人胚心脏动脉端来自前心区*★

李海荣，杨艳萍，曹锡梅，刘慧霞，景雅，王彤

课题背景：国外对胚胎心脏发生发育的研究多集中在鸡胚和小鼠胚胎，国内对胚胎心脏发育的研究报道较少。由于人胚收集困难，其报道相对匮乏，对C14期以前的人胚心脏发生发育的研究更难见到，因此实验选用早期人胚为研究对象以弥补这一不足。

同行评价：文章在观察和探讨人胚心脏动脉端心肌的起源方面具有一定的创新性。

相关链接：传统认为，两侧心区随胚盘卷褶在前肠腹侧愈合形成一直的原始心管。原始心管经过分化发育，重建为成体的四腔心。近年来，对动物胚胎的活体标记试验表明禽类和啮齿类心脏流出道及右心室来自心管外的咽部中胚层（即前心区或第二生心区）。

李海荣★，女，1971年生，山西省高平市人，汉族，2001年山西医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事胚胎心脏发生发育的研究。
lihairong20030829@163.com

通讯作者：景雅,博士，教授，山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市
030001 jingya66@hotmail.com

摘要
背景: 对动物胚胎的活体标记试验表明鸡和小鼠胚胎心脏流出道及右心室来自心管外的咽部中胚层。人胚是否有相似情况作者经文献检索尚未见报道。
目的：观察并验证人胚心脏动脉端心肌的来源。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-10/2006-10在山西医科大学组织胚胎学教研室完成。
材料：山西医科大学各附属医院药物流产后绒毛膜保存完好的早期人胚标本25例。
方法：体视显微镜下仔细分离出胚体。用Carnegie分期法对胚胎进行发育分期，其中C10期、C11期、C12期、C13期、C15期和C16期胚胎各3例，C14期胚胎7例。
主要观察指标：应用免疫组织化学PAP法观察了α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白在C10晚期至C16期人胚心脏及咽部中胚层的表达型，并用苏木精-伊红染色观察各期心脏及咽中胚层的形态学特征。
结果：C10晚期至C12，流出道远端的脏层心包和心包腔的背侧壁为复层上皮，向壁层心包内延伸逐渐变为单层扁平上皮。背侧心包于C13至C15变为单层上皮。C10晚期至C13流出道远端α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白表达可延伸至脏层心包及咽部间充质细胞。C14至C15，流出道逐渐延长，其远端的脏层心包细胞增生并迁至流出道，在近流出道心肌细胞处表达α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白。
结论：C10至C15，咽中胚层不断分化出心肌细胞添加至心脏的动脉端使流出道延长，为人胚的前心区；流出道远端心肌可诱导前心区细胞增殖分化为心肌细胞。人胚心脏动脉端心肌来自前心区。
关键词：人胚；心脏；前心区；肌动蛋白类；组织构建

李海荣，杨艳萍，曹锡梅，刘慧霞，景雅，王彤. 人胚心脏动脉端来自前心区[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3801-3805 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3801(ps).pdf]

BACKGROUND：Labeling in chick and mouse embryo in vivo suggested right ventricle and outflow tract of the heart derived from pharyngeal mesoderm distal to the heart tube. It was unclear whether it was the same in human embryo.
OBJECTIVE: To explore the origin of cardiomyocytes at the arterial pole of the human embryonic heart.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample experiment was performed at the Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University from October 2005 to October 2006.
MATERIALS: A total of 25 cases of early human embryo samples with complete chorion after drug abortion at the Hospital Affiliated to Shanxi Medical University.
METHODS: Embryonic plants were isolated under a stereomicroscope. According to Carnegie staging method, embryos were assigned to Carnegie stage 10 (C10), C11, C12, C13, C15 and C16 stages (3 cases each) and C14 stages (7 cases).
MAIN OUTCOME MEASURES: Immunohistochemistry PAP was used to observe the expression patterns of α-smooth muscle actin and α-sarcomeric actin in the human embryonic heart and pharyngeal mesoderm from C10 to C16. Haematoxylin and eosin (HE) staining was employed to observe morphologic characteristics of heart and pharyngeal mesoderm at each stages.
RESULTS: From C10 to C12, splanchnic pericardium distal to the outflow tract and dorsal pericardium were stratified epithelium, when extending into parietal mesoderm pericardium gradually transformed into simple squamous epithelium. During the following three stages, dorsal pericardium gradually changed into simple epithelium. During C10 to C13, expression ofα-smooth muscle actin and α-sarcomeric actin reached splanchnic pericardium and pharyngeal mesenchymal cells distal to the outflow tract. From C14 to C15, the outflow tract gradually elongated. Over these stages, splanchnic pericardial cells distal to the outflow tract proliferated and progressively migrated into the outflow tract, expressing α-smooth muscle actin and α-sarcomeric actin when closed to cardiomyocytes.
CONCLUSION: From C10 to C15, the outflow tract gradually elongates with an addition of cells from pharyngeal mesoderm, which we consider the anterior heart field of the human embryonic heart. Myocardium of distal outflow tract can induce cells derived from anterior heart field to proliferate and differentiate into cardiomyocytes. The arterial pole of the human embryonic heart derives from the anterior heart field.

