兔尿道上皮细胞的体外连续培养**☆

王春杨，符伟军，张秉宏，洪宝发，高江平，王晓雄

课题背景：本课题为军队“十一五”医药卫生科研基金资助。已经完成携带药物或基因调控的生物可降解性支架的动物实验研究。目前正在进入临床实验阶段。

临床应用性：尿道黏膜上皮细胞的成功培养，为制作携带药物或治疗基因的可降解性生物内支架提供了条件，并为泌尿道外伤后组织器官缺损进行组织工程重建再造提供了新思路和新策略。

重要的概念：尿道组织工程技术经过初期的发展, 目前已进入组织工程化尿道血管化的研究, 并与基因技术结合, 开始在分子水平上寻找出路。今后的研究将模拟体内环境从促进种子细胞与支架的相互作用方面, 制备更加合适的组织工程支架进一步优化种子细胞的培养体系, 扩大种子细胞来源结合转基因技术, 增强基因表达的可控性为组织工程化尿道的标准化生产及应用创造条件。

王春杨☆, 男, 1972年生, 黑龙江省哈尔滨市人, 汉族, 2004年第四军医大学毕业, 博士，主治医师,主要从事泌尿外科肿瘤方面研究。
wangchunyang301@sina.com

通讯作者:符伟军，博士，副主任医师，解放军总医院泌尿外科，北京市 100853
fuweijun@hotmail.
com

军队“十一五”医药卫生科研基金资助课题(06MA298)*；军队530基金资助课题(53014)*

摘要
背景: 尿道损伤后的瘢痕挛缩或缺损可导致狭窄，寻找理想的修复替代材料已成为研究热点。
目的：探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法, 为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-04/2007-02在解放军总医院泌尿外科完成。
材料：健康成年雄性新西兰雄兔6只，体质量3.0~3.5 kg；实验用Dispase Ⅱ为美国Gibco公司产品。
方法：取雄性新西兰兔尿道黏膜组织，分离上皮采用Dispase Ⅱ工作液，上皮细胞间的分离采用混合消化酶(1.25 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L乙二胺四乙酸等体积混合)消化，以差速贴壁法排除成纤维细胞。使用DMEM与F12 3∶1混合培养液加体积分数为0.1的胎牛血清，对上皮细胞进行原代单纯培养和传代培养；取第2~6代细胞进行上皮细胞的免疫组织化学染色，以正常尿道黏膜组织石蜡切片为阳性对照组，以成纤维细胞铺片为阴性对照组。
主要观察指标：①利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态、生长、增殖情况。②采用活细胞荧光染色法观察细胞存活状态。③以扫描电镜观察细胞超微结构。④采用免疫组织化学染色行细胞鉴定。
结果：①原代培养3~5 d细胞逐渐生长融合成片, 如铺路石状, 细胞大小均一。生长期内均为单一的上皮细胞, 无成纤维细胞混杂生长, 细胞可传9~10代。②第4~6代细胞在免疫荧光染色和超微结构观察中显示良好形态。③免疫组织化学证实角蛋白染色阳性。
结论：应用组织工程技术，成功培养尿道上皮种子细胞。结果表明，细胞生长状态良好，增殖较快。经特异性免疫组织化学及形态学鉴定为纯化的尿道上皮细胞。
关键词：组织工程：尿道上皮；细胞培养；组织构建

王春杨，符伟军，张秉宏，洪宝发，高江平，王晓雄. 兔尿道上皮细胞的体外连续培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3822-3825 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3822(ps).pdf]

Effect of isoprel on the transformation of rat marrow mononuclear cells into osteoclasts

Abstract

BACKGROUND：Cicatricial contracture or defects may result in the stenosis after urethral injury, it is an urgent research topic to find out an ideal repair material.
OBJECTIVE: To study the technique and method of urethral epithelium culture in vitro, so as to lay the groundwork for reconstructing a tissue engineering urethra.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was performed at the Department of Urinary Surgery in Chinese PLA General Hospital between April 2005 and February 2007.
MATERIALS: Six healthy adult male New Zealand rabbits, weighing 3.0-3.5 kg, were adopted; Dispase II was produced by Gibco Company (USA).
METHODS: The urethral mucosa from male New Zealand rabbits was harvested, then epithelium and endothelial cells were isolated with Dispase II and digested with mixed enzyme (1.25 g/L trypsinase and 0.2 g/L edetic acid), and the fibroblast were removed by differential centrifugation. Primary culture and passage culture of the endothelial cells were conducted in the medium containing DMEM and F12 at the ratio of 3∶1, adding 0.1 volume fraction of fetal calf serum. The cultured cells at passages 2-6 were analyzed with immunohistochemistry. Paraffin section of normal urethral mucosa was taken as positive control group, and fibroblast slides were taken as negative control group.
MAIN OUTCOME MEASURES: Morphology, growth and proliferation of cells were observed dynamically under inverted phase contrast microscope. Cell survival was determined by living cell fluorescence staining. The ultra-microstructure of cells was observed under scanning electron microscope. Cell identification was performed by immunohistochemistry.
RESULTS: The primarily cultured cells fused when they had been cultured for 3-5 days. They were shaped as paving roads. During the growth phase, the cultured cells were all epithelial cells without fibroblasts, and could be subcultured 9-10 generations. Good configuration was found at passages 4-6 by immunofluorescence and electron microscopy.Immunohistochemistry revealed that keratin staining was positive.
CONCLUSION: By means of tissue engineering techniques, the urethral epithelium seed cells can be cultured successfully, and maintain the ability to grew well and proliferate rapidly. They have been identified as the purified urethral epithelial cells by specific immunohistochemistry and morphology.

