过氧化氢体外诱导人血管内皮细胞损伤与人参皂苷Rb1的保护效应★

何胜虎，张晶

课题背景：人参皂甙Rb1作为人参的主要有效成分，具有多方面的生物学活性，不仅有利于使机体功能正常化和抗衰老，而且具有抗自由基作用，对心血管系统内皮细胞损伤具有有益的修复作用。

应用要点：①人参皂苷目前在整体动物模型上研究较多,而在细胞损伤模型上研究甚少。②实验选用过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞损伤4 h内的急性损伤,与冠心病、高血压病、经皮冠状动脉介入术后再狭窄等病理演变的始动环节吻合。③实验结果显示，在一定的浓度范围内，人参皂甙Rb1能够有效地对抗氧自由基对人脐静脉内皮细胞细胞增殖的抑制作用，保护细胞免于损伤和死亡。

同行评价：文章观察人参皂苷Rb1对过氧化氢体外诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。结论为人参皂苷Rb1对氧化损伤的内皮细胞具有保护作用，其作用机制可能与保护了细胞的线粒体，提高了该细胞的抗氧化酶活性，上调了血管内皮生长因子的表达有关。有一定的应用意义。

何胜虎★，男，1963年生，安徽省枞阳县人，汉族，2000年南京医科大学毕业，硕士，主任医师，副教授，硕士生导师，主要从事介入心脏病学的研究。
sbhsh@medical
.com.cn

摘要
目的: 内皮细胞损伤可以导致心血管疾病及经皮冠状动脉介入术后再狭窄的发生。实验以过氧化氢（H2O2）体外诱导的人脐静脉损伤内皮细胞为对象，观察人参皂苷Rb1的保护作用，并探讨其可能的作用途径。
方法：实验于2006-09/11在扬州大学医学院中西医结合肿瘤研究所完成。①实验材料：人脐静脉血管内皮细胞（武汉大学培养物保存中心）；人参皂苷Rb1(含量>95%，HPLC；由吉林大学化学学院提供)。②实验过程及分组：在体外培养的人脐静脉内皮细胞上建立H2O2损伤模型，实验分为正常对照组； H2O2损伤对照组：在培养基中加入2 mmol/L的H2O2诱导损伤4 h；人参皂苷Rb1 50，100，200 μmol/L组：分别在培养基中先加入终浓度为50，100，200 μmol/L的人参皂苷Rb1孵育24 h，再加入相同的H2O2诱导损伤。试验重复6次。③实验评估：采用四甲基偶氮唑盐比色法测定各组细胞活力；硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量；黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性；酶联免疫吸附法检测血管内皮生长因子蛋白表达。
结果：①与损伤对照组比较，不同剂量组人参皂苷Rb1可以提高H2O2诱导损伤的人脐静脉内皮细胞活性（P < 0.01），并随着浓度的增高，细胞活力（A值）也增高，呈一定的剂量相关性。②与损伤对照组比较，不同剂量组人参皂苷Rb1可以降低H2O2诱导损伤的人脐静脉内皮细胞丙二醛含量、增加超氧化物歧化酶活性，随着浓度的增高，丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶活性升高呈一定的剂量相关性。③与损伤对照组比较，不同剂量组人参皂苷Rb1可以促进H2O2诱导损伤的人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子蛋白的分泌，且随着人参皂苷Rb1浓度的增高，血管内皮生长因子蛋白表达也增高，呈一定的剂量相关性。
结论：人参皂苷Rb1对氧化损伤的内皮细胞具有保护作用，其作用途径可能与保护了细胞的线粒体，提高了该细胞的抗氧化酶活性，上调了血管内皮生长因子的表达有关。
关键词：内皮，血管/细胞学；人参皂甙；丙二醛；超氧化物歧化酶；血管内皮生长因子类

何胜虎，张晶．过氧化氢体外诱导人血管内皮细胞损伤与人参皂苷Rb1的保护效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):254-257 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-254(ps).pdf]

中图分类号:R329.2
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)02-00254-04

Protective effects of Panaxsaponin Rb1 on hydrogen peroxide-induced injury in human umbilical vein endothelial cells in vitro

