bulge区毛囊组织块培养结合酶消化法分离大鼠毛囊隆突部细胞的生物学特征★

王慧君，柏树令，田伟，佟浩

课题背景：毛囊隆突部细胞具有自我更新能力和慢周期性，不但能够进一步分化为表皮，还能分化为皮肤的附属器（毛囊、汗腺、皮脂腺等），在皮肤组织工程中有重要的地位。因此，分离培养大鼠毛囊隆突部细胞，可为组织工程皮肤更加完整地重建皮肤的解剖结构和生理功能的进一步研究提供实验基础。

同行评价：本文应用组织块培养结合酶消化法分离、培养及鉴定毛囊隆突部细胞，具有一定的新颖性和实用性。

相关链接：近年来，毛囊隆突部细胞的研究成为热点，已经作为皮肤损伤修复的靶细胞，通过细胞移植技术，促进皮肤组织的形成和创面愈合，同时也可以用来对一些遗传性的皮肤病进行基因治疗，这将是今后组织工程皮肤深入研究的重要方向。

中国医科大学基础医学院组织工程学教研室，辽宁省沈阳市
110001

王慧君★，女，1981年生，河北省饶阳县人，汉族，中国医科大学在读硕士，主要从事皮肤组织工程研究。
whjllwbforever@
hotmail.com

通讯作者：柏树令，博士，教授, 中国医科大学组织工程学教研室，辽宁省沈阳市
110001 baishuling@hotmail.com.

摘要
背景: 目前毛囊隆突部细胞的分离培养方法多存在细胞分离纯度不高、活力差等缺点，采用组织块法和酶消化法分离培养大鼠毛囊隆突部细胞能否克服上述缺点？
目的：本实验采用组织块法和酶消化法分离培养大鼠毛囊隆突部细胞并对其进行鉴定。
设计、时间及单位：单一样本设计，体外细胞培养实验。于2007-03/08在中国医科大学组织工程学实验室完成。
材料：选用15只雌性Wistar大鼠，由中国医科大学实验动物中心提供。实验用表皮生长因子、Hoechst33342购自美国Sigma公司，SABC-小鼠IgG抗体免疫组化试剂盒、SABC-Cy3免疫荧光组织化学试剂盒、DAB显色剂、SABC-FITC免疫荧光组化试剂盒均购自武汉博士德公司。
方法：利用显微分离的方法将大鼠触须部皮肤分离，剪开真皮和皮下组织，将毛囊与周围组织钝性分离取出毛囊，剪开结缔组织鞘，用显微外科镊取出毛囊外根鞘bulge区，移入培养板中进行组织块培养，应用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化分离大鼠毛囊bulge区细胞，倒置相差显微镜下观察其增殖能力，免疫荧光法检测毛囊隆突部细胞K15、β1 整合素和P63的表达情况。
主要观察指标：①大鼠隆突部细胞增殖能力。②毛囊隆突部细胞K15、β1 整合素和P63的表达。
结果：①大鼠隆突部细胞胞体积较大，胞核大，核仁明显，细胞生长迅速，活力好，3~4 d即可传代，具有增殖能力强、细胞纯度高等特性。②细胞免疫荧光结果显示培养的细胞胞浆角蛋白15阳性，细胞的胞膜β1 整合素阳性，细胞的胞核P63阳性。
结论：组织块法结合酶消化法可成功分离培养毛囊隆突部细胞，细胞可同时表达K15、β1 整合素和P63，纯度高，活力好。
关键词：毛囊；隆突部；细胞；生物学特性；纯度

王慧君，柏树令，田伟，佟浩. bulge区毛囊组织块培养结合酶消化法分离大鼠毛囊隆突部细胞的生物学特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3806-3809 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3806(ps).pdf]

中图分类号:R329.449
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)20-03806-04

Biological characteristics of rat follicular bulge cells isolated by explant culture and enzyme digestion
Abstract

