脂肪组织释放细胞因子脂联素的球状结构域对人乳腺癌细胞MDA-MB-231

脂肪组织释放细胞因子脂联素的球状结构域对人乳腺癌细胞MDA-MB-231
生长抑制及诱导凋亡的效应★

秦蕾1，2，桂律1，2

课题背景：脂联素和其球状结构域（gapM1）虽然是仅由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，但是在肥胖者及乳腺癌等患者体内，其血浆水平却低于正常，最近，流行病学研究发现，脂联素与某些肥胖相关的肿瘤发生呈直接负相关性，亦有文献报道，体外实验中，脂联素在生理浓度就能明显抑制肿瘤细胞的生长增殖活性。

应用要点：实验采用BrdU掺入实验、TUNEL、流式细胞仪检测方法，发现gapM1对人ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。提示，肥胖患者体内血脂联素和gapM1水平的降低是导致其肥胖相关肿瘤(乳腺癌)发病率升高的一个重要原因；提高肥胖者体内gapM1水平，可能降低其肥胖相关肿瘤(乳腺癌)的发生率。

同行评价：实验结果显示：采用低于脂联素生理浓度的gapM1作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231，可使细胞增殖明显受到抑制；其抑制作用有明显的浓度-效应依赖关系；并可改变细胞周期时相分布，随gapM1剂量升高，诱导细胞发生凋亡的作用增强。文章对肥胖患者乳腺癌的预防及治疗具有指导意义。

复旦大学，1附属金山医院病理科，2上海医学院病理学系，上海市
200032

秦蕾★，女，1979年生，山东省禹城市人，汉族，复旦大学附属金山医院在读硕士，主要从事肿瘤病理学研究。
flyingql@126.com

摘要
目的：脂联素作为一种脂肪组织释放的细胞因子，具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等生物学功能，脂联素球状结构域（gapM1）为其重要的功能结构域。最近研究发现，脂联素对恶性肿瘤细胞有一定的抑制作用。实验拟进一步讨论gapM1对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用及诱导凋亡作用。
方法：实验于2005-03/2006-03在复旦大学上海医学院病理实验室完成。①实验材料：gapM1购自R&D公司。②实验过程：选用人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行体外培养，不同剂量的gapM1 （0，0.5，2，8 mg/L）处理细胞48 h后，显微镜进行形态学观察。③评估：采用BrdU掺入法检测细胞增殖情况；采用TdT介导的dUTP末端标记法原位观察癌细胞凋亡，并计算平均凋亡指数；流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率。
结果：①倒置显微镜观察结果：不同剂量的gapM1作用MDA-MB-231 细胞后，未见明显的细胞形态学改变，但细胞收缩、脱落，细胞增殖明显受到抑制，且随浓度的增大，细胞数量减少。②BrdU掺入法检测结果：不同剂量的gapM1对细胞生长均有一定的抑制作用，且同一处理时相点各组间比较差异均有显著性( P < 0.05)。③TUNEL法检测结果：不同剂量的gapM1作用于MDA-MB-231细胞48 h，0.5，2，8 mg/L组细胞的凋亡率高于0 mg/L组( P < 0.05)。④流式细胞仪分析结果：gapM1作用MDA-MB-231细胞 48 h，G0~G1期细胞增多，S期细胞显著减少，细胞周期分布特点与药物浓度有关，随浓度增大，变化更加明显。同时可观察到细胞凋亡峰，细胞凋亡率也呈剂量依赖趋势。
结论：gapM1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。
关键词：脂联素；乳腺肿瘤；细胞周期；细胞增殖；细胞凋亡；组织构建

秦蕾，桂律.脂肪组织释放细胞因子脂联素的球状结构域对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长抑制及诱导凋亡的效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):266-270 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-266(ps).pdf]

中图分类号: R373.9
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)02-00266-05

Globular domain of adiponectin mediates antiproliferative and apoptotic responses in human breast cancer cell MDA-MB-231

