理想肌桥桥接神经缺损构型个性化差异对神经再生的影响★

张勇，杨晓霞，苏秋香，张庭深

课题背景：研究表明，肌桥在修复周围神经缺损中对再生神经起诱导作用。但骨骼肌条被桥接后，缺损神经再生的效果颇不一致。实验以缝匠肌、指浅屈肌为肌桥分别缝接缺损股神经并对移植后神经纤维再生情况进行观察，旨在探讨肌桥构型的个性化差异对神经再生的影响。

临床应用性：实验结果提示，以相对长度较大但截面积较小的肌纤维为主要构成的缝匠肌尾侧部桥接的缺损神经再生效果较好；而以相对长度较小但截面积较大的肌纤维为主要构成的指浅屈肌桥接的缺损神经再生效果较差。

相关链接：周围神经损伤后的修复与神经再生是神经科学领域中倍受学者关注的研究热点之一。其基本要素包括种子细胞的选择、人工组织赖以附形的临时性支持结构及构建技术。目前针对骨骼肌条被桥接后修复缺损神经再生效果的研究结果颇不一致，影响神经再生的因素很多，其中肌桥构型的个性化差异可能是一个重要的原因。

张勇★，男，1962年生，山东省莱州市人，汉族，1986年中国医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事组织胚胎学教学、神经再生的研究。
zhangyong@hotmail.com

摘要
背景: 发展修复周围神经系统的技术已成为生物学家、生化工程师及材料学家多学科共同参与的重要研究课题。
目的：实验拟观察理想肌桥桥接神经缺损构型个性化差异对神经再生的影响。
设计、时间及地点：对比观察，于2004-06/2005-09在沈阳医学院完成。
材料：10只普通家犬，体质量20~30 kg。
方法：在静脉麻醉下，将犬右侧缝匠肌尾侧部和指浅屈肌中段肌条分别切成两段，一段置于体视镜下剥离观察；另一段常规苏木精-伊红染色后用图像分析其远、近端横断面的肌纤维截面积。取两种肌肉肌条分别缝接于自体左、右肢股神经缺损2 cm 处，常规锇酸染色后测定有髓神经纤维的数量。
主要观察指标：①肌桥的形态差异，肌条远、近端横断面的肌纤维截面积。②桥接左、右肢股神经缺损处有髓神经纤维的数量。
结果：①缝匠肌肌条内的肌纤维与肌条长轴基本平行；指浅屈肌肌条内的肌纤维走向与肌条长轴夹角较大。缝匠肌肌条内80%的肌纤维与肌条等长；指浅屈肌肌条内肌纤维则均短于肌条长度。指浅屈肌肌条内的肌纤维较粗，缝匠肌肌条内的肌纤维较细，两种肌桥内肌纤维的截面积有较大差异（P < 0.01）。②在锇酸染色标本上，有髓神经纤维的髓鞘呈粗细不等的黑色圆圈状。用缝匠肌尾侧部桥接的左侧股神经远段的有髓神经纤维明显比用指浅屈肌桥接的右侧股神经远段的有髓神经纤维多。
结论：由相对长度较大的肌纤维为主要构成的肌桥桥接缺损神经的再生效果较好。
关键词：肌桥；肌纤维长度；肌纤维横截面积；神经再生

张勇，杨晓霞，苏秋香，张庭深.理想肌桥桥接神经缺损构型个性化差异对神经再生的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3810-3813 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3810(ps).pdf]

Effects of individual differences of constructed muscle bridge on neural regeneration

Abstract

BACKGROUND：Studies on the reparation of peripheral nervous system are not only a key focus in medical research, but also a major topic for biologists, biochemical engineers and materialogy specialists.
OBJECTIVE: To investigate the individual difference of ideal muscle bridging neurologic defect configuration on nerve regeneration.
DESIGN, TIME AND SETTING: The control experiment was performed at the Shenyang Medical College from June 2004 to September 2005.
MATERIALS: Ten common dogs weighing 20-30 kg were used in this study.
METHODS: After intravenous anesthesia, muscle strips in the caudal right sartorius and middle musculus flexor digitorum superficialis of dogs were sliced into two segments. One was observed by dissection under a stereoscope. Another received Haematoxylin & Eosin (HE) Staining and transverse area of muscle fiber of distal and proximal ends was analyzed by image analysis. The same muscle strip was sutured at 2 cm neurologic defect region of autologous left and right limbs. Number of medullated nerve fibers was measured after osmic acid staining.
MAIN OUTCOME MEASURES: Morphological difference of muscle bridge, transverse area of muscle fiber of distal and proximal ends, and number of medullated nerve fibers at bridging femoral nerve defect of left and right limbs.
RESULTS: The muscle fiber in sartorius paralleled the longitudinal axis of muscle strip. The angle between muscle fiber in musculus flexor digitorum superficialis and the longitudinal axis of muscle strip was big. 80% muscle fiber in sartorius was equa1 to the length of the muscle bridge. Muscle fiber in the musculus flexor digitorum superficialis was shorter than the length of muscle strip. Muscle fiber in the musculus flexor digitorum superficialis was thick, whereas muscle fiber in sartorius was thin. There were significantly differences in transverse area of muscle fiber in the two kinds of muscle bridges (P < 0.01). Medullary sheath of medullated nerve fibers showed black circle-shape in different size. Medullated nerve fibers in the distal left femoral nerve bridged with caudal sartorius were more than that in the distal right femoral nerve bridged with musculus flexor digitorum superficialis.
CONCLUSION: Muscle bridging containing relatively long muscle fiber for nerve defect can obtain a good outcome of nerve regeneration.

