实验性肝纤维化过程中Activin A表达变化与银杏叶提取物的逆转效应★

刘浩，时昭红，胡伟，吴玉芳，刘嵩

课题背景：肝纤维化是细胞外基质合成和降解失衡，引起过多的细胞外基质在肝脏沉积所致。近年来研究证实肝纤维化可双向转变，即进展或者逆转。作者前期的研究表明，银杏叶提取物可能通过抗氧化应激而对实验性大鼠慢性肝损伤、肝纤维化具有保护作用。本实验利用四氯化碳诱导实验性肝纤维化模型，拟证实银杏叶提取物具有逆转四氯化碳诱导实验性肝纤维化的作用。

应用要点：本实验免疫组织化学和反转录－聚合酶链反应显示模型组肝脏中Activin A表达较正常组明显增强，而银杏叶提取物治疗组则较模型组表达减弱。提示Activin A表达减少可能是银杏叶提取物反转实验性大鼠肝纤维化的作用机制之一。

术语解析：Activin A是转化生长因子超家族成员，是近年来发现的一组重要细胞因子。研究显示，Activin A与肝脏病变有密切的关系，是肝脏再生过程中的负向调节因子。肝细胞产生Activin A，通过自分泌和旁分泌方式，抑制肝细胞DNA合成，诱导肝细胞凋亡，促进肝纤维化的形成。

武汉市第一医院消化科，湖北省武汉市 430022

刘浩★，男，1981年生，湖北省武汉市人，汉族，2006年武汉大学毕业，硕士，医师，主要从事肝纤维化防治的研究。
liuhao678@163.com

摘要
目的： Activin A是转化生长因子超家族成员，是肝脏再生过程中的负向调节因子。实验拟验证银杏叶提取物反转实验性大鼠肝纤维化过程中Activin A的表达效应。
方法：实验于2005-09/2006-12在武汉市第一医院中心实验室完成。①实验材料：SPF级SD雄性大鼠36只，体质量（160±20）g；银杏叶提取物（由武汉市一医院中药制剂室提供，经湖北午时药业股份有限公司检验，编号02-391）。②实验分组：36只雄性SD大鼠被随机分为3组：正常组、肝纤维化模型组和银杏叶提取物治疗组。③实验过程：模型组和银杏叶提取物治疗组用500 mL/L 四氯化碳腹腔注射8周造模。银杏叶提取物治疗组大鼠造模后每天给予银杏叶提取物灌胃8周。④实验评估：用药结束后，分别麻醉后处死各组大鼠，分离血清行肝功能生化指标检测；取肝脏进行免疫组织化学检测Activin A；反转录-聚合酶链反应检测Activin A mRNA。
结果：36只大鼠全部进入结果分析。①银杏叶提取物治疗组大鼠肝功能指标较模型组明显改善。②光镜下观察银杏叶提取物治疗组肝纤维化分级较模型组明显恢复。③银杏叶提取物治疗组Activin A阳性染色程度较模型组明显减轻。④银杏叶提取物治疗组肝组织中ActivinA mRNA表达较模型组明显减弱。
结论：银杏叶提取物降低四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠Activin A表达，从而改变其肝纤维化程度。
关键词：银杏；植物提取物；肝硬化；激活素类；组织构建

刘浩，时昭红，胡伟，吴玉芳，刘嵩.实验性肝纤维化过程中Activin A表达变化与银杏叶提取物的逆转效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(2):271-274 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-271(ps).pdf]

中图分类号:R657.31
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)02-00271-04

Effect of Ginkgo Biloba extract on the expression of Activin A during the process of hepatic fibrosis

