人组织因子基因RNAi载体pENTRTM/U6-TF-shRNA的构建与鉴定☆

唐雯1，2，庄思齐2，杨红玲3，熊石龙3，孙学刚4，封志纯1

课题背景：本课题得到了国家自然科学基金资助项目（30440065、30572082）、北京市自然科学基金资助项目（7052059）和湖南省医药卫生科研基金（B2006-101）的资助。课题开展了血管内皮细胞损伤过程中NADPH氧化酶基因表达图谱的分析，分析活性氧的产生及其对内皮细胞损伤的影响。

同行评价：文章设计、合成shRNA序列，成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNAi载体，拟通过瞬时关闭组织因子途径中组织因子的表达，达到阻止凝血过程的启动，减少凝血因子和血小板的消耗，从而防止胎盘早剥对新生儿凝血功能的影响，具有一定的临床实用意义。

偏倚和不足：目前仅对影响凝血的组织因子进行了干预方面的实验，未对其他的凝血因素如胎盘蛋白5、蛋白C、血栓调节素等进行全面的观察，而这些因素与凝血都有关系，本文作为一个初步的探索，下一步将对其他的因子进行研究。

1北京八一儿童医院，北京市 100700； 2中山大学附属第一医院儿科, 广东省广州市 510080； 3南方医科大学南方医院检验医学中心，广东省广州市 510515；4南方医科大学中医药学院中医症候实验室，广东省广州市 510515

唐雯☆，女，重庆市人，汉族，博士，副主任医师，主要从事儿科危重症方面的研究。
tangwenr@21cn.com

通讯作者：封志纯，硕士，主任医师，博士生导师，北京八一儿童医院，北京市
100700
zhjfengzc@126.com

摘要
目的： RNAi效应与基因转移有密切关系。拟通过构建组织因子基因RNAi载体，为达到阻止凝血过程的启动打下基础。
方法：实验于2006-11/2007-05在南方医科大学中医药学院中医症候实验室完成。利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因（NM_001993）干扰片段，合成shRNA序列，再行寡核苷酸双链的合成，退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，连接产物转化到感受态细胞，增菌，质粒感受态扩增，质粒DNA小提、测序。
结果：合成的寡核苷酸双链退火处理后，经4%琼脂糖凝胶电泳，紫外观察可见ds oligo和ss oligo清晰可见，双链寡核苷酸与pENTRTM/U6的连接反应，转化到质粒感受态扩增后，提取得到的质粒DNA经过测序结果证实pENTRTM/U6- TF-shRNA为阳性克隆。
结论：成功构建出凝血途径的人组织因子基因pENTRTM/U6- TF-shRNA载体，为研究组织因子基因RNAi载体在出凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞工具。
关键词：组织因子；RNAi载体；凝血

唐雯，庄思齐，杨红玲，熊石龙，孙学刚，封志纯.人组织因子基因RNAi载体pENTRTM/U6-TF-shRNA的构建与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):258-261 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-258(ps).pdf]

Construction and identification of RNAi vector pENTRTM/U6-TF-shRNA vector on human tissue factor

AIM:The damage of endothelial cells can induce cardiovascular disease and restenosis after percutaneous coronary intervention. In this study, the protective effects of Panaxsaponin Rb1 on hydrogen peroxide (H2O2)-induced injury in human umbilical vein endothelial cells were investigated, and its possible mechanism of action was explored.
METHODS: This experiment was performed in the Integrated Chinese and Western Medicine of Tumor Research Institute, Medicine College of Yangzhou University from September to November 2006. ①Human umbilical vein endothelial cells (Wuhan University Culture Conservation Center) were cultured in vitro and injured by H2O2. They were divided into normal control group, H2O2 injury control group (2 mmol/L H2O2 for 4 hours), Panaxsaponin Rb1 50, 100, and 200 μmol/L groups, in which the cells were injured by H2O2 for 4 hours after they were incubated with different dosages of Panaxsaponin Rb1 (content > 95%, high performance liquid chromatography; provided by Chemistry College, Jilin University). The experiment was repeated for 6 times. ②Cells activity was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), malondialdehyde (MDA) by thiobarbituric acid methods, the activity of superoxide dismutase (SOD) by xanthine oxidase methods and the expression of vascular endothelial growth factor by enzyme linked immunosorbent assay.
RESULTS: ①Panaxsaponin Rb1 at different dosages could improve the cell activity compared with injury control (P < 0.01), and cell activity (A value) was increased with the concentration to some extent. ②Panaxsaponin Rb1 at different dosages could depress the content of MDA and improve the activity of SOD compared with injury control group, both of which were depended on the concentration of Panaxsaponin Rb1. ③Compared with injury control group, Panaxsaponin Rb1 at different dosages could improve the protein secretion of vascular endothelial growth factor, which was increased with the concentration of Panaxsaponin Rb1.
CONCLUSION: The findings demonstrate that Panaxsaponin Rb1 displays a protective action on H2O2-induced injury in human umbilical vein endothelial cells. Its effect of action may be related to the protection to cell chondriosome, improvement in the antioxidase activity of cells, and up-regulation of the expression of vascular endothelial growth factor.

