脑损伤并胫骨骨折大鼠骨痂中神经肽的分布及意义*☆

李兵，胡朝晖，罗同清

课题背景：课题为广西科技厅青年基金资助项目（桂科青0447055）。人们在临床实践中观察到骨折合并脑外伤患者骨痂过度生长，甚至出现异位骨化，骨折愈合也明显加快。过去认为通过神经体液因素可以对骨折的愈合发挥间接性调节作用。近来通过一些临床观察和实验证实，神经因素对骨代谢和生长具有直接性的调节作用，但具体机制尚无定论。

同行评价：脑外伤后骨折愈合加快的原因是人们一直想知道的问题，过去的报道已经知道神经系统对骨折愈合有正向调节作用，包括碱性成纤维细胞生长因子等，本文从神经肽水平入手分析，得出了结论，进一步加深了对上述问题的认识，对指导临床应用有一定参考价值。

偏倚或不足：文章结果虽然证实了脑外伤后骨折愈合加速，神经因素直接调控骨的生长，但具体的作用机制尚有待进一步揭示。神经因素是多因子组成，具体的每种神经因子对骨折作用的强弱尚没有揭示，不同脑损伤程度对骨折愈合影响的相关性也有待进一步观察。

广西医科大学第五附属医院，柳州市人民医院骨科，广西壮族自治区柳州市 545001　

李兵☆，男，1970年生，四川省自贡市人，汉族，2003年北京大学毕业，博士，副教授，主要从事脊柱、创伤的研究。
lzhuzhh@tom.com

摘要
目的: 研究证明，含有P物质、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、神经肽Y和酪氨酸羟化酶等神经肽的肽能神经共同存在于骨组织中，主要分布于骨代谢活跃的区域，表明这些肽能神经与骨的生长、发育密切相关。观察脑损伤后大鼠胫骨骨痂中神经肽的表达。
方法：实验于2007-02/05在广西医科大学实验动物中心完成。①实验分组：雄性Wistar大鼠130只，体质量450~550 g，随机数字表法分为单纯骨折组（n =60），脑损伤合并骨折组（n =60），正常对照组（n =10）。②实验方法：麻醉后显露大鼠右颅顶骨，中线旁2 mm 处开直径5 mm 骨窗，液压打击致中度脑损伤，并制备大鼠胫骨骨折模型，其中单纯骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理。③实验评估：术后3，7，14，21，28，35 d 苏木精-伊红染色和神经肽免疫组织化学染色观察神经肽在大鼠胫骨中的分布及胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。计算机X射线摄像仪（CR）摄片测定术后14，21，28 d 脑损伤合并骨折组及单纯骨折组骨痂面积大小。
结果：纳入大鼠130只，均进入结果分析。①脑损伤合并骨折组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，骨痂中神经肽免疫阳性神经纤维较多，明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞质内降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽、酪氨酸羟化酶、神经肽Y强阳性表达。②脑损伤合并骨折组14 d 纤维骨痂中的软骨细胞团增大，骨膜下软骨细胞层增厚；21 d 小梁骨明显增厚，软骨岛增大；28 d 仍可见大量的纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成。单纯骨折组骨膜反应轻，纤维骨痂量少，骨内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主，骨折愈合过程明显晚于脑损伤合并骨折组。③14，21 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积较单纯骨折组大（P < 0.01）；21，28 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积变化明显快于单纯骨折组，提示骨痂塑性快（P < 0.01）。CR摄片发现，各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象，单纯骨折组骨折线清晰，骨痂量较少；脑损伤合并骨折组骨性愈合较好，骨痂量较多，骨折线模糊。
结论：正常大鼠骨生长活跃区有丰富的肽能神经支配。脑损伤后骨痂中神经肽有显著改变，并引起骨痂量和质的改变，骨折愈合加速。
关键词：脑损伤；胫骨；骨折；神经肽

