课题背景：本课题得到了国家自然科学基金资助项目（30440065、30572082）、北京市自然科学基金资助项目（7052059）和湖南省医药卫生科研基金（B2006-101）的资助。课题开展了血管内皮细胞损伤过程中NADPH氧化酶基因表达图谱的分析，分析活性氧的产生及其对内皮细胞损伤的影响。

应用要点：作者最新的实验结果证实了在高浓度低密度脂蛋白等一些动脉粥样硬化危险因素的刺激下，作为主要NADPH氧化酶的NADPH氧化酶4通过产生高水平活性氧损伤血管内皮细胞，启动动脉粥样硬化的发生。通过对NADPH氧化酶4在内皮细胞氧化损伤过程中的作用机制观察，将为探寻保护内皮细胞免受氧化损伤的基因与因子提供新线索。

相关链接：①低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用。但活性氧产生的分子基础及氧化损伤内皮细胞的作用机制尚需进一步研究。②NADPH氧化酶的多亚基家族似乎对于内皮过氧化起着主导作用。相关链接：①低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用。但活性氧产生的分子基础及氧化损伤内皮细胞的作用机制尚需进一步研究。②NADPH氧化酶的多亚基家族似乎对于内皮过氧化起着主导作用。

1卫生部北京医院老年医学研究所，卫生部老年医学重点实验室，北京市 100730，2南华大学医学院，湖南省衡阳市
421001

屈顺林★，男，1978年生，湖南省衡阳市人，汉族，2005年南华大学毕业，硕士，讲师，主要从事动脉粥样硬化发病机制的研究。

通讯作者：黎 健，
博士，研究员，博士生导师，卫生部北京医院老年医学研究所，北京市 100730
LijLiy@hotmail.com

国家自然科学基金资助项目(30440065、30572082)**；北京市自然科学基金资助项目(7052059)*；湖南省医药卫生科研基金(B2006-101)*

摘要
目的: 低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用。实验拟进一步观察高浓度低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活性氧、NADPH氧化酶4 mRNA 水平和凋亡的影响。
方法：实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成。①实验材料：脐带来自卫生部北京医院产科，产妇或家属签署知情同意书；低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取。②实验过程及分组：分离人脐静脉内皮细胞。先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h以选取最佳的浓度，观察NADPH氧化酶4表达，分为：不加低密度脂蛋白的对照组；0.8 g/L 低密度脂蛋白组；1.6 g /L 低密度脂蛋白组；2.4 g/L低密度脂蛋白组。再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达，分为：不加低密度脂蛋白的对照组，12 h处理组，24 h处理组，48 h处理组。以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞，并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡。③实验评估：反转录－聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶的表达；流式细胞仪检测胞内活性氧生成量和细胞凋亡率，Hoechst 33342染色分析细胞凋亡。
结果：①1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量高于对照组（P < 0.05）。②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也比对照组明显增加（P < .05）。③用反转录-聚合酶链反应检测不同浓度（0.8，1.6，2.4 g/L）低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间（12，24和48 h）时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化，结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比，各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强。
结论：低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶4 mRNA表达，并促进细胞内活性氧生成和细胞凋亡。
关键词：内皮细胞；脐静脉；脂蛋白类；NADPH氧化酶；活性氧；细胞凋亡；组织构建

屈顺林，丁莉，国汉邦，黄秀清，满永，王抒，杨向东，黎健．高浓度低密度脂蛋白对血管内皮细胞NADPH氧化酶4 mRNA水平、活性氧产生及细胞凋亡的影响 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):236-240
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-236(ps).pdf]

中图分类号:R329.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)02-00236-05

收稿日期：2007-05-23
修回日期：2007-09-03
(07-50-5-2999/W·Q)

Effects of high concentration of low-density lipoprotein on NADPH oxidase 4 mRNA expression, reactive oxygen species generation and apoptosis in vascular endothelial cells