Zhang Y, Yang XX, Su QX, Zhang TS.Effects of individual differences of constructed muscle bridge on neural regeneration.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3810-3813
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3810(ps).pdf]

周围神经缺损的修复，尤其是长段或多根神经缺损，是外科极富挑战性的课题之一。周围神经修复的核心内容是模拟周围神经的天然结构，将许旺细胞(Schwann cells，SCs)与生物支架材料构建成类似Bungner带的结构，为神经再生提供良好的引导、诱导、趋向和营养环境，促进神经再生。研究发现，通过反复冻融使骨骼肌变性，清除其中的肌质，可以使肌桥具有与神经Wallerian变性后相似的结构，同时具有基膜成分，又有低阻力定向通道，有利于再生神经轴突的生长[1-4]。目前，在修复周围神经缺损的研究中，肌桥对再生神经的诱导作用已无异议。但是，骨骼肌条被桥接后，缺损神经再生的效果颇不一致[5-7]。笔者认为影响神经再生的因素很多，其中肌桥构型的个性化差异可能是一个重要的原因。因此，为了探求更为理想的肌桥进行了本实验。

设计：对比观察。
时间及地点：实验于2004-06/2005-09在沈阳医学院完成。
材料：10只普通家犬，由沈阳医学院动物中心提供。
肌桥内肌纤维分离：在硫喷妥钠静脉麻醉下，沿犬右侧缝匠肌尾侧部和指浅屈肌中段边缘分别纵向切取肌条1 cm×3 cm，然后将每条肌条纵行切成均等的两段。将其中一段放入体积分数为0.3的乙醇内1 h 后，体视镜下剥离观察。
肌桥内肌纤维截面积观察：取另一段常规制片、苏木精-伊红染色后，镜下观察其形态差异并对肌条远、近端横断面的肌纤维截面积进行图像分析。
桥接：静脉麻醉后，沿犬左侧缝匠肌尾侧部和指浅屈肌中段边缘分别纵向切取肌条1 cm×3 cm，分别缝接于自体左、右肢股神经缺损2 cm 处的远、近端。
取材：术后300 d，切取桥接神经部位并分成神经近段（正常神经）、桥接段和神经远段（再生神经），常规制作锇酸髓鞘染色标本和透射电镜标本。通过图像分析软件(motic3.2)测定有髓神经纤维的数量。
主要观察指标：两种肌桥桥接神经缺损后远、近段光电镜结构变化及图像分析。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施及评估均为本文作者。评估采用盲法，实验参加者均经过动物显微外科手术培训。
统计学分析：由第四作者采用SPSS 11.0软件进行配对t检验。

2.1 肌桥构型观察结果
2.1.1 体视镜下剥离观察肌桥的形态差异尽管沿肌长轴纵行切取肌条，但并非所有肌条内肌纤维的方向均与肌条长轴平行。其中缝匠肌肌条内的肌纤维与肌条长轴基本平行，见图1；指浅屈肌肌条内的肌纤维走向与肌条长轴夹角较大，20°~25°，见图2。由于肌纤维起止及走向的差异，肌条内肌纤维的长度也存在一定差异。缝匠肌肌条内80%的肌纤维与肌条等长；指浅屈肌肌条内肌纤维则均短于肌条长度，其中10%的肌纤维稍大于肌条长度的1/2，90%的肌纤维仅为肌条长度的1/3左右。

2.1.2 肌桥内肌纤维截面积观察缝匠肌肌纤维截面积为（335.328±90.095）μm2，指浅屈肌肌纤维截面积为（1 765.701±308.446）μm2，两种肌桥内肌纤维的截
面积有较大差异（P < 0.01）；指浅屈肌肌条内的肌纤维较粗，见图3；缝匠肌肌条内的肌纤维较细，见图4。

