掉了一些抗原蛋白和有阻滞作用的脂质成分，降低了抗原性，并且具有良好的组织亲和性和结合力，脱钙骨基质与种子细胞间均具有免疫抗原性低、生物相容性好的特点[19]。在本实验条件下，通过组织学及扫描电镜观察，兔髂骨生长板细胞被证明能在脱钙骨基质表面分化、增殖，分泌基质，干骺端脱钙骨基质的三维立体结构更有利于细胞生长繁殖，形成组织工程生长板组织。说明以同种异体脱钙骨基质为载体的生长板细胞体外培养构建组织工程生长板是可行的。
尽管本实验初步证明兔髂骨生长板细胞与同种异体脱钙骨基质体外构建组织工程生长板是可行的，但是在正常人体内，生长板细胞是分层排列的，分为静止层、增殖层、成熟层与肥大层，层与层转化过程中，突出的特点为基质钙化及细胞形态改变，体外细胞与载体联合培养时，由于生长板细胞须经剪切及酶的消化作用，势必混杂排列而无法控制其顺序，因此，如何在体外环境中模拟体内细胞分层排列，是组织工程生长板培养的关键问题之一，周勇刚等[20]将兔胫骨上端生长板软骨细胞与聚乳酸载体混合培养后植入异体胫骨上端人为生长板缺损处，发现可形成典型的骺软骨细胞柱状结构及形态，证明植入的载体及细胞复合物可能在体内干骺端局部因素和系统调节因子作用下，完成组织结构重建，维持软骨细胞的增殖及转化。结果提示，载体携带相关因子及加入诱导剂模拟体内环境诱导生长板细胞发生转化理论上可能解决这些问题。
综上所述，虽然存在许多尚待解决的难题，但本文初步证实以兔髂骨生长板细胞和同种异体脱钙骨基质联合培养构建组织工程生长板是可行的，为进一步探索生长板损伤的组织工程疗法奠定了基础。

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