Abstract

AIM:Low-density lipoprotein (LDL) can induce the generation of reactive oxygen species (ROS) of vascular endothelial cells and has a principal role in the growth and injuries of endothelium. The aim of this study was to investigate the effect of high concentration of LDL on ROS generation, mRNA level of NADPH oxidase 4 (NOX4) and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).
METHODS: The experiment was carried out in the Key Laboratory of Geriatrics, Ministry of Health from December 2004 to February 2006. ①Materials: Umbilical cords were collected from Maternity Department of Beijing Hospital with informed consents. LDL was isolated by sequential ultracentrifugation in Biochemistry Laboratory of Beijing Institute of Geriatrics, Beijing Hospital. ②Procedure: The optimum concentration and time of LDL treatment were selected, and then isolated HUVECs were treated for 24 hours with different concentrations of LDL. The NOX4 expression was observed after selecting an optimal concentration. There were control group, 0.8 g/L LDL group, 1.6 g/L LDL group and 2.4 g/L LDL group. The NOX4 expression was observed after HUVECs treated with 1.6 g/L LDL for an optimal time. There were control group, 12-hour treatment group, 24-hour treatment group and 48-hour treatment group. ROS generation, NOX4 and apoptosis in HUVECs treated with optimized LDL concentration and proper hours were detected. ③Assessments: The NOX4 expression was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Intracellular ROS level and apoptotic rate were determined by Flow Cytometry (FCM). Hoechst 33342 staining was used to analyze the apoptosis in HUVECs.
RESULTS: ①Compared with control group, ROS generation was increased in HUVECs after treatment with 1.6 g/L LDL for 24 hours (P < 0.05). ②The apoptosis in HUVECs treated with 1.6 g/L LDL for 24 hours was significantly higher than that in control group (P < 0.05). ③The RT-PCR results indicated that the mRNA expression of NOX4 was increased in HUVECs treated with different concentrations of LDL for different hours.
CONCLUSION: LDL could induce apoptosis through up-regulating NOX4 expression and intracellular ROS production in HUVECs.

Qu SL, Ding L, Guo HB, Huang XQ, Man Y, Wang S, Yang XD, Li J.Effects of high concentration of low-density lipoprotein on NADPH oxidase 4 mRNA expression, reactive oxygen species generation and apoptosis in vascular endothelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):236-240(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-236(ps).pdf]

0 引言

血液中低密度脂蛋白水平与动脉粥样硬化的发生呈高度正相关，内皮细胞功能损害是动脉粥样硬化发生的首要因素。在正常生理情况下，血管内皮可通过屏障作用阻止低密度脂蛋白等大分子物质和单核细胞等血液细胞成分进入动脉内膜。血液中大量低密度脂蛋白在内皮下沉积可导致内皮细胞损伤,产生大量活性氧，引起低密度脂蛋白氧化修饰，最终诱导内皮细胞凋亡。这提示氧化应激在低密度脂蛋白导致的动脉粥样硬化发病过程中起重要作用。
氧化应激指的是体内活性氧产生蓄积超过了机体的清除能力，现有研究显示体内活性氧的产生有5种酶参与，如黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶、线粒体电子传递链、NADPH氧化酶、脂质过氧化物酶，其中NADPH氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶。据文献报道在高浓度的低密度脂蛋白条件下，内皮细胞中活性氧生成增加[1]，并可导致细胞凋亡，但NADPH氧化酶4是否参与内皮细胞氧化损伤尚不清楚，就此进行初步探讨。