BACKGROUND：At present, the method of isolating and culturing the follicular bulge cells is short of purity and vigor, can we isolate and culture rat bulge cells by explants culture and enzyme digestion to overcome the defects?
OBJECTIVE: To isolate and culture rat bulge cells by means of explants culture and enzyme digestion, and identify cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: A study based on single sample of cell culture in vitro was carried out in the Department of Tissue Engineering, Basic Medical College, China Medical University between March to August in 2007.
MATERIALS: Fifteen female Wistar rats were provided by the Laboratory Animal Center in China Medical University. Epidermal growth factor and Hoechst33342 were bought from Sigma. SABC (mouse IgG)-AP kit, SABC (mouse IgG)-FITC kit, DAB color developing reagent and SABC (mouse IgG)-Cy3 kit were bought from Boster.
METHOSD: The whisker skin was separated from rats by micro-isolation method, the dermis and subcutaneous tissue were cut, and then hair follicles were took out from surrounding. We sheared the connective tissue sheath and separated the bulge with micro-surgical forceps. Next, the bulge was put into the tissue culture plate for culture, and were separated with 0.25% enzyme and 0.02% EDTA. The proliferation of bulge cells was identified by inverted phase contrast microscope. Immunofluorescence staining was used to detect expression of K15, β1 integrin and P63 in the cultured cells.
MAIN OUTCOME MEASURES: The reproductive activity of rat bulge cells;The expression of K15, β1 integrin and P63 in bulge cells.
RESULTS: The cell body of bulge cells was big, cell nuclei was large and the nucleoli was distinct. The cells grew fast and the vigor of the cells was good. We could passage the cells after 3-4 days. The cells maintained higher reproductive activity and higher purity. K15, β1 integrin and P63 were detected to be positive for immunofluorescence staining.
CONCLUSION: Follicular bulge cells can be successfully isolated and cultured by explants culture and enzyme digestion, meanwhile the expression of K15, β1 integrin and P63 is positive in bulge cells. The bulge cells have high purity and good vigor.

Wang HJ, Bai SL, Tian W, Tong H. Biological characteristics of rat follicular bulge cells isolated by explant culture and enzyme digestion.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3806-3809(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3806(ps).pdf]

毛囊发育经过表皮和真皮之间一系列复杂的相互作用而形成，而且具有静止期、生长期、退化期的显著周期性。目前一致认为毛囊干细胞定位于毛囊外根鞘的隆突部（bulge）[1-5]，毛囊隆突部细胞具有自我更新能力和慢周期性，不但能够进一步分化为表皮，还能分化为皮肤的附属器（毛囊、汗腺、皮脂腺等），在皮肤组织工程中有重要的地位。因此，分离培养大鼠毛囊隆突部细胞，为组织工程皮肤更加完整地重建皮肤的解剖结构和生理功能的进一步研究提供实验基础。