AIM:Activin A, a member of transforming growth factor superfamily, is the negative regulator factor in liver regeneration. In this study, the effects of extract of Ginkgo Biloba on hepatic fibrosis and the expression of Activin A in rats with cirrhosis were investigated.
METHODS: The experiment was performed at in the Central Laboratory of Wuhan First Hospital from September 2005 to December 2006. ①Thirty-six male SD rats of (160±20) g were randomized into 3 groups: control group, model group and treatment group. ②Except the rats in the control group, others were intraperitoneally injected with 500 mL/L CCl4 for 8 weeks to establish models of hepatic fibrosis. Meanwhile, the extract treatment group was infused with the extract of Ginkgo Biloba (Chinese drugs preparation laboratory of Wuhan First Hospital, detected by Hubeu Wushi Medicine Industry Co., Ltd. No. 02-391) daily for 8 weeks. ③After administration, all anesthetized rats were sacrificed. Blood samples were collected for the determination of liver function biochemical indexes. Liver tissue samples were used for histopathological examinations. The expression of Activin A was determined by immunohistochemistry and RT-PCR.
RESULTS: All 36 rats were involved in the final analysis. ①The liver function in extract treatment group was significantly improved compared with that in model group. ②The grade of fibrosis in extract treatment group were remarkably lower than that in model group under light microscope. ③The positive staining of Activin A in treatment group was significantly reduced compared with model group. ④The expression of Activin A mRNA in extract treatment group was significantly reduced compared with model group.
CONCLUSION: Extract of Ginkgo Biloba can effectively decrease the expression of Activin A in rats with hepatic fibrosis caused by CCl4, and lessen the degree of hepatic fibrosis.

Liu H, Shi ZH, Hu W, Wu YF, Liu S.Effect of Ginkgo Biloba extract on the expression of Activin A during the process of hepatic fibrosis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(2):271-274(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-2/2k-271(ps).pdf]

0 引言

肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节，其发生发展与多种细胞因子、化学因子有关。近年肝纤维化的发生有增多的趋势，严重危害人类身体健康，影响人们的生活质量。众多研究表明肝纤维化在一定条件下是可以逆转的，但临床上至今仍缺乏有效的抗纤维化药物。银杏叶提取物是一种用途广泛、无不良反应的天然物质，主要成分为银杏黄酮甙和萜类，其药理作用主要为清除氧自由基、抑制脂质过氧化、改善微循环等[1-2]。作者前期的研究已证明银杏叶提取物在慢性肝损伤、肝纤维化方面具有保护预防作用[3-5]。因此，本实验拟验证银杏叶提取物对大鼠肝纤维化的逆转作用，并探讨Activin A表达的变化。