李兵，胡朝晖，罗同清.脑损伤并胫骨骨折大鼠骨痂中神经肽的分布及意义[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):231-235 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-231(ps).pdf]

中图分类号:R329.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)02-00231-05

Expression and significance of neuropeptides in callus of rats after brain injury and tibial fracture

AIM:It is suggested that the peptidergic nerves containing substance P (SP), calcitonin gene-related peptide (CGRP), vasoactive intestinal peptide (VIP), neuropeptide Y (NPY) and tyrosine hydroxylase (TOH) co-exist in bone tissues and distribute in the active bone metabolism area, indicating these peptidergic nerves are closely related with bone growth and development. In this study, the expression of neuropeptides in tibial callus of rats after brain injury was observed.
METHODS: The experiment was conducted in the Experimental Animal Center of Guangxi Medical University from February to May 2007. ①130 male Wistar rats of 3-4 months old and 450-550 g were randomly divided into fracture group (n =60), brain injury plus fracture group (n =60) and control group (n =10). ②The right parietal bone of anesthetized rats was exposed, and bone window of 5 mm was opened 2 mm near median line, then moderate brain injury was made by sap pressure, and the rat models of tibial fracture were established. The fracture group was only subjected to cranial bone window, and the control group was not given any treatment. ③The distribution of neuropeptide in tibia and callus succession as well as fracture healing were observed by HE and immunohistochemical staining on postoperatively days 3, 7, 14, 21, 28, and 35 days. The callus area in brain injury plus fracture group and fracture group was detected by computed radiography (CR) at 14, 21 and 28 days after operation.
RESULTS: All 130 rats were involved in the result analysis. ①At early stage after brain injury, there were a quantity of fibrous callus and cartilaginous callus formation in brain injury and fracture group and many neuropeptides immunoreactive nerve fibers in callus were found. Strong immunoreactivites of CGRP, SP, VIP, NPY, TOH occurred to osteogenitor cells and chondroblast, which proliferated in thickened endothecium. ②In brain injury and fracture group on day 14, the chondrocyte group was enlarged and subperiosteum chondrocyte layer was thickened; on day 21, bone trabecula was significantly thickened, and cartilage islands were increased; on day 28, there were still quantity of fibrous callus and cartilaginous callus, and sparse woven bones surrounding chondrocyte groups. In fracture group, periosteal reaction was slight, and fibrous callus was few; osteogenesis in bone and cartilage occurred, but mainly in bone. Moreover, the fracture healing was remarkably later than brain injury and fracture group. ③Callus area in brain injury and fracture group was larger than that in fracture group on days 14 and 21 (P < 0.01); on days 21 and 28, the callus area in brain injury and fracture group changed distinctly compared with fracture group, indicating callus plasticity was faster (P < 0.01). CR photographs showed that no disunion was found in each group, and fracture line was clear in fracture groups with few callus; in brain injury and fracture group, the bone healing was good, with plenty callus but obscure fracture line.
CONCLUSION:Neuropeptide nerves innervate in the active area for bone growth. Neuropeptides in the callus change greatly after brain injury, which induce the rapid recovery of fracture and improve fracture healing.

Li B, Hu ZH, Luo TQ.Expression and significance of neuropeptides in callus of rats after brain injury and tibial fracture.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):231-235(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-231(ps).pdf]

多年来人们在临床实践中观察到骨折合并脑外伤患者骨痂过度生长，甚至出现异位骨化，骨折愈合明显加快，其确切发生机制尚不明了。本实验应用免疫组织化学法检测骨痂中的神经肽，在形态上观察骨痂中肽能神经纤维的分布、数量、性质的变化及其与骨痂量的相关性，以探讨脑损伤后肽能神经因素对骨折愈合的影响和机制。