1.1 材料选用15只雌性Wistar大鼠，清洁级，体质量100~150 g，由中国医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验试剂：① DMEM培养液，添加10 mg/L胰岛素、10 μg/L氢化可的松、2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素(10万U/L)和链霉素(100 mg/L)。②消化液：0.25%胰酶+0.02% EDTA，购自华美生物工程有限公司。③DMEM/F12培养液，添加含10%胎牛血清、10 mg/L胰岛素、10 μg/L氢化可的松、5 mg/L表皮生长因子、2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素(10万U/L)和链霉素(100 mg/L)以上成分中DMEM培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自天津TBD公司，胰岛素、氢化可得松、谷胺酰胺均购自美国Sigma公司，青霉素购自华北制药股份有限公司，链霉素购自大连美罗大药厂，表皮生长因子、Hoechst33342购自美国Sigma公司。④细胞免疫荧光所用抗体：一抗鼠抗人K15单克隆抗体(稀释浓度1∶100，美国Nuomarker公司)，兔抗鼠β1 整合素多克隆抗体（稀释浓度1∶100，武汉博士德公司），鼠抗人P63单克隆抗体(稀释浓度1∶100，北京中杉金桥生物试剂公司); SABC-小鼠IgG抗体免疫组化试剂盒、SABC-Cy3免疫荧光组织化学试剂盒、DAB显色剂、SABC-FITC免疫荧光组化试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.2 方法毛囊隆突部细胞培养：无菌条件下取大鼠触须部皮肤，在含青霉素(10万U/L)和链霉素(100 mg/L)的D-Hank’s液连续冲洗3遍，每遍3~5 min。然后用眼科剪刀从真皮和皮下组织交界处剪开，用显微外科镊顺毛囊方向将毛囊与周围组织钝性分离，轻轻夹住毛囊远端小心从皮下组织中倒拔毛囊，避免伤及毛乳头和真皮组织鞘等组织，并小心去净毛囊周围的脂肪组织。解剖显微镜下用显微解剖剪切除毛囊球部，剪开结缔组织鞘，以显微外科镊取出毛囊外根鞘bulge区，小心移入24孔培养板中，加入DMEM培养液(含10 mg/L胰岛素、10μg/L氢化可的松、2 mmol/L谷氨酰胺) 0.5 mL，在37 ℃、体积分数0.05 CO2孵育箱内培养。5~7 d后bulge区毛囊贴壁，可见细胞从周围爬出，待铺满培养板时，用0.25%胰酶+0.02%EDTA 37℃消化10 min左右，加入含血清DMEM/F12培养液终止消化，吹打，离心，1∶2传代，逐渐去除成纤维细胞的污染，在37 ℃、体积分数0.05 CO2孵育箱内培养。
细胞免疫荧光染色：将爬片培养的毛囊隆突部细胞，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，3%过氧化PBS冲洗，加生物素标记的二抗，37 ℃孵育20 min;氢室温10 mm，5%牛血清白蛋白室温下封闭20 min，加K15单克隆抗体，4 ℃过夜；PBS冲洗，加SABC-CY3，室温孵育1 h, PBS冲洗，加Hoechst33342,室温5min,PBS冲洗，甘油封片，倒置荧光显微镜观察。将一抗换为加β1 整合素多克隆抗体，用SABC-FITC标记；将一抗换为P63单克隆抗体，用SABC-CY3标记，不加Hoechst33342,其它步骤同上。
主要观察指标：①毛囊隆突部接种培养后组织块的生长情况以及0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后毛囊隆突部细胞的增殖能力以及活力。②细胞免疫荧光染色检测毛囊隆突部细胞的主要标记角蛋白15、β1 整合素以及P63。

2.1 毛囊隆突部细胞培养结果毛囊bulge区接种培养后第1天，大部分bulge区毛囊开始生长，表现为毛囊逐渐延长，5天后大部分开始贴壁，周围有上皮样细胞和成纤维样细胞爬出，并逐渐增殖生长，采用酶消化法分离毛囊隆突部细胞，逐渐去除成纤维细胞的污染，第3代后细胞均匀一致，成克隆性生长，细胞胞体积较大，胞核大，核仁明显，细胞生长迅速，活力好，三四天即可传代,见图1。

2.2 细胞免疫荧光标记检测结果免疫荧光结果显示培养的细胞胞浆角蛋白15阳性(CY3标记)，细胞的胞膜β1 整合素阳性(FITC标记)，细胞的胞核P63阳性(CY3标记),见图2~4。