设计：随机对照动物实验。
单位：武汉市第一医院消化科。
材料：实验于2005-09/2006-12在武汉市第一医院中心实验室完成。动物及药品：SPF级SD雄性大鼠36只，体质量（160±20） g，购于武汉大学实验动物中心（许可证号：SCXK(鄂)2005-16）。银杏叶提取物由武汉市一医院中药制剂室提供，经湖北午时药业股份有限公司检验，编号02-391。500 mL/L四氯化碳（CCl4）用精制植物油配制。实验试剂及仪器：Activin A单克隆抗体购自美国R&D公司，SP试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Trizol试剂购自Invitrogen公司，反转录酶为Promega公司产品，TaqDNA聚合酶购自Biostar公司，RNA酶抑制剂和100 bp DNA Ladder购自华美生物工程公司，焦磷酸乙二脂（DEPC）、琼脂糖为Sigma公司产品。引物由上海生工生物公司合成，大鼠Activin A上游引物：5’GGA CCT AAC TCT CAG CCA GAG ATG 3’，下游引物：5’TCT CAA AAT GCA GTG TCT TCC TGG 3’，全长280 bp；大鼠GAPDH上游引物：5’CAT GAC CAC AGT CCA TGC CAT C 3’，下游引物：5’CAC CCT GTT GCT GTA GCC ATA TTC 3’，全长450 bp。HPIAAS-2000彩色图文分析系统，HW-8B型超级微量恒温器，Olympus AH-2型显微镜。
设计、实施、评估者：由第一，二作者设计和实施，所有作者评估。参与实施的人员均经过专业培训。
技术路线：
动物模型建立：将36只大鼠随机分为3组：正常组，肝纤维化模型组，银杏叶提取物治疗组，每组12只。除正常组外，模型组和银杏叶提取物治疗组用500 g/L的四氯化碳腹腔注射，剂量为1 mL/kg，2次/周。8周后，麻醉后处死正常组和模型组大鼠，留取血液和肝脏备下列检查。银杏叶提取物治疗组给予银杏叶制剂悬浊液按每只0.3 g/kg的剂量灌胃，1次/d，治疗8周后，麻醉后处死动物，标本采集同前。
血液生化检查：动物麻醉，迅速从心脏取血，分离血清，用全自动生化检测仪检测丙氨酸氨基转移酶、天门冬酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和白蛋白值。
组织学检查：动物杀死后取肝组织，体积分数为0.1的甲醛固定，石蜡包埋切片，行苏木精-伊红染色，光镜下观察。同一病理专科医生予以纤维化分级，根据其纤维化分为0~4级[4]。0级：无纤维化；1级：纤维结缔组织仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向小叶发展的倾向；2级：纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3及有1级同样的改变；3级：纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；4级：纤维结缔组织在肝小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有3级同样的改变。
免疫组织化学检查：采用石蜡包埋常规切片，SP法，Activin A单克隆抗体以1∶100稀释，二氨基联苯胺显色，苏木精复染。磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。显色结果采用HPIAS-2000型多媒体彩色图像分析系统对染色阳性部位进行吸光度值测定。通过显微摄像系统放大200倍，在每张片子上随机选取3个视野，以胞浆内棕色颗粒为Activin A阳性表达，测定其平均吸光度值（MA）、阳性区域面积百分比。
反转录-聚合酶链反应：称取50~100 mg肝组织用Trizol提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280值。取2 μg总RNA，42 ℃ 反转录90 min。参数设置94 ℃变性，3 min×1循环。94 ℃变性30 s，53 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35个循环。最后 72 ℃ 彻底延伸7 min×1循环。同法扩增GAPDH作为内参照。取5 μL聚合酶链反应产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度，Activin A/GAPDH比值表示Activin A mRNA相对水平。
主要观察指标：①各组大鼠肝功能改变。②组织形态学改变。③免疫组织化学结果。④肝组织中ActivinA mRNA表达情况。
统计学分析：计量资料以_x±s表示，由第一作者采用SPSS 10.0软件进行配对t检验，计数资料采用Ridit分析。

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36只，分为3组，无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠肝功能改变模型组与正常组比较，模型组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬酸氨基转移酶、碱性磷酸酶明显升高，而白蛋白明显降低（P < 0.01）。银杏叶提取物治疗组丙氨酸氨基转移酶、天门冬酸氨基转移酶、碱性磷酸酶较模型组则明显降低（P < 0.01），白蛋白水平明显升高（P < 0.01）。见表1。

2.3 组织形态学改变肝脏苏木精-伊红染色显示，正常大鼠可见少量胶原着色，纤维化模型组肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，肝细胞广泛变性坏死，汇管区扩大、胶原沉积。银杏叶提取物治疗组大鼠肝组织光镜下可见脂肪变性基本消失，肝细胞大部分正常，肝细胞结构趋向正常，纤维间隔仅见散在片段残留，或隐约可见的纤维间隔，或仅为汇管区少数纤维组织增生和炎细胞浸润。模型组与正常组、治疗组与模型组之间肝纤维化分级差异有显著性。见表2和图1。

2.4 免疫组织化学结果正常组肝组织中几乎不表达Activin A，模型组Activin A阳性表达主要位于中央小叶和门静脉周围肝细胞中，并在Kuffer细胞、类间质细胞质及其周围也可见其表达，银杏叶提取物治疗组阳性染色程度均较模型组明显减轻。正常组、模型组和治疗组阳性区域面积百分比分别为（0.3±0.1）%，（11.4±1.2）%和（4.1±0.5）%。治疗组和模型组比较差异有显著性（P < 0.01）。见图2。