1 材料和方法

设计：体外实验，分组对照。
单位：卫生部北京医院老年医学研究所。
材料：实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成。脐带来自卫生部北京医院产科，产妇或家属签署知情同意书。低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取。
设计、实施、评估者：设计为通讯作者，实施为全部作者，均受过专业培训。
技术路线：
细胞分离与培养：取长度约20 cm的无菌新鲜脐带，用生理盐水冲洗脐静脉，然后用1 g/L的Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）灌注脐静脉15 min，收集灌注液，800 r/min离心6 min，收集内皮细胞到 25 cm2培养瓶中，加入5 mL含体积分数为0.2的胎牛血清的M199混合培养基，在37 ℃含体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，12 h后更换新鲜培养基。以后每隔2 d换液1次，待第2，3代细胞生长至亚融合状态时用于实验。
人脐静脉内皮细胞形态学观察：用倒置显微镜观察人脐静脉内皮细胞形态。
免疫组织化学法检测人脐静脉内皮细胞内Ⅷ因子相关抗原的表达：将人脐静脉内皮细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，待细胞生长至60%融合后取出盖玻片，40 g/L甲醛（磷酸盐缓冲溶液配制）室温固定30 min，用磷酸盐缓冲液洗5 min，丙酮2 min，磷酸盐缓冲液洗5 min，体积分数为0.03的H2O2室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液冲洗 3次×5 min，正常动物非免疫血清室温下封闭 5 min，磷酸盐缓冲液洗5 min，加兔抗人Ⅷ因子相关抗原的抗体（Promega公司）（阴性对照组用磷酸盐缓冲液代替一抗），室温下孵育60 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次×5 min，加生物素标记的羊抗兔IgG室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲液冲洗 3次×5 min，链亲合素-过氧化氢溶液室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲液洗3次×5 min，二氨基联苯胺显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，自来水冲洗过夜，脱水（体积分数为0.8，0.9，1.0的乙醇各5 min，二甲苯15 min），中性树胶封固，显微镜下观察。
实验分组：先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞24 h以选取最佳的浓度，观察NADPH氧化酶4表达，分为：①不加低密度脂蛋白的对照组。② 0.8 g/L 低密度脂蛋白组。③1.6 g/L 低密度脂蛋白组。④ 2.4 g/L
低密度脂蛋白组。再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达，分为：①不加低密度脂蛋白的对照组。②12 h处理组。③24 h处理组。④48 h处理组。以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞，并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡，①不加低密度脂蛋白的对照组。②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组。
反转录聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶表达：按Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录反应按照Promega公司试剂盒的实验程序完成。聚合酶链反应引物序列：β-肌动蛋白5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’和5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’，扩增片段长度为539 bp； NADPH氧化酶4 5’-CAG GAG GGC TGC TGA AGT ATC AA-3’和5’-TGA CTG GCT TAT TGC TCC GGA TA-3’，扩增产物303 bp。聚合酶链反应条件：β-肌动蛋白均为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，68 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1.5 min，30个循环，72 ℃ 继续延伸7 min；NADPH氧化酶4 为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，68 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1.5 min，30个循环，72 ℃ 继续延伸7 min。8 μL聚合酶链反应产物在15 g/L的琼脂糖凝胶中电泳1.5 h，Pharmacia Biotech凝胶成像系统分析结果。
流式细胞仪检测细胞内活性氧水平：以DCFH-DA（江苏碧云天公司）作为荧光探针对细胞内活性氧进行荧光标记，用流式细胞仪检测每组细胞内的平均荧光强度。未加DCFH-DA的阴性对照组的自发荧光值定为1，而其他各组的荧光值均为相对阴性对照来说的相对值（各组的荧光强度/阴性对照的荧光强度）。将处理好的人脐静脉内皮细胞用无血清培养基洗2次，加5 mL无血清培养基和7 μL DCFH-DA到25 cm2的培养瓶中，在37 ℃ 含体积分数为0.05的CO2的培养箱中孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗3次，用胰酶消化，加血清终止反应，用无血清培养基洗2次，用3 mL无血清培养基重悬细胞；其中阳性对照组加阳性药物Rosup（试剂盒提供）3 μL，常温下孵育1 h；磷酸盐缓冲液洗2次后用流式细胞仪检测细胞内活性氧。
Hoechst33342染色观察细胞凋亡: 用低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞后收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞1次，加入Hoechst33342(Gibco公司)使终浓度为 10 mg/L，常温下孵育15 min，离心去上清，滴片后于荧光显微镜下观察。
主要观察指标：人脐静脉内皮细胞形态、第Ⅷ因子相关抗原、活性氧、细胞凋亡、NADPH氧化酶4 mRNA水平。
统计学分析：由本文作者采用SPSS 10.0软件分析，进行t检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 人脐静脉内皮细胞的鉴定 倒置显微镜下可见人脐静脉内皮细胞贴壁生长呈鹅卵石样排列（见图1a）。内皮细胞Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞所特有，用免疫组织化学法检测到分离培养的人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原为阳性，胞内可见棕色颗粒，而未加一抗（用磷酸盐缓冲液代替一抗）的对照组人脐静脉内皮细胞胞内无棕色颗粒（见图1b，c）。证实了从人脐静脉分离得到的细胞是内皮细胞。

2.2 高浓度的低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞中活性氧的影响 流式细胞仪检测结果显示，1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量（6.1±0.8）显著高于对照组人脐静脉内皮细胞内活性氧水平（2.6±0.3）（P < 0.05，n =3，见图2）。表明高浓度的低密度脂蛋白培养可以刺激人脐静脉内皮细胞产生大量的活性氧。

2.3 高浓度的低密度脂蛋白培养引起人脐静脉内皮细胞凋亡 流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示，与不加低密度脂蛋白的对照组相比，1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也明显增加[分别为(4.3±0.8)%，(19.7±1.9)%，P < 0.05，n =3]（见图3a）。Hoechst染色结果显示：对照组人脐静脉内皮细胞细胞核形态正常，而应用1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组部分细胞胞核出现染色质浓缩（见图3b）。这些结果表明，在高浓度的低密度脂蛋白培养条件下，内皮细胞内活性氧生成升高的同时，细胞凋亡发生率亦增加。

2.4 高浓度的低密度脂蛋白培养上调人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶4的表达水平 用反转录－聚合酶链反应检测不同浓度（0.8，1.6，2.4 g/L）低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间（12，24和48 h）时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化，结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比，各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强（见图4，图5）。结果表明，高浓度的低密度脂蛋白培养通过上调人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶4的表达水平，增加活性氧的生成，引起细胞凋亡。