Li HR, Yang YP, Cao XM, Liu HX, Jing Y, Wang T. Arterial pole of human embryonic heart derived from the anterior heart field.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3801-3805(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3801(ps).pdf]

位于脏壁中胚层的侧心区向前内侧迁移在前肠腹侧愈合形成原始心管[1-2]。早期研究认为，原始心管形成心脏各部，心脏心肌细胞全部来自侧心区。最新研究表明鸡胚、小鼠胚胎右心室和流出道的心肌细胞来自咽部中胚层，并将其称之为前心区或第二生心区[3-9]。关于人胚心脏动脉端心肌的确切来源尚未见报道。α-平滑肌肌动蛋白是心肌细胞分化的早期标志，α-横纹肌肌节肌动蛋白为横纹肌特异性标志蛋白。本实验观察了C10至C16期人胚心脏和咽中胚层的形态学变化及其α-平滑肌肌动蛋白、α-横纹肌肌节肌动蛋白时空表达型，发现C10至C15期咽中胚层不断分化为心肌细胞添加至心脏的动脉端，是人胚的前心区；流出道远端心肌可诱导前心区细胞增殖分化为心肌细胞。

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2005-10/2006-10在山西医科大学组织胚胎学教研室完成。
材料：经山西医科大学医学伦理委员会批准及当事人同意后，收集山西医科大学各附属医院药物流产后绒毛膜保存完好的早期人胚标本25例。

实验方法：
标本制作：体视显微镜下分离出胚体，观察其外形特征，结合标本的苏木精-伊红染色特征，用Carnegie分期法[10]对胚胎进行发育分期。其中C10期、C11期、C12期、C13期、C15期和C16期胚胎各3例，C14期胚胎7例。标本于V(甲醇)∶V(丙酮)∶V(水)=2∶2∶1混合固定液内室温下固定24 h。固定后经梯度乙醇、正丁醇脱水，石蜡包埋。常规制作7 μm厚横切面连续石蜡切片，铺于多聚赖氨酸处理的载玻片上。连续切片每10片取一片做苏木精-伊红染色，以观察胚胎的形态学特征。取有心脏的切片行免疫组织化学染色。
免疫组织化学PAP法染色：石蜡切片脱蜡，体积分数为0.03的过氧化氢预处理30 min，TENG-T(10 mmol/L Tris, 5 mmol/L乙二胺四乙酸,150 mmol/L NaCl,0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH=8.0(预处理15 min，分别减低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景染色。预处理后的切片分别用小鼠抗α-横纹肌肌节肌动蛋白抗体(1∶50，5C5)，小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(1∶1000，IMMH-2)室温下过夜孵育。然后依次用兔抗小鼠IgG(1∶7 500)、羊抗兔IgG(1∶250)和兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(1∶750)孵育。所有抗体均用中性磷酸盐缓冲液稀释。孵育后标本经磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次。标本经二氨基联苯胺显色(阳性结果呈棕黄色)，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
主要观察指标：α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白在C10晚期-C16期人胚心脏动脉端及咽部中胚层的表达型;苏木精-伊红染色观察各期心脏及咽中胚层的形态学特征。
设计、实施、评估者：实验设计为第一和第五作者，实施为全部作者，评估为第五作者。

各期人胚心脏动脉端、咽部中胚层α-平滑
肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白的表达型及心脏、咽中胚层的形态学特征：
C10晚期，心管已开始形成心袢。流出道向动脉端延伸，α-平滑肌肌动蛋白、α-横纹肌肌节肌动蛋白表达越过动脉囊弓动脉分叉处至流出道远端的脏层心包(见图1a，b)。苏木精-伊红染色示：流出道远端的脏层心包为复立方上皮（见图1c），向流出道移行细胞形态结构、染色特性接近流出道远端的α-平滑肌肌动蛋白、α-横纹肌肌节肌动蛋白阳性心肌细胞；心包腔的背侧壁呈复层立方上皮；两侧的壁层心包向腹侧延伸，逐渐由复层立方上皮变为单层扁平上皮(见图1c)。免疫组织化学染色示背侧心包及两侧的壁层心包呈α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白阴性。

C11期，苏木精-伊红染色示流出道远端的脏层心包(见图2a)、心包腔的背侧壁（见图2b）较C10期细胞层数增加。仅近流出道的脏层心包细胞表达α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白。
C12期, 苏木精-伊红染色可见流出道远端的脏层心包细胞、咽部间充质细胞逐渐迁入流出道壁内，染色特性与流出道的心肌细胞相同（见图3a）, 但仅近流出道的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(见图3b)。心包腔背侧壁为复层上皮。
C13期，苏木精-伊红染色可见流出道远端脏层心包增生并迁入流出道壁内（见图4a）。从头端向尾端延伸，心脏动静脉端之间的背侧心包逐渐变为单层上皮（见图4b），仅与两侧壁层心包反折处为复层上皮(见图4b)。可见流出道α-平滑肌肌动蛋白、α-横纹肌肌节肌动蛋白表达向脏层心包（见图4d）及咽部间充质细胞延伸（见图4c,d）。