Wang CY, Fu WJ, Zhang BH, Hong BF, Gao JP, Wang XX. Continuous culture of rabbit urethral epithelial cells in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3822-3825(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3822(ps).pdf]

0 引言

尿道损伤后导致狭窄或缺损的临床治疗很困难，寻找理想的修复及替代材料成为治疗尿道狭窄的研究热点。组织工程学应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发能修复损伤组织结构、恢复或改善其功能的生物替代物，通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生物活力的新的组织，达到修复组织缺损的目的。本实验采用组织工程技术，探讨尿道黏膜上皮细胞的体外培养技术和方法，培养尿道上皮种子细胞，为进一步研究组织工程尿道提供实验基础。

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2005-04/2007-02在解放军总医院泌尿外科完成。
材料：健康成年雄性新西兰雄兔6只，体质量3.0~3.5 kg（解放军总医院实验动物中心提供,许可证号: SCXK(北京) 2004-2007）。

兔尿道上皮细胞原代培养：新西兰雄兔以“速眠新Ⅱ”0.2 mL/kg肌肉注射，全身麻醉成功后，取仰卧位，四肢妥善固定于动物专用手术台，用10％碘伏溶液消毒会阴部及外生殖器，铺消毒洞巾。以膀胱组织活检钳自外尿道口伸入尿道至球部，钳夹取得球部腹侧壁黏膜组织两三块，大小约2×3 mm。所取尿道黏膜迅速放入加有适量庆大霉素的DMEM/F12培养液 (3∶1)，以D-HanK’s液漂洗黏膜组织两三遍，浸入适量2.4 U/mL Dispase Ⅱ工作液，静置消化30 min。以眼科镊机械分离上皮与真皮层，将上皮层用眼科剪充分剪碎。继之以混合消化酶(1.25 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L乙二胺四乙酸等体积混合)振荡消化15~20 min。加入适量D-hank’s 液，以1 000 r/min低速离心5 min，弃去离心液，加适量D-hank’s液，用吸管吹打成单细胞悬液后以200目尼龙纱巾过滤，接种于中号培养瓶内，加入适量DMEM/F12培养液，以差速贴壁法排除成纤维细胞等混杂细胞。在 37 ℃温度下培养于体积分数0.05的CO2恒温孵育箱，两三天换液1次，四五天后，细胞生长、增殖至70％~80％融合时予以1∶3传代继续培养。在培养过程中，以倒置显微镜观察细胞纯度、形态、生长状况、有无污染等，根据实际情况实时采取差速贴壁等方法纯化培养出上皮细胞。
倒置相差显微镜：培养过程中，利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态、生长、增殖情况。
细胞存活状态观察：采用活细胞荧光染色法对所培养的、预种植于支架上的兔尿道上皮细胞进行染色，观察细胞存活状态。染料选用碘化丙啶(PI)。①用磷酸盐缓冲液配备l× 109 L-1的单细胞悬液。②碘化丙啶染液配制：碘化丙啶 15 mg，枸橼酸钠0.1 g，NP-40 0.3 mL，加蒸馏水至100 mL，4 ℃避光保存。③将等体积的细胞悬液和碘化丙啶染液混合，4 ℃ 放置20~30 min。④在荧光显微镜下观察细胞着色情况。
扫描电子显微镜：将细胞接种于预涂胶原的盖玻片上，培养两三天后取出，分别经体积分数0.03的戊二醛磷酸缓冲液、固定，脱水，干燥，喷金，在Hitachi-S4800扫描电镜下观察细胞立体形态。
上皮细胞的免疫组织化学鉴定：将培养的2~6代细胞消化后接种于24孔板制作细胞爬片，待细胞增殖到适当密度时以体积分数0.95乙醇固定，采用广谱单克隆角蛋白抗体(鼠抗人)及即用型第二代免疫组织化学Elivision TM Plus广谱试剂盒进行免疫组织化学染色。分别设立实验组(培养细胞)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片)及阴性对照组(成纤维细胞铺片)。免疫组织化学染色步骤按照试剂盒说明书操作。
中性粘多糖PSA染色鉴定：①细胞爬片和石蜡切片的准备：取正常兔尿道原代上皮细胞培养两三代后，以细胞爬片法将细胞转移至盖玻片上继续培养一两天，取出爬片，D-Hank’s液漂洗，用体积分数0.95乙醇固定 20 min后待用。②取正常兔尿道组织石蜡切片，常规脱蜡处理。③以上细胞爬片和组织切片各自经蒸馏水漂洗，放进体积分数0.005的过碘酸液氧化10 min，Schiff液15 min，体积分数0.005偏亚硫酸钠液5 min，水洗，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，树胶封固。
主要观察指标：①细胞培养、鉴定结果。②免疫荧光染色结果。③超微结构观察。④上皮细胞的免疫组织化学鉴定结果。
设计、实施、评估者：设计、评估者为第二、三作者，实施为全部作者，均受过专业培训。