AIM:Adiponectin, a kind of cytokine released by adipose tissue, has the biological functions to resist diabetes and artherosclerosis. Globular domain of adiponectin (gapM1) is an important functional domain of adiponectin. Recent studies have suggested that adiponectin inhibit malignant tumor cells to certain extent. This study investigated the effects of gapM1 on human breast cancer cell line MDA-MB-231.
METHODS: The experiment was conducted in the pathological laboratory of Fudan University Shanghai Medical College from March 2005 to March 2006. ①MDA-MB-231 cells were in vitro incubated with increasing concentration of gapM1 (0, 0.5, 2, and 8 mg/L, R&D company) for 48 hours. The morphous was observed by microscopy. ②The change in proliferation was determined by BrdU incorporation, and apoptotic cells were detected by TUNEL method. Mean apoptosis index was calculated and the distribution of cell cycles were examined with flow cytometry.
RESULTS: ①Inverted microscopic observation showed there was no typical morphological change in MDA-MB-231 cell incubated with increasing concentration of gapM1, but more detached cells appeared. Moreover, cell number was decreased with the increase in gapM1 concentration. ②BrdU incorporation assay suggested that the BrdU incorporation rate declined significantly and there were statistically differences among different groups at the same time (P < 0.05). ③TUNEL method indicated that after 48 hours of treatment with gapM1, the apoptosis rate of cancer cells in 0.5, 2, 8 mg/L groups were significantly increased compared with 0 mg/L group (P < 0.05). ④Flow cytometry analysis showed that gapM1 induced an increase in the cell cycle in G0-G1 phase, and an arrest in S phase. Cell cycle distribution was correlated with drug concentration. Meanwhile, the enhanced G1-S phase of cell cycle arrest was accompanied with the enhanced apoptotic peak.
CONCLUSION: gapM1 has the capabilities of inhibiting proliferation and inducing apoptosis in MDA-MB-231 cells in vitro.　　

Qin L, Gui L.Globular domain of adiponectin mediates antiproliferative and apoptotic responses in human breast cancer cell MDA-MB-231.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):266-270(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-266(ps).pdf]

近期的科学研究显示：脂肪组织不仅是一个被动的储存能量的器官，它还是一个调节机体内分泌、能量代谢及炎症的内分泌器官。脂肪组织可以分泌多种激素和细胞因子，这些分泌蛋白通称为脂肪细胞因子。脂联素[1](adiponectin，又名Acrp30，AdipoQ，apM-1，GBP28) 是近年来新发现的脂肪细胞因子，在血中有较高的浓度(5~30 mg/L)。虽然脂联素仅由脂肪细胞分泌，但肥胖者其血浆水平却降低，在糖尿病、冠状动脉疾病患者体内，其血浆水平也低于正常。脂联素全长由244个氨基酸组成，包含4 个结构域，从N 端到C 端依次为：信号序列、非同源序列、胶原样结构域、球状结构域。在体内循环时，脂联素以全长蛋白(adiponectin)和经蛋白酶水解成的C端球状结构域(gapM1)的形式存在，gapM1为该蛋白质的主要功能结构域，具有比全长脂联素更强的生物学活性。
流行病学资料显示在肥胖症患者及乳腺癌等患者体内[2-5]，某些脂肪细胞因子如瘦素、脂联素的含量与正常人存在一定的差别，体外细胞培养也证实了脂联素对恶性肿瘤细胞有一定的抑制作用[6-7]，因此脂肪细胞因子作为联系肥胖与肥胖相关肿瘤的一个中间因素越来越引起国内外研究者的关注。作者以体外培养的人乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞为观察对象，观察不同浓度gapM1对MDA-MB-231的生长抑制及诱导凋亡作用，为临床乳腺癌的治疗提供新的思路及可靠的理论依据。