He SH, Zhang J.Protective effects of Panaxsaponin Rb1 on hydrogen peroxide-induced injury in human umbilical vein endothelial cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):254-257(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-254(ps).pdf]

体内的凝血过程由外源性凝血途径和内源性凝血途径构成，目前研究主要是由外源性凝血途径介导，而组织因子作为外源性凝血途径的启动因子，与许多疾病包括产科性胎盘出血对新生儿凝血系统的影响有着密切关系[1-2]。
在治疗凝血性疾病时，通过瞬时关闭组织因子途径中组织因子的表达，达到阻止凝血过程的启动，减少凝血因子和血小板的消耗，从而防止胎盘性产科出血对新生儿凝血功能的影响，具有重要意义。RNAi (RNA interference, RNAi)是一种可高效、特异地下调目标基因的表达并在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔的应用前景的技术[3]。然而，RNAi效应与基因转移效率有密切关系。实现这个目标，首先须构建干扰载体。本实验建立组织因子基因干扰载体系统，为达到阻止凝血过程的启动打下基础。

设计：观察性实验。
单位：中山大学附属第一医院儿科，南方医科大学中医药学院中医症候实验室，北京八一儿童医院。
材料：实验于2006-11/2007-05在南方医科大学中医药学院中医症候实验室完成。
BLOCK-iTTM U6 RNAi Entry Vector试剂盒购自Invitrogen公司；组织因子基因干扰片段利用Invitrogen网站上的免费软件设计由上海生工生物工程有限公司合成； RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；质粒Midi抽提试剂盒购自Qiagen公司；Gene Juice Transfection Reagent 购自Novagen公司。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二、三、四、六作者，资料收集为第一作者，实施为第一、四作者，评估为第三、五作者，评估采用单盲法。
方法：
人组织因子基因RNAi pENTRTM/U6载体的设计与合成：根据网站（https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）提供的免费软件设计2个组织因子基因（NM_001993）的特异性干扰片段[4]（表1），GC含量在40%~55%，在Genbank数据库进行BLAST分析其与其他基因的同源性。在干扰片段上游链(Top strand)的5’端加上CACC四个碱基，在下游链(Bottom Strand)的5’端加上AAAA四个碱基，环（loop）的结构为-CGAA。

双链寡核苷酸的合成：分别将Top链和Bottom链稀释成200 μmol/L，在一个0.5 mL的无菌Ep管中，室温顺序加入下列试剂： Top strand DNA oligo（200 μmol/L）5 μL，Bottom strand DNA oligo（200 μmol/L）5 μL，10×Oligo Annealing Buffer 2μL，加DNase/RNase-Free 水至20 μL。试剂混合后95 ℃ 孵育4 min，慢慢冷却至室温使之缓慢退火，合成双链寡核苷酸，此时合成的双链寡核苷酸浓度为50 μmol/L，用无DNase/RNase的水稀释双链寡核苷酸，终浓度为500 nmol/L 和5 nmol/L，取500 nmol/L的双链寡核苷酸进行4%琼脂糖电泳以检验退火的双链寡核苷酸的完整性。
连接：冰上溶解5 nmol/L的双链寡核苷酸，室温顺序加入下列物质：5×ligation Buffer 4 μL，pENTRTM/U6 (0.5 μg/L) 2 μL，ds oligo (5 nmol/L) 1 μL，DNase/RNase-free Water 12 μL，T4 DNA Ligase (1 U/μL) 1 μL，总体积 20 μL。反应物有一些黏稠，用枪头上下彻底混匀反应物，室温孵育2 h，将反应物放置在冰上，继续进行转化反应。
转化：转化前一天制备卡那霉素抗性的LB固体培养基（50 mg/L）。冰上溶解One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（感受态），将2 μL的连接反应物加入感受态菌中，轻柔混合，冰上放置30 min，热休克90 s，立即冰上放置2 min，加入250 μL S.O.C.细菌培养基，37 ℃，100 r/min温和振荡60 min，将50，100，150 μL的菌液平铺在预热的卡那霉素抗性的LB固体培养基中，37 ℃
孵育过夜。次日，挑取5个阳性克隆。转化的阳性对照PUC19质粒。阳性克隆鉴定:挑取的阳性克隆在卡那霉素抗性LB液体培养基中培养过夜，进行测序分析，测序使用U6前引物，序列为5’-GGA CTA TCA TAT GCT TAC CG-3’。根据测序结果选择正确的转化体。
主要观察指标：阳性克隆鉴定结果。