AIM:The damage of endothelial cells can induce cardiovascular disease and restenosis after percutaneous coronary intervention. In this study, the protective effects of Panaxsaponin Rb1 on hydrogen peroxide (H2O2)-induced injury in human umbilical vein endothelial cells were investigated, and its possible mechanism of action was explored.
METHODS: This experiment was performed in the Integrated Chinese and Western Medicine of Tumor Research Institute, Medicine College of Yangzhou University from September to November 2006. ①Human umbilical vein endothelial cells (Wuhan University Culture Conservation Center) were cultured in vitro and injured by H2O2. They were divided into normal control group, H2O2 injury control group (2 mmol/L H2O2 for 4 hours), Panaxsaponin Rb1 50, 100, and 200 μmol/L groups, in which the cells were injured by H2O2 for 4 hours after they were incubated with different dosages of Panaxsaponin Rb1 (content > 95%, high performance liquid chromatography; provided by Chemistry College, Jilin University). The experiment was repeated for 6 times. ②Cells activity was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), malondialdehyde (MDA) by thiobarbituric acid methods, the activity of superoxide dismutase (SOD) by xanthine oxidase methods and the expression of vascular endothelial growth factor by enzyme linked immunosorbent assay.
RESULTS: ①Panaxsaponin Rb1 at different dosages could improve the cell activity compared with injury control (P < 0.01), and cell activity (A value) was increased with the concentration to some extent. ②Panaxsaponin Rb1 at different dosages could depress the content of MDA and improve the activity of SOD compared with injury control group, both of which were depended on the concentration of Panaxsaponin Rb1. ③Compared with injury control group, Panaxsaponin Rb1 at different dosages could improve the protein secretion of vascular endothelial growth factor, which was increased with the concentration of Panaxsaponin Rb1.
CONCLUSION: The findings demonstrate that Panaxsaponin Rb1 displays a protective action on H2O2-induced injury in human umbilical vein endothelial cells. Its effect of action may be related to the protection to cell chondriosome, improvement in the antioxidase activity of cells, and up-regulation of the expression of vascular endothelial growth factor.

He SH, Zhang J.Protective effects of Panaxsaponin Rb1 on hydrogen peroxide-induced injury in human umbilical vein endothelial cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):254-257(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-254(ps).pdf]

内皮细胞损伤是冠心病、原发性高血压、经皮冠状动脉介入术后再狭窄等主要机制之一，对其损伤保护作用的研究是目前的热点。人参皂苷作为人参中的主要有效成分，试验证明具有扩张血管、改善微循环、抗氧化、清除氧自由基等多种药理作用[1-2]，但目前这方面的研究大多采用整体动物模型，易受神经、体液因素的影响[3-4]。本实验采用过氧化氢（H2O2）体外诱导人脐静脉内皮细胞损伤，建立人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型，观察人参皂苷Rb1人参皂苷中含量最高的一种单体)对其的保护作用，并探讨其可能作用机制。