目前，认为皮肤干细胞分为表皮干细胞和毛囊干细胞，毛囊干细胞在实现毛发再生以及促进皮肤损伤的修复中发挥这重大作用。目前一致认为毛囊干细胞定位于毛囊的上半部，立毛肌插入外根鞘所形成的隆起——隆突部（bulge）。Cotsarellis等[1]人在1990年采用[3H]TdR掺入连续标记小鼠皮肤，只在毛囊隆突部观察到标致滞留细胞（label-retaining cells,LRCs），说明毛囊隆突部是LRCs的惟一部位，于是提出了“隆突激活假说”。Taylor等[4]利用Brdu 和3H-TdR对毛囊膨出部的干细胞进行双重标记，亦证实毛囊干细胞位于毛囊的隆突部。Ohyam等[5]把人头皮的皮肤移植到鼠的背部，并用BrdU连续标记，经过4~6周的标记和10~12周的清除期后，取出移植物，在立毛肌插入点和皮脂腺之间的外根鞘最外层发现了标致滞留细胞，认为在毛囊生长初期，毛囊干细胞隆突部的位与皮脂腺和立毛肌插入点之间。近年来，毛囊干细胞成为科学家研究的热点，但是关于毛囊干细胞的分离、培养的技术还不是很完善，进一步影响了关于毛囊干细胞的分化和调控的分子机制的探索。
目前，毛囊隆突部细胞的分离方法主要有三种方法：①显微分离法对于毛囊隆突部的细胞损伤相对较大。②组织块培养法，史明艳等[6]比较了采用组织块法和酶消化法分离培养的山羊毛囊干细胞，结果组织块法获得的细胞免疫组化阳性率高、克隆形成率以及传代能力均显著高于酶消化法获得的细胞。③采用FACS(荧光标记细胞激活技术)分离，此法分离的细胞纯化率高，但是细胞活力不好，传代培养困难。本实验采用bulge区毛囊组织块培养结合酶消化法，对隆突部细胞损伤小，而且保留了毛囊微环境对隆突部细胞生长的促进作用。目前，毛囊隆突部细胞的表面标志最常用的是K19、β1 整合素，本实验采用K15、β1 整合素和P63三种分子标志来鉴定毛囊隆突部干细胞，有学者发现K15在毛囊隆突部表达阳性，而且这些细胞与β1整合素高表达的LRCs具有一致性[7]；在细胞的分化过程中, K15 表达量减少的出现时间较K19 更早, 证明K15 阳性细胞是毛囊干细胞,因此K15标记毛囊干细胞比K19更加具有意义。Pellegrini等[8]实验表明P63在毛囊隆突部细胞有特异的表达。
近年来，毛囊隆突部细胞的研究成为热点，已经作为皮肤损伤修复的靶细胞，通过细胞移植技术，促进皮肤组织的形成和创面愈合，同时也可以用来对一些遗传性的皮肤病进行基因治疗[9]，这将是今后组织工程皮肤深入研究的重要方向。本实验表明，通过本方法分离培养的毛囊隆突部细胞同时表达K15、β1 整合素和P63，纯度高，活力好，这为将来利用隆突部细胞来合成组织工程皮肤修复皮肤损伤奠定了基础。虽然毛囊干细胞在皮肤组织工程中已经作为理想的种子细胞被应用，但是还存在许多理论和技术问题，分离纯化毛囊干细胞的技术还需进一步改进，毛囊干细胞的分化和调控的分子机制还有待于进一步探索。

1 Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell 1990； 61(7): 1329-1337
2 Wilson C, Cotsarelis G, Wei ZG, et al. Cells within the bulge region of mouse hair follicle transiently proliferate during early anagen: heterogeneity and functional differences of various hair cycles. Differentiation 1994; 55(2):127-136
3 Lavker RM, Miller S, Wilson C, et al.Hair follicle stem cells: their location, role in hair cycle, and involvement in skin tumor formation.J Invest Dermatol. 1993;101(1 Suppl):16S-26S
4 Taylor G，Lehrer MS,Jensen PJ, et al. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell 2000；102(4):451-461
5 Ohyama M,Terunrma A,Tock CL,et al. Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells. J Clin Invest 2006；116(1):249-260
6 史艳明,杨学义,窦忠英.山羊毛囊干细胞分离培养方法研究.畜牧兽医学报[J],2006,37(5):436-440
7 Liu Y, Lyle S, Yang Z, et al. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol 2003;121(5):963-968
8 Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O, et al. p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(6):3156-3161
9 Tao K, Li L. An experimental study on changes of epidermal stem cells during survival process after full-thickness skin autograft.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 2007;21(12):1376-1380