2.2 pENTRTM/U6 -shRNA/TF克隆测序门载体克隆pENTRTM/U6 - shRNA/TF送由上海生物工程有限公司测序，筛选阳性克隆。其部分测序结果，见图2，3。

组织因子，又称组织凝血活酶，或凝血因子Ⅲ，是惟一存在于血管外组织的凝血因子。组织因子是外源性凝血瀑布反应的始动因子，为跨膜糖蛋白，作为凝血因子Ⅶ/Ⅶa在细胞表面的受体和辅因子，也是体内最重要的、活性最强的促凝物质之一，近年来，随着对组织因子研究的深入，其在正常出凝血过程、血栓形成、血管再生、胚胎发育、肿瘤的转移和炎症反应中具有重要作用[5-8]。
组织因子是一种相对分子质量约47 000的跨膜糖蛋白，它与因子Ⅶ(FⅦ) 结合后将FⅦ转化为激活的因子Ⅶ( FⅦa) ，形成TF/FⅦa复合物，进而激活凝血因子Ⅹ( FⅩ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ) ，启动外源性凝血途径。生理情况下，与血液直接接触的细胞并不表达组织因子，但在败血症、损伤等情况下，内毒素、炎症因子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素1 等)和激活的补体成分(C5) 通过直接和间接方式诱导单核细胞与血管内皮细胞表达组织因子[9]，血浆组织因子水平明显增高，进而发生弥散性血管内凝血[6]。
RNAi是指dsRNA介导的序列特异的同源mRNA降解现象。这是从酵母到人类生物界广泛存在的一种现象，是生物体进化过程中保留下来的机体抵抗病毒双链RNA的细胞防御机制，也被称为机体的另外一套免疫系统[10]。最初在研究C.elegans线虫时，发现了这种现象并提出了dsRNA介导的基因沉默，奠定了RNAi技术发展的里程碑[11]。与反义技术、核酶技术以及抗体介导的基因沉默技术相比，RNAi技术具有如下特点[12]：①阻断效率高。在多酶复合体的参与下降解目标基因且具有放大效应。②靶基因表达更特异且无中和抗体。③抑制效应可垂直传递多个世代。④体外转染效率高且可稳定表达。⑤体内使用更安全可行（由于使用的浓度低，pmol）。⑥使用一种特定启动子载体就可能产生组织或细胞特异的基因靶向性。⑦可同时沉默多个基因或多个外显子，增加沉默效率。
RNAi技术的关键取决于dsRNA的形成，dsRNA的反意义链与靶基因的转录本互补。Dicer内切核酸酶将长链dsRNA切割成21~23nt的小干扰RNA（Small interfering RNAs，siRNA），诱导沉默复合物RISC利用siRNA引导序列特异的靶mRNA降解[13]。与其他基因沉默技术相比，RNAi技术具有高效、特异、无中和抗体等优点，在功能基因组学研究和基因治疗领域有广泛的应用前景。目前用于RNAi实验中制备siRNA的方法有很多，较为常用的5种制备的方法包括：化学合成法、体外转录法、长片断dsRNAs经RNase Ⅲ类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase Ⅲ)、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达，前面3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。以化学合成法最为常见，最近又发展为基于载体的策略[14-15]，也就是含有编码发夹结构RNA的茎环结构使细胞内产生类似siRNA的物质，由Dicer切割发夹RNA产生小的dsRNA来沉默与发夹RNA双链的一条链互补的转录子基因表达[16]。
组织因子的表达是凝血的起始环节，那么设想通过抑制组织因子的瞬时表达可以作为抗凝血的一种治疗手段。通过RNAi技术，以组织因子基因位点作为治疗的切入点，使组织因子基因瞬时或者较长时期沉默[17-18]，从而减少组织因子的表达，改善某些疾病时的高凝状态，如产科病理性胎盘出血、慢性弥漫性血管内凝血，还有就是冠心病、肿瘤等，从而改善出凝血疾病的病理过程达到治疗目的[19]。用pENTRTM作为载体，利用能够识别RNA多聚酶Ⅲ的U6启动子，合成RNA，从组织因子基因上选择了一个21个核苷酸的片断作为靶点，在干扰片段上游链的5’端加上CACC四个碱基，在下游链的5’端加上AAAA四个碱基，环为CGAA。将其插入到pENTRTM载体中，转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA。本文设计、合成shRNA序列，将形成的双链寡核苷酸双链克隆到pENTRTM/U6载体上，转化到感受态细胞，扩增后，质粒DNA小提、纯化，测序结果证实pENTRTM/U6-TF-shRNA为阳性克隆，成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNAi载体，为研究组织因子基因RNAi载体在出凝血疾病中的基因治疗方面的应用提供了稳定的转染细胞载体。

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