C14至C15期, 苏木精-伊红染色示流出道远端的脏层心包为复层上皮，分裂产生的细胞向流出道聚集并添加至其远端（见图5a，b），逐渐表达较弱的α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白，向流出道壁延伸其表达逐渐增强（图5c，d）。背侧心包渐变为单层上皮(见图6a)。
C16期, 苏木精-伊红染色示心脏动脉端的脏层心包明显变薄，可见细胞增生并迁入正在形成的升主动脉及肺动脉干壁内（见图7a，b），这些细胞不表达α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白（见图7c，d）。
结果表明，C10至C15期，α-横纹肌肌节肌动蛋白阳性流出道逐渐延长。C16期, α-横纹肌肌节肌动蛋阳性流出道明显缩短，呈α-平滑肌肌动蛋白阴性。

本实验发现，C10晚期至C12，流出道远端的脏层心包、心包腔的背侧壁为复层上皮，二者向壁层心包内延伸逐渐变为单层扁平上皮。此时，随着流出道远端的脏层心包细胞向流出道心肌靠近，其苏木精-伊红染色特性逐渐变得与流出道心肌细胞相同，且先后表达心肌标志α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白，表明流出道远端的脏壁中胚层细胞可分化为心肌细胞添加至心脏的动脉端使心管延长，为人胚的前心区[3-6,11]。由于流出道远端的脏层心包、心包腔背侧壁及相邻两侧壁层心包形态上的渐变性及与壁层心包形态上的明显差异，结合Viragh等[5,12]对小鼠胚胎的实验结果，作者认为此时心包腔的背侧壁及两侧相邻的壁层心包亦为人胚的前心区[3-6]。Waldo等[13]报道鸡胚第二生心区在HH14(Hamilton and Hamburger stage 14)-HH26亦呈假复层柱状上皮。C12和C13，流出道远端的咽部间充质细胞表达α-平滑肌肌动蛋白或α-横纹肌肌节肌动蛋白，表明咽部间充质细胞可分化为心肌细胞添加至流出道远端，亦为人胚的前心区。
C13至C15期，心包腔的背侧壁从中部开始由尾向头逐渐变为单层扁平上皮，细胞增生逐渐局限于流出道远端的脏层心包。可见流出道远端的脏层心包细胞添加至流出道远端使其明显延长，并在近心肌细胞出表达较弱的α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋，表明前心区随发育逐渐局限于流出道远端的脏层心包，与Kelly等[5]描述的小鼠胚胎发育过程中第二生心区的空间位置变化相似。由于胚胎发育过程中流出道从第一鳃弓水平逐渐移向尾端鳃弓水平，表明前心区随流出道发育逐渐向胚体尾端迁移。
尽管实验从形态学上表明心包背侧壁及相邻的壁层心包为人胚的前心区，但从未发现其表达心肌标志α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白，可能与α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白在心肌细胞分化过程中出现较晚有关。Waldo等[3,14-17]报道鸡胚第二生心区细胞亦表达心肌标志性转录起始因子Nkx2.5和Gata-4，对这些心肌分化的早期标志在人胚的表达型的研究有助于进一步明确前心区的范围。
Waldo等[3]发现鸡胚心管两端新生心肌的分化需靠近原始心肌。本实验亦有类似发现：C10-C15，心管动脉端的脏壁中胚层上皮分裂增生，产生的细胞逐渐聚集于流出道远端，在近流出道心肌细胞处表达α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白，提示流出道远端心肌释放短距离作用的信号分子诱导前心区细胞增殖分化为心肌细胞。心肌分化需骨形态发生蛋白2的诱导，已有研究表明鸡胚流出道原始心肌在第二生心区心肌迁入时表达骨形态发生蛋白2[3,18]，支持本文的分析。Mjaatvedt 等[4]将鸡胚前心区与HH16鹌鹑胚的远端流出道共同培养证实胚胎右心室远端可诱导前心区细胞分化为流出道远端的心肌细胞。
本实验与Yamada等[19]的研究发现，C10至C15期, 流出道远端的脏壁中胚层不断分化出心肌细胞添加至流出道远端使其逐渐延长，相当于Viragh等 [12]观察到的小鼠胚胎E8 (Embryonic Day 8) -E11、De la cruz等[20]观察到的鸡胚HH12-HH2。C16，流出道明显缩短，通过升主动脉和肺动脉干同咽部中胚层相连，咽部中胚层分裂产生的细胞迁入升主动脉及肺动脉干壁内，不表达α-平滑肌肌动蛋白和α-横纹肌肌节肌动蛋白，此时前心区不再形成心肌细胞添加至流出道的远端。
先天性心脏病为新生儿常见和死亡率较高的先天性畸形，人胚前心区的发现、对其确切范围及向心肌分化的分子调控机制的研究将为解释流出道的先天性畸形提供新的理论依据。

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