3 讨论

虽然动脉粥样硬化是以细胞增殖为主的血管性疾病，但近年来研究发现在动脉粥样斑块中，细胞凋亡现象亦很常见，其中包括内皮细胞的凋亡。许多因素都可以通过激活不同的信号途径而致细胞凋亡，内皮细胞凋亡的信号传递通路主要有：①Fas/FasL/caspase死亡途径。②肿瘤坏死因子α介导的内皮细胞凋亡。③细胞色素C途径。正常情况下，内皮细胞也产生少量活性氧作为信号分子，维持着细胞的生长、发育等功能。细胞内活性氧对细胞的生长调控具有双重性，其作用与浓度有关:低浓度活性氧可以促进细胞生长，而浓度过高则可诱导细胞凋亡[2-3]。
研究发现，NADPH氧化酶是内皮细胞受到刺激时活性氧产生的主要来源，它主要有5个同工酶，分别命名为NADPH氧化酶1、NADPH氧化酶2、NADPH氧化酶3、NADPH氧化酶4和NADPH氧化酶5，内皮细胞主要表达其中的NADPH氧化酶4。Sorescu等[2]应用定量聚合酶链反应检测了内皮细胞中各种NADPH氧化酶 mRNA的表达，发现NADPH氧化酶4表达水平比NADPH氧化酶2高20多倍[4]。Tetsuro等[3]发现在人脐静脉内皮细胞中主要表达NADPH氧化酶4 mRNA，用反义核酸技术抑制NADPH氧化酶4的表达能显著地降低内皮细胞中活性氧的生成，从而推测NADPH氧化酶4可能参与了内皮细胞内活性氧的生成。作者以前的研究已经证实在人脐静脉内皮细胞中转染NADPH氧化酶4表达质粒使NADPH氧化酶4过表达能促进内皮细胞的凋亡和活性氧的生成[5]。为进一步明确NADPH氧化酶4与细胞凋亡的关系，作者观察高浓度的低密度脂蛋白对内皮细胞凋亡、NADPH氧化酶4表达水平和活性氧生成的影响，结果表明：1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h后能促进内皮细胞凋亡、活性氧生成和NADPH氧化酶4表达，与对照组（不加低密度脂蛋白组）相比有显著性差异。这表明NADPH氧化酶4可能在高低密度脂蛋白诱导活性氧生成和内皮细胞凋亡的过程中起了重要的促进作用。有研究表明当低密度脂蛋白穿过内皮细胞层时，由活化的NADPH氧化酶产生的活性氧与低密度脂蛋白相互作用而引起低密度脂蛋白的氧化，由此产生的氧化低密度脂蛋白可能是泡沫细胞吞噬的氧化低密度脂蛋白的主要来源。Thum等[6]发现氧化低密度脂蛋白可通过激活人冠状动脉内皮细胞中NADPH氧化酶4而促进活性氧生成。Aikawa等[7]发现当血液中脂类水平增高时，兔子的颈总动脉斑块中的氧化应激水平增高，血管细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1增多；低脂的兔子颈总动脉内皮细胞氧化应激水平、血管细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1低下，一氧化氮合酶活性增强[8-11]。因此，推断高浓度的低密度脂蛋白可能通过活化NADPH氧化酶4而生成的过多的活性氧，过多的活性氧又能氧化低密度脂蛋白；而氧化的低密度脂蛋白又能促进NADPH氧化酶4的进一步活化，进而形成正反馈循环，最后导致内皮细胞凋亡[12]。
但有学者却研究发现抑制人类胰腺癌细胞系MIA PaCa-2中NADPH氧化酶4表达后能显著降低细胞内活性氧的生成并促进细胞凋亡[13-14]，Lassegue等[15]发现高血管紧张素Ⅱ使鼠血管平滑肌细胞内活性氧生成增加的同时能上调NADPH氧化酶1的表达且下调NADPH氧化酶4表达，这可能是由于NADPH氧化酶4在不同类型的细胞中作用不同，也可能是其他NADPH氧化酶如NADPH氧化酶2、p22phox和p47phox等共同参与了细胞活性氧的生成。细胞内活性氧可通过损伤线粒体和细胞膜而促进细胞凋亡。由于NADPH氧化酶是多亚单位酶复合体，目前已发现它至少由5个亚单位构成(胞膜成分gp91phox和p22phox；胞浆成分p47phox、p67phox及小的GTP结合蛋白rac)，因此，NADPH氧化酶4也可能与其他亚单位共同参与了内皮细胞活性氧生成和凋亡,其机制有待进一步探讨[16-20]。

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