设计：分组设计、对比观察。
单位：江苏省扬州大学医学院。
材料：实验于2006-09/11在扬州大学医学院中西医结合肿瘤研究所完成。人脐静脉血管内皮细胞（武汉大学培养物保存中心）；DMEM培养基（美国GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程研究所）；丙二醛、超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；人血管内皮生长因子酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉博士德公司）；人参皂苷Rb1（含量 > 95%，HPLC，由吉林大学化学学院提供）；CO2恒温培养箱（Heraeus公司）；倒置相差显微镜（德国Olympus公司）；酶联免疫检测仪（芬兰雷勃公司）；752紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者；实施、评估为第二和第一作者，接受过培训。
技术路线：
血管内皮细胞的培养：冻存的人脐静脉内皮细胞复苏后，用含体积分数为0.1的小牛血清的DMEM细胞培养液接种于细胞培养瓶中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2、0.95空气、饱和湿度培养箱中培养；3~5 d后，细胞生长融合成单层，细胞密度达1×108 L-1，倾去培养液，用磷酸盐缓冲液洗两三遍，换新细胞培养液继续培养；两三天后，细胞生长融合成致密单层，密度可达1×1010 L-1，倾去培养液，用2.5 g/L胰蛋白酶与2 g/L乙二胺四乙酸二钠等量混合消化，以1∶2或1∶3传代培养，实验采用生长融合成单层的内皮细胞。
实验分组：实验分为：①正常对照组。②H2O2损伤模型组：在培养基中加入2 mmol/L的H2O2诱导损伤4 h。③人参皂苷Rb1低剂量组：在培养基中先加入终浓度为50 μmol/L的人参皂苷Rb1孵育24 h，再加入相同的H2O2诱导损伤。④人参皂苷Rb1中浓度组：在培养基中先加入终浓度为100 μmol/L的人参皂苷Rb1孵育24 h，再加入相同的H2O2诱导损伤。⑤人参皂苷Rb1高浓度组：在培养基中先加入终浓度为200 μmol/L的人参皂苷Rb1孵育24 h，再加入相同的H2O2诱导损伤；试验重复6次。
四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞活力：细胞终止培养后，每孔加入5 g/L四甲基偶氮唑盐20 μL，孵育4 h后吸出上清，加入二甲基亚砜150 μL/孔，摇床孵育30 min使其充分反应后，在酶标仪490 nm处读出吸光值（A）。
考马斯亮蓝染色测定细胞蛋白含量：细胞终止培养后，计数留取约1×105个细胞，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，反复冻融破碎，使细胞裂解。取3.0 mL考马斯亮蓝染液与100 μL细胞裂解液混匀，放置10 min。用可见光分度计在595 nm波长处测定溶液的吸光值。以溶剂为空白对照组，以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线。
硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量：操作步骤按丙二醛测定试剂盒说明进行，取样量为100 μL，于532 nm处测定细胞冷冻裂解液的A值，结合所测定的细胞蛋白含量，计算细胞丙二醛含量。
嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性：操作步骤按超氧化物歧化酶测定试剂盒说明进行，取样量为75 μL，于550 nm处测定细胞冷冻裂解液的A值，结合所测定的细胞蛋白含量，通过公式计算细胞超氧化物歧化酶活性。细胞冷冻裂解液超氧化物歧化酶活性定义为每毫克蛋白(mgProtein)在1 mL反应液中超氧化物歧化酶抑制率达50%时所对应的超氧化物歧化酶量为一个超氧化物歧化酶活力单位(16.67 nkat)。
酶联免疫吸附法检测血管内皮生长因子蛋白表达：操作步骤按试剂盒说明进行，取细胞培养液，1 500 r/m离心，10 min后收集上清，1∶1稀释后进行反应，结合标准曲线，算出血管内皮生长因子表达含量。
主要观察指标：①人参皂苷Rb1对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞活性的影响。②人参皂苷Rb1对人脐静脉内皮细胞丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性的影响。③人参皂苷Rb1对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子蛋白表达的影响。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0统计分析软件进行处理，数据以_x±s表示，组间比较用F检验，以P < 0.05作为差别有显著性意义。

2.1 人参皂苷Rb1对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞活性的影响见表1。

H2O2损伤对照组细胞活力（A值）明显低于正常对照组(P < 0.01)。人参皂苷Rb13个浓度组均高于损伤对照组 (P < 0.01)，并随着浓度的增高，细胞活力（A值）也增高。
2.2 人参皂苷Rb1对人脐静脉内皮细胞丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性的影响见表2。

与正常对照组比较，2 mmol/L的H2O2作用人脐静脉内皮细胞4 h后，其丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶活性减少（P < 0.01）。与损伤对照组比较，人参皂苷Rb1 50，100，200 μmol/L 3个剂量组丙二醛含量降低（P < 0.01）；人参皂苷Rb1 100，200 μmol/L组超氧化物歧化酶活性升高（P < 0.01）。人参皂苷Rb1 3个浓度组随着浓度的增高，丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶活性升高。
2.3 人参皂苷Rb1对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子蛋白表达的影响见表3。

与正常对照组比较，2 mmol /L的H2O2作用人脐静脉内皮细胞4 h后，由于大部分细胞受到了破坏，故血管内皮生长因子蛋白表达总量下降（P < 0.01）。与损伤对照组比较，人参皂苷Rb1 50，100，200 μmol/L 3个剂量组血管内皮生长因子蛋白表达上调（P < 0.01）；且随着人参皂苷Rb1浓度的增高，血管内皮生长因子蛋白表达也增高。