设计：单一样本观察。
单位：复旦大学大学附属金山医院病理科，复旦大学上海医学院病理教研室。
材料：实验于2005-03/2006-03在复旦大学上海医学院病理实验室（BSL-2）完成。gapM1购自R&D公司。无菌操作技术下溶于DMEM培养液中，配成终浓度为150 g/L的储备液，用一次性无菌小滤器过滤除菌。实验时用培养基稀释至所需的浓度。BrdU为Sigma产品，TUNEL 试剂盒购自Roche公司。
设计、实施、评估者：设计、评估者为第二作者，实施者为第一作者。
技术路线：
细胞培养和处理：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中科院上海市细胞所，培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、饱和湿度、体积分数为0.05的CO2 的培养箱中，每三四天传代1次，gapM1处理细胞的终浓度分别为0，0.5，2，8 mg/L。
倒置显微镜观察细胞的形态变化：将细胞以1 ×105 个/皿接种于6 cm培养皿中，收集不同浓度gapM1处理48 h后的MDA-MB-231细胞，于倒置显微镜下进行观察，并拍照。
BrdU掺入法检测细胞增殖情况：将呈指数生长的细胞接种于置有盖玻片的6孔板中，至细胞密度50%融合时，以含体积分数为0.05的新生牛血清的DMEM静止细胞1 d，分别以不同的药物浓度的gapM1作用细胞48 h，各组于结束培养前2 h加入BrdU（终浓度为 30μg/L），37 ℃孵育2 h；弃培养液，磷酸盐缓冲液洗涤后，以75%甲醇醋酸[V（甲醇）∶V（醋酸）=3∶1]4 ℃固定30 min，磷酸盐缓冲液洗涤后以600 g/L的甲酰胺于 90 ℃作用5 min，磷酸盐缓冲液洗涤，加入鼠抗人BrdU 单克隆抗体(工作浓度1∶100，Sigma公司) 、羊抗鼠Cy3荧光抗体(工作浓度1∶300，Sigma公司) 、DAPI对比染色胞核、缓冲甘油封固、指甲油封固。在荧光显微镜下随机计数5个20 ×视野BrdU 标记的阳性细胞数及DAPI标记的总细胞数，计算BrdU阳性细胞百分数，实验重复3次。
TdT介导的duTP末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞：主要过程按试剂盒说明书进行。①将呈指数生长的细胞接种于6孔板，在不同浓度的gapM1作用下孵育48 h，收集细胞爬片。②细胞爬片使用磷酸盐缓冲液进行清洗，用新配制的40 g/L多聚甲醛（pH 7.4）室温固定15~30 min，然后使用磷酸盐缓冲液清洗固定细胞。③室温下使用体积分数为0.03的H2O2甲醇处理细胞15~30 min。④使用磷酸盐缓冲液清洗细胞后，再使用0.1%TritonX-100 100μL冰上反应2 min，磷酸盐缓冲液清洗细胞。⑤把预先配制好后冰冷放置的反应液50μL（TdT Enzyme 5μL+Labeling Safe Buffer 45μL）加在爬片上，在保湿箱中37 ℃反应60 min，磷酸盐缓冲液终止反应。⑥使用荧光显微镜观察细胞染色情况并计数。
流式细胞仪检测细胞周期分布、细胞凋亡率：将细胞以1 ×105 个/皿接种于6 cm培养皿中，收集不同浓度gapM1处理48 h的MDA-MB-231细胞，分别用磷酸盐缓冲液离心洗涤2遍，用体积分数为0.7的冷乙醇(4 ℃)固定细胞， RNase酶消化，PI染色，采用流式细胞仪对细胞的DNA进行定量分析，再结合计算机软件计算出细胞周期的时相分布和凋亡率。
主要观察指标：①gapM1对MDA-MB-231细胞形态学影响。②gapM1对MDA-MB-231细胞增殖的影响。③TUNEL法检测细胞凋亡情况。④gapM1对MDA-MB-231细胞周期分布和细胞凋亡的影响。
统计学分析：计量资料数据用_x±s表示，应用SPSS 11.0统计软件对所有数据进行统计处理：实验组与对照组比较采用配对t检验，实验组的比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性；P < 0.01为差异有极显著性。

2.1 gapM1对MDA-MB-231细胞形态学影响对照组中，MDA-MB-231细胞呈多角、长形，贴壁生长，gapM1作用MDA-MB-231 细胞后，显微镜下未见明显的细胞形态学改变，但细胞收缩，脱落，贴壁细胞逐渐减少，细胞增殖明显受到抑制，且随浓度的增大，细胞数逐渐减少。见图1。
2.2 gapM1对MDA-MB-231细胞增殖的影响 0.5，2，8 mg/L gapM1处理细胞48 h，BrdU阳性细胞百分数分别为(24.4±2.1) % ，( 19.1±2.4) %和( 15.1±2.7) %，均明显低于对照组（31.1±2.5） %，且同一时相点各组间比较，差异均有显著性( P < 0.05) 。可见，随着gapM1浓度的增大，其对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用逐渐增大。即gapM1对MDA-MB-231 细胞的增殖抑制作用有明显的浓度-效应依赖关系。见图2。

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡情况不同浓度的gapM1作用于MDA-MB-231细胞48 h，0.5，2，8 mg/L组细胞的凋亡率明显高于0 mg/L组，差异有显著性( P < 0.05)，提示gapM1可诱导MDA-MB-231细胞凋亡。见图3，4。