设计：随机对照动物实验。
单位：广西医科大学第五附属医院，柳州市人民医院骨科。
材料：实验于2007-02/05在广西医科大学实验动物中心完成。清洁级雄性Wistar大鼠130只，体质量450~550 g，月龄三四个月，由广西医科大学实验动物中心提供(生产许可证号：SCXK2003-003)。
主要试剂及仪器：降钙素基因相关肽、P物质、酪氨酸羟化酶、血管活性肠肽、神经肽Y（武汉博士德生物工程有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）骨组织脱钙试剂（瑞兴科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（福州迈新生物技术有限公司，批号：701020060v）。 Nikon UFX-ⅡA显微镜、摄像镜（日本）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统（中国，武汉）；计算机放射成像系统（Regius model-150，日本KONIC公司）；液压脑损伤模型由柳州医疗器械厂制作（参考方加胜等[1]）；以上设备均由柳州市人民医院提供。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为第二作者，评估为第三作者。均经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
干预分组：将130只大鼠按随机数字表法分为单纯骨折组（n =60），脑损伤合并骨折组（n = 60），正常对照组（n =10）。
模型制备：术前所有大鼠禁食，称质量，经氯胺酮（1 mL/kg）腹腔内注射麻醉后，常规去毛、备皮、碘伏消毒，显露右颅顶骨，中线旁2 mm 处开直径5 mm 骨窗，液压打击致中度脑损伤。复苏后，沿胫骨前外侧钝性分离进入、达胫骨干，在胫骨骨干中1/3段用摆锯锯断成横形骨折，以直径1 mm 克氏针作逆行髓内固定，经查骨折固定牢固后，生理盐水冲洗伤口，关闭伤口，碘伏再消毒。单纯骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理。术毕分笼饲养。
标本采集和处理：术后3，7，14，21，28，35 d 分批麻醉后断头处死大鼠，立即取带骨膜和少许肌肉的右胫骨，置于装有40 g/L 多聚甲醛（pH 7.2）瓶中，标明动物编号、日期，放入4 ℃ 冰箱中固定24 h。之后取出，充分水洗后，磷酸盐缓冲液浸泡30 min，放入100 g/L 乙二胺四乙酸钠（EDTA）pH 7.3溶液中脱钙，每周换2次脱钙液，经5周脱钙，用针头能轻易扎穿骨皮质，则脱钙充分。然后进行骨痂的免疫组织化学操作步骤。切片与胫骨纵轴垂直，连续切片，间距为5 μm。具体步骤参照试剂说明书。
计算机X射线摄像仪（CR）摄片：术后14，21，28 d 对大鼠完整的右侧胫骨干骨折标本行CR摄片（距离：90 cm，电压：40 kV，电流：3.0 mA），观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。所得图像运用Photoshop 7.0进行处理，计算骨痂面积大小。
免疫组织化学染色图像分析：采用真彩色医学图像分析软件(Midia Cy-bernetics公司image-proplus 415)对免疫组织化学结果进行半定量分析。所有玻片均在同一放大倍数(×400)、同一光强度下分析。每个指标50张玻片（每个标本取5张阳性数最大的切片），各测相同面积，计算平均每个视野阳性细胞百分比。
主要观察指标：①单纯骨析组及脑损伤合并骨析组骨痂面积的大小、胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。②神经肽在大鼠胫骨中的分布。
统计学方法：由第三作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验结果以_x±s表示。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠130只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 脑损伤合并骨折组及单纯骨折组骨痂面积的大小见表1。

14，21 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积较单纯骨折组大（P < 0.01）；21，28 d 脑损伤合并骨折组骨痂面积变化明显快于单纯骨折组，提示骨痂塑性快（P < 0.01）。将大鼠离体右侧股骨干CR摄片，观察骨痂的连续性发现，各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象，单纯骨折组骨折线清晰，骨痂量较少，见图1；脑损伤合并骨折组骨性愈合较好，骨痂量较多，骨折线模糊，见图2。