内皮细胞的损伤不仅可以促进血管局部血栓的形成，还可释放血管紧张素转换酶、内皮素、5-羟色胺、生长因子、细胞因子、黏附分子等血管活性分子，促进血管的收缩，进而启动和引起一系列损伤后反应，导致心血管疾病（冠心病、高血压等）以及经皮冠脉介入术后再狭窄的发生 [5-6]。因此，对即将受损的内皮细胞施加保护作用具有重要意义。内皮细胞的活化和损伤主要包括脂多糖、炎症介质、自由基等，这些因素作用于内皮细胞可直接引起功能障碍加重白细胞介导的炎症病理损伤。H2O2是一类活性氧，它不仅能直接氧化细胞膜上的脂质及蛋白，而且能自由穿过细胞膜和细胞内铁离子反应生成活性更强的自由基，导致系列反应。本实验选用了2 mmol/L H2O2诱导损伤4 h，使内皮细胞处于尚能保护的自由基环境，保证了实验的可行性，与某些文献报道的浓度基本吻合[7]。
四甲基偶氮唑盐参与活细胞线粒体的能量代谢，它仅被活细胞线粒体腺苷三磷酸分解，而不进行线粒体代谢的死细胞不能将四甲基偶氮唑盐代谢形成蓝色的formazan结晶。因此，该结晶的形成量反映了线粒体的
代谢活力[8]，又能间接反映细胞的增殖和存活情况。本实验发现，H2O2使人脐静脉内皮细胞结晶形成量减少，而预先加入人参皂苷Rb1可随浓度促进结晶的形成，说明该药具有抗H2O2诱导的内皮细胞损伤的作用，推测可能由于保护了人脐静脉内皮细胞的线粒体所致。
氧自由基诱导细胞及组织损伤重要的机制是使生物膜中的多不饱和脂肪酸过氧化，产生脂质过氧化物，脂质过氧化物可以与邻近的多不饱和脂肪酸发生连锁反应。细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸和脂肪酸的不饱和双键，极易受到OFR的攻击，导致脂质过氧化反应，激起自由基链锁和增殖反应，形成一系列的脂质自由基及其降解产物丙二醛，引起膜流动性、通透性和完整性破坏，进而使其双层结构发生断裂，破坏细胞膜。因而，测试丙二醛含量可以反映机体脂质过氧化的程度，并间接反映出细胞损伤的程度。机体内存在抗氧化系统包括酶系统和非酶系统，而超氧化物歧化酶是抗氧化酶系统的重要组成部分[9-10]，也是机体内清除自由基的第一线防卫，主要清除O2-，催化其发生歧化反应，从而阻断和防止其所引发的一系列自由基链式反应的加剧，抑制脂质过氧化反应。超氧化物歧化酶活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力。本实验发现，H2O2提高了人脐静脉内皮细胞的丙二醛含量，降低了超氧化物歧化酶活性，而预先加入人参皂苷Rb1可随浓度降低丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活性。
血管内皮生长因子最早在牛垂体的腺泡细胞中发现并提取，是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外可促进血管内皮细胞的生长，在体内可诱导血管发生。这种作用主要是通过血管内皮生长因子对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用而实现的[11]。血管内皮生长因子对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶C 短暂地诱导Ca2+ 而发生的。研究发现血管损伤早期，血管内皮生长因子诱导内皮细胞产生组织因子和基质金属蛋白酶，使凝血因子Ⅱ转化为凝血酶，从而激活明胶酶原A 降解原来的基膜，使细胞增生[12-15]。本实验发现，模型组分泌的血管内皮生长因子小于对照组，有统计学差异，推测可能是虽然在H2O2氧化损伤刺激下，单个细胞分泌血管内皮生长因子是增加的，但由于细胞总量大量减少，大部分细胞都坏死，所以分泌的血管内皮生长因子总量是减少的，而加入人参皂苷Rb1则进一步促进了血管内皮生长因子的分泌，且在一定范围内浓度依赖。
皂甙是一种具有特异性质的糖配体，人参皂甙Rb1作为人参的主要有效成分，具有多方面的生物学活性，不仅有利于使机体功能正常化和抗衰老[16]，而且具有抗自由基作用[17]，对心血管系统的有益作用也是目前研究的热点[18-20]。本实验显示，在一定的浓度范围内，人参皂甙Rb1能够有效地对抗氧自由基对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用，保护细胞免于损伤和死亡。初步推测其机制可能与保护细胞的线粒体，提高细胞抗氧化酶活性和血管内皮生长因子的表达有关。当然，若需完全明确其机制，仍需进行更深入的研究。

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