2.5 反转录聚合酶链反应检测肝组织中Activin A表达的结果正常肝组织几乎不表达Activin A mRNA，而模型组表达明显增强，银杏叶提取物治疗组则明显减弱。正常组、模型组和治疗组Activin A mRNA相对水平分别为0.08±0.02，0.78±0.15和0.42±0.09。治疗组和模型组比较差异有显著性（P < 0.01）。见图3。

肝纤维化是细胞外基质合成和降解失衡，引起过多的细胞外基质在肝脏沉积所致。在细胞水平上可能涉及肝星状细胞、Kupffer细胞、巨噬细胞的活化；在分子水平上，它与生长因子、细胞因子、化学因子、细胞间质生成和沉积的改变有关[6]。近年来研究证实肝纤维化可双向转变，即进展或者逆转。在去除病因、给予药物治疗等条件下，肝纤维化会有不同程度的减轻[7]。银杏叶提取物的主要药理作用为抗氧化作用，在心、脑血管疾病中研究较多，可以增强中枢神经系统功能，对心、脑血管缺血性损伤有明显的保护作用[8]。此外，Daba等[9]研究表明银杏叶提取物可通过抑制脂质过氧化而对博莱霉素（bleomycin）诱导的肺纤维化具有保护作用，而国内的研究亦显示银杏叶提取物能使肺间质纤维化减轻[10]。在肝脏方面，研究显示银杏叶提取物对肝窦状内皮细胞具有保护作用[11]，可以改善慢性肝损伤后的微循环紊乱[12]。作者前期的研究也表明，银杏叶提取物可能通过抗氧化应激而对实验性大鼠慢性肝损伤、肝纤维化具有保护作用[3-5]。本实验利用四氯化碳诱导实验性肝纤维化模型，结果显示造模8周后模型组肝细胞广泛变性坏死, 纤维组织增生明显,将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，表示造模成功。而在治疗8周后，银杏叶提取物治疗组肝纤维化的程度明显改善，汇管区及小叶间仅见少量增生的纤维组织，部分向小叶间伸展，与模型组差异显著，证实银杏叶提取物具有逆转四氯化碳诱导实验性肝纤维化的作用。血液生化检查也显示银杏叶提取物治疗组明显优于模型组，说明银杏叶提取物有促进肝脏功能恢复的作用。
Activin A是转化生长因子超家族成员，是近年来发现的一种重要细胞因子。它具有广泛的生物学活性，如在动物胚胎中诱导中胚层和前后极性分化，在动物和人体内刺激多种细胞分化等[13]。近年研究显示，Activin A与肝脏病变有密切的关系[14]。在慢性病毒性肝炎患者血清中Activin A比正常对照组患者明显升高[15]；亦有学者发现肝硬化及肝细胞癌患者血清Activin A水平升高，且后者升高更为明显[16]。在实验性肝纤维化方面，研究证实不同方式诱导的大鼠肝纤维化都有肝脏Activin A的表达增强[17-18]。而在急性肝损伤时，研究亦表明Activin A表达增强，对肝星状细胞分泌纤维具有调节作用[19]。总之大量研究证明，Activin A是肝脏再生过程中的负向调节因子。肝细胞产生Activin A，通过自分泌和旁分泌方式，抑制肝细胞DNA合成，诱导肝细胞凋亡[20-21]，促进肝星状细胞和成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原[22]。在本实验中，免疫组织化学和反转录聚合酶链反应显示模型组肝脏中Activin A表达较正常组明显增强，而银杏叶提取物治疗组则较模型组表达减弱，与纤维化程度相一致，提示Activin A表达减少可能是银杏叶提取物反转实验性大鼠肝纤维化的作用机制之一。

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