2.3 组织形态学观察骨折组胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况脑损伤合并骨折组早期骨膜明显增厚，骨膜内层形成软骨细胞；纤维骨痂量较多；14 d 纤维骨痂中的软骨细胞团增大，有的融合在一起，软骨内骨化少，骨膜下软骨细胞层增厚；21 d 小梁骨明显增厚，软骨岛增大，从骨折端两侧向中间延伸形成巨大的外骨痂。脑损伤合并骨折组骨小梁成熟良好，多为编织骨，深层的编织骨已开始塑形为板层骨，28 d 仍可见大量的纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成，外骨膜下的软骨层完全转变成编织骨；35 d 后骨折线完全消失，见图3。单纯骨折组骨膜反应轻，纤维骨痂量少，骨内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主，35 d 后单纯骨折组依然可看到骨折线，见图4，骨折愈合过程明显晚于脑损伤合并骨折组。

2.4 神经肽在大鼠胫骨中的分布苏木精-伊红染色显示干骺端、骨膜和骨髓腔神经纤维最多；神经肽单抗免疫组织化学染色显示干骺端免疫阳性神经纤维最多。SP免疫阳性神经纤维在髓腔比在骨骺和骨膜多，降钙素基因相关肽在骨骺和骨膜比在髓腔多。神经肽Y在骨膜和髓腔均存在，数量较降钙素基因相关肽少。血管活性肠肽、P物质与降钙素基因相关肽分布一致，酪氨酸羟化酶与神经肽Y分布一致。P物质、降钙素基因相关肽、神经肽Y、酪氨酸羟化酶、血管活性肠肽阳性表达在骨骺细胞，生长板成熟钙化区软骨细胞，编织骨边缘成骨细胞、破骨细胞，骨膜内外的成骨细胞、破骨细胞胞质内，其中血管活性肠肽、P物质阳性强度弱。单纯骨折组7 d纤维骨痂中软骨细胞周围的成纤维细胞间有少许降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维；14，21 d 在编织骨边缘有大量降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽、神经肽Y、酪氨酸羟化酶免疫阳性神经纤维；35 d 神经肽Y、酪氨酸羟化酶稍减少，降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维仍较多，P物质则主要分布在内骨痂骨髓细胞出现区。脑损伤合并骨折组7 d 时纤维骨痂中可见降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维；但14 d 以后，纤维骨痂中见到大量降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽、神经肽Y、酪氨酸羟化酶免疫阳性肽能，趋向稳定增加，大约达到单纯骨折组2倍。
2.5 单纯骨折组及脑损伤合并骨折组骨痂中阳性细胞的表达见表2。