2.2 桥接缺损神经实验结果
2.2.1 锇酸染色标本光镜观察在锇酸染色的标本上，有髓神经纤维的髓鞘呈粗细不等的黑色圆圈状。左侧股神经远段（用缝匠肌尾侧部桥接后的再生神经）的有髓神经纤维明显比右侧股神经远段（用指浅屈肌桥接后的再生神经）的有髓神经纤维多，见图5，6。

图像分析显示，用指浅屈肌桥接的右股神经有髓神经纤维的再生数量较少且与神经近段差异有显著性意义（P=0.015 3）；用缝匠肌尾侧部桥接的左股神经有髓神经纤维的再生数量较多，与神经近段无明显差异(P=0.111 1)。桥接神经远段神经再生的有髓神经纤维数量相比，差异有显著性意义（P=0.029 3），见表1。

2.2.2 透射电镜标本观察神经近段的有髓神经纤维较粗，髓鞘较厚、板层清晰、电子密度较高，见图7；神经远段有髓神经纤维较细，髓鞘较薄、板层不清晰、电子密度较低，见图8。表明再生神经经过10个月的发育，仍未完全成熟至正常程度；尽管神经近段（正常神经）与神经远段（再生神经）的有髓神经纤维形态存在一定差异，但是用缝匠肌尾侧部或指浅屈肌桥接后的神经远段（再生神经）的有髓神经在结构上未见明显差异。

周围神经修复的3个基本要素是：①种子细胞：是主宰周围神经功能性再生的细胞。②支架：是人工组织赖以附形的临时性支持结构。③构建技术：使种子细胞与支架结合、能在体内外有序生长并最终替代缺失的组织。研究发现，通过反复冻融使骨骼肌变性，清除其中的肌质，可以使肌桥具有与神经Wallerian变性后相似的结构，同时具有基膜成分，又有低阻力定向通道，有利于再生神经轴突的生长[8]。
目前，在修复周围神经缺损的研究中，肌桥对再生神经的诱导作用已无异议。但是，骨骼肌条被桥接后，缺损神经再生的效果颇不一致。笔者认为影响神经再生的因素很多，其中肌桥构型的个性化差异可能是一个重要的原因。基于本文观察，笔者认为：①除许多影响神经再生的因素外，肌桥内肌纤维走行方向及其相对长度的差异，也可能会影响神经纤维的再生效果。因为，外观为纵行的肌肉，即使沿其长轴纵向切取肌条，肌条内肌纤维的走向仍有可能与肌条长轴不平行。即使在与肌条长轴平行的缝匠肌肌纤维中仍至少有20%不与肌条等长，较短的肌纤维因其一端未被切断而以盲端存在、从而增加再生神经纤维通过的难度，进而影响再生神经纤维的有效通过率。②不同肌条内的肌纤维截面积相比，差异有显著性意义(F=11.464，P < 0.01)。这种差异一方面与该肌条所在肌肉的生理机能状态有关，另一方面也与肌纤维在肌桥内的走行方向有关，因为肌纤维走向与肌条长轴夹角较大的肌纤维多被斜断而显示出较大的截面积。但是，肌纤维截面积的大小对再生神经纤维通过率不会产生明显影响。因为按再生神经纤维的生长速度（2 mm/d）计算，通过2 cm 长肌桥的时间不超过15 d；而神经损伤后25 d，再生神经轴突的直径才达到2.3 μm，按轴突与神经纤维直径比例(6∶10)计算，此时再生神经纤维的直径大约为4 μm，即再生神经纤维的截面积均小于15 μm2，即使截面积较小的缝匠肌肌纤维也可以为再生神经纤维的通过提供足够的发展空间。所以，在理论上认为肌纤维越粗大越有利于再生神经纤维通过，而在实际应用中，肌桥内肌纤维截面积的大小不会对再生神经纤维通过率有明显影响。本实验对以缝匠肌尾侧部、指浅屈肌为肌桥分别缝接缺损股神经后、神经纤维再生情况的观察结果支持这一观点。即以相对长度较大但截面积较小的肌纤维为主要构成的缝匠肌尾侧部桥接的缺损神经再生效果较好；而以相对长度较小但截面积较大的肌纤维为主要构成的指浅屈肌桥接的缺损神经再生效果较差。因此，在选择较理想肌桥时，应考虑肌桥的肌纤维走向相对长度的差异及其可能产生的影响。
结论：在肌肉桥接神经的研究中，仅仅将外观为长条状的肌肉沿其长轴纵行切取肌桥是不够的，必须考虑到肌条内肌纤维方向与肌条长轴的关系及其可能产生的影响。

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孔吉明,钟世镇.用骨骼肌桥接周围神经缺损的实验研究[J].中华显微外科杂志,1986,9:68
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