2.4 gapM1对MDA-MB-231细胞周期分布和细胞凋亡的影响流式细胞仪分析显示，gapM1作用MDA-MB-231细胞48 h，G0~G1 期细胞增多，S期细胞显著减少。细胞周期分布特点与药物浓度有关。随浓度增大，变化更加明显。同时可观察到细胞凋亡峰、细胞凋亡率也呈剂量依赖趋势。见图5，6。

脂联素是由脂肪细胞合成并分泌的脂肪细胞因子[8-10]。在机体内参与能量代谢、炎症反应等重要的生理过程。与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的发病密切相关。体外实验证明脂联素可以降低高血糖动物模型的血糖水平，并改善其胰岛素抵抗状态[11-13]。同时脂联素和gapM1可以刺激骨骼肌脂肪酸的β氧化，从而降低血脂水平[14-15]。
流行病学研究发现，脂联素与某些肥胖相关的肿瘤，如乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、大肠癌等的发
生呈直接负相关性[16]，亦有文献报道，脂联素在生理浓度就能明显抑制肿瘤细胞的生长增殖活性[17-18]。Takahata等[19]研究了100例乳腺癌患者和100例健康对照者，并培养了4株乳腺癌细胞和1株正常的乳腺上皮细胞，结果发现，在乳腺癌组织上皮细胞、正常乳腺组织上皮细胞、患者及对照者腋窝脂肪组织中，4株乳腺癌细胞及正常的乳腺上皮细胞中均有AdipoR1和AdipoR2 mRNA的表达，而只有腋窝脂肪组织中有脂联素mRNA的表达，由此证实，脂联素及gapM1是由脂肪组织分泌的，其抗肿瘤作用可能是通过与细胞表面的AdipoR1和 AdipoR2结合实现的，而且不存在自分泌的调控方式，但其细胞内的作用机制还不清楚。Takahata等[19]发现AdipoR1和 AdipoR2 mRNA的表达水平在正常的乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞中差异不大，无统计学意义。因此可以说，肥胖症患者脂联素及gapM1水平的下调在其乳腺癌发病率增高中所起的作用要大于其受体水平的下调所起的作用。
Marie-Noelle等[18]报道，脂联素可以抑制乳腺癌细胞株MCF7的生长并诱导其凋亡。他们发现，乳腺癌细胞株MCF7表面有AdipoR1和AdipoR2的表达，且通过实验证实，脂联素作用于乳腺癌细胞株MCF7后， AMPK磷酸化水平增高，推测脂联素可能通过与受体结合，活化AMPK信号通路，进而发挥生物学作用，而且文献报道，AMPK信号通路的活化可以诱导细胞凋亡[20]。文献进一步以免疫组织化学的方法，证实了AdipoR1和 AdipoR2蛋白在乳腺癌组织中的表达[21]。
本实验中采用明显低于脂联素生理浓度的gapM1作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231，可观察到MDA-MB-231细胞收缩、脱落，贴壁细胞逐渐减少，细胞增殖明显受到抑制，且随浓度的增大，细胞数逐渐减少。体外BrdU掺入实验证实：gapM1可明显抑制MDA-MB-231 细胞的增殖，且gapM1对MDA-MB-231 细胞的增殖抑制作用有明显的浓度-效应依赖关系。采用流式细胞仪观察到gapM1改变了细胞周期时相的分布，使G0~G1 期细胞增多，S期细胞减少，阻滞细胞于G1~S期。采用流式细胞仪及TUNEL还观察到了gapM1在诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡方面的作用，发现gapM1能够诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡，且随gapM1剂量升高，诱导细胞发生凋亡的作用增强。以上结果表明gapM1具有直接抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导凋亡作用。提示肥胖患者体内血浆脂联素和gapM1水平的降低，是导致其肥胖相关肿瘤(乳腺癌)发病率升高的一个重要原因；提高肥胖者体内gapM1水平，可能降低其肥胖相关肿瘤(乳腺癌)的发生率，为肥胖患者乳腺癌的预防及治疗提供了一条新的思路和方法。
综上，脂联素作为联系肥胖与肥胖相关肿瘤的一个中间因素，越来越引起国内外研究者的关注，作为其球
状结构域的gapM1，具有更强的生物学活性。尽管很多
证据提示了脂联素和gapM1的抗肿瘤作用，但许多问题
如其抗肿瘤作用的分子生物学机制等尚待深入研究。

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