在临床实践中，经常观测到一些有趣的现象，截瘫和颅脑损伤的患者伴随的四肢骨折往往可以见到大量的骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化，骨折愈合明显快于没有中枢神经损伤的四肢骨折患者，而神经性关节患者，由于感觉神经损害，患肢骨折愈合往往延缓，骨不愈合率较高。这些现象提示神经因素对骨折愈合有影响。对骨组织而言，人们虽然对成骨的方式和过程有了一定的了解，但对这个过程如何调节骨发育和创伤后再生，依然知之甚少，有待进一步研究神经因素对骨折愈合的影响和机制[1-3]。
3.1 肽能神经在骨组织的分布和作用人们对正常骨组织神经支配的认识经历了漫长而曲折的过程。早在150年前，就有人通过大体解剖发现骨组织中存在神经纤维。进一步研究发现，许多无髓和有髓的神经纤维支配骨组织和骨膜。上世纪30年代Hurrell通过研究成骨细胞附近的神经纤维，推测这些纤维与骨的塑形和生长有关[2]。近年来，由于骨组织脱钙技术的发展，使人们能够将免疫组织化学技术应用于骨，来研究不同来源神经纤维在骨组织中的分布及其中神经肽的含量。Bjurholm[3]用免疫组织化学染色的方法证明含有P物质、降钙素基因相关肽、血管活性肠肽、神经肽Y和酪氨酸羟化酶等神经肽的肽能神经共同存在于骨组织中，主要分布于骨骺、骨膜、骨髓等骨代谢活跃的区域，表明这些肽能神经与骨的生长、发育密切相关。
本实验利用免疫组织化学染色的方法检测了P物质、降钙素基因相关肽、神经肽Y、酪氨酸羟化酶和血管活性肠肽在鼠正常胫骨组织中的分布，发现上述5种神经肽免疫阳性神经纤维在干骺端骨膜、软骨钙化区编织骨形成的边缘非常丰富。酪氨酸羟化酶和神经肽Y在髓腔分布较丰富，而降钙素基因相关肽和血管活性肠肽在骨膜的分布较髓腔丰富，神经肽Y和酪氨酸羟化酶主要分布在外骨膜内层和内骨膜。降钙素基因相关肽、P物质和血管活性肠肽存在于感觉神经中，神经肽Y和酪氨酸羟化酶存在于交感神经中[4-9]。肽能神经在骨中分布广泛，特别是含降钙素基因相关肽的神经，以代谢活跃的部位如骨膜、干骺端及骺板附近分布最多，在骨干处的皮质和骨髓则相对较少[10-14]。这些肽能神经主要与血管伴行，有少数游离神经末梢伸出并止于骨膜衬里细胞层、骨髓细胞团等，其作用的靶细胞为成骨细胞和破骨细胞，这些肽能神经主要分布在骨代谢活跃的区域，提示肽能神经能调节骨代谢。
3.2 骨痂中神经肽的改变及其对骨折愈合的影响 Hukkanen等[14]发现骨折能诱导神经再生长入骨折部位，骨折后7 d，骨痂内即可检测到蛋白基因产物（PGP9.5）和降钙素基因相关肽免疫阳性的感觉神经纤维。本实验图像分析显示7 d 后神经纤维增加明显，骨折后21 d 降钙素基因相关肽免疫阳性的骨膜神经纤维较正常对照组增加3倍以上，提示这些增生的感觉神经纤维能产生可以影响骨折愈合浓度的神经肽，从而参与正常骨折愈合过程。
本实验发现单纯骨折组骨痂中7 d 就有少许降钙素基因相关肽神经纤维长入；14 d 后在编织骨边缘有降钙素基因相关肽、P物质、神经肽Y、酪氨酸羟化酶和血管活性肠肽免疫阳性神经纤维出现；21 d 上述纤维进一步增多；28 d 部分编织骨形成板层骨，神经纤维稍减少，但内骨痂编织骨被逐渐吸收，编织骨边缘神经纤维增多，以P物质为主，且编织骨间出现骨髓细胞，说明神经参与了骨痂的形成和改建过程。
脑损伤后，骨痂形成和成熟过程发生改变已经有相关报道[5-6，15-17]。目前也已经有实验证实降钙素基因相关肽、P物质、血管活性肠肽等直接调控骨折的愈合[18-21]。本实验发现，脑损伤后，大鼠胫骨骨痂量增多，早期骨痂中神经肽强阳性表达，刺激纤维骨痂和软骨骨痂大量形成。骨折愈合明显加速。与人们日常观察到的脑外伤合并骨折患者，骨折愈合现象相符，这些说明脑外伤后骨折部位神经肽的变化可能是骨折加速的原因，具体的作用机制尚有待进一步观察。
骨的形成和代谢受到机体大环境以及小环境的多层面、多途径调节，神经系统参与上述过程，发挥间接性调节作用。近来，通过一些临床观察和实验，神经因素对骨代谢和生长的直接性调节虽已经得到证实，但具体机制尚无定论。但随着神经生物学、分子生物学的深入研究，以及新的实验手段不断涌现，人们对神经调控骨的发生、形成的机制将会有更明确的认识，进而提高临床骨折治疗的质量和速度。

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