2.1 细胞培养、鉴定结果所取黏膜经前述方法处理后，原代细胞贴壁前为体积较小的圆形或类圆形细胞，胞浆均匀、透亮，轮廓清晰光滑，倒置相差显微镜下有立体感。接种后2~4 h，部分细胞下沉贴附于培养瓶底壁，见图1a，8~12 h大部分细胞已贴壁，见图1b。随后细胞逐渐伸展，细胞突起逐渐展开，细胞扁平变大，胞核清晰，细胞大小为伸展前的两三倍，见图1c。部分较原始细胞形态似“煎鸡蛋”样形态。此阶段细胞增殖不明显，核分裂相少见，见图1d。接种3~5 d后细胞加速增殖，核分裂相多见，细胞数量明显增多，逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一，见图1e。传代细胞一两个小时即可完全贴壁伸展。第4~6传代细胞形态良好，与原代无明显区别，见图1f。
2.2 免疫荧光染色细胞密度疏散均匀，着色鲜明。细胞核显示橙黄色，胞体呈铺路石样形态，显示绿色。未见到着染呈红色的死亡细胞，见图2b。
2.3 超微结构观察取体外培养约20 d传代细胞，扫描电镜可见细胞呈扁平状，突起明显，表面有许多微绒毛和脊样胞浆皱褶，见图3a，d。部分细胞形态呈银杏叶样，见图3c，并可见部分细胞正值有丝分裂的纺锤体时期，见图3b。
2.4 上皮细胞的免疫组织化学鉴定结果培养细胞胞浆、胞膜角蛋白染色呈棕褐色，着色均一。着色特征与阳性对照黏膜上皮细胞一致(图2a)。视野中未见到与阴性对照(成纤维细胞)一样不着色的细胞。免疫组织化学PAS染色后，尿道上皮组织细胞和培养的细胞均呈阳性着色，为深紫红色。上皮组织细胞外基质对中性粘多糖亦呈较均匀阳性反应，只是着色程度比上皮细胞浆淡(图2c)。

尿道狭窄和缺损既往常采用非尿道组织如皮肤、颊黏膜、膀胱黏膜等的修复，易导致感染、尿瘘、再狭窄
等并发症。近年来以牺牲健康组织去修复病损组织的治疗模式已经受到严峻挑战，应用组织工程技术构建组织工程化尿道提供了根本的解决方法[1-6]。
工程化组织的构建需要大量良好活性的种子细胞，其中自体组织细胞能避免排斥反应, 经组织活检获得, 通过体外分离、培养、纯化、扩增和传代, 得到足够数量的细胞后种植于三维支架材料上, 使之黏附、分化、生长, 并分泌细胞外基质，最终形成“活”的尿道替代材料[7]。近年来全能干细胞培养在泌尿系统的应用取得一定进展[8-14]，但尚未能为尿道黏膜上皮细胞培养提供完美地方法。
关于尿道上皮细胞培养技术，文献报道较少[15-19]。作者根据既往研究报道尝试培养兔原代尿道上皮细胞[15-16]。原代黏膜上皮细胞的获取，有组织块培养法及消化培养法两种。消化培养法能将妨碍细胞生长的细胞间质(基质、纤维等)除去，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸取养分和排出代谢产物。在原代就可以使细胞得以基本纯化，得到的活细胞数量较多[20]。分离上皮时，首先采用了Dispase Ⅱ，该酶是一种提取自多粘杆菌、作用温和的分离上皮与真皮的中性蛋白酶。作用于基底膜，选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原，而保存上皮细胞活力及细胞连接[21]。与胰蛋白酶相比，Dispase Ⅱ只是将上皮分离而不分解单个角化细胞，在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基底膜处完全分离。上皮细胞间的分离，本实验采用混合消化酶(1.25 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L乙二胺四乙酸等体积混合)消化法[16]。以往培养角化细胞，大多采用3T3细胞作为滋养层细胞，实施共培养[22]。但作者未采用滋养细胞，而是使用DMEM与F12 3∶1混合培养液加体积分数为0.1的胎牛血清，对兔尿道上皮细胞尝试原代单纯培养。体积分数为0.1的胎牛血清除了提供细胞生长的营养成分外，还能促进细胞DNA合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子，该混合培养液中还含有胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松等多种细胞生长必需的养分。实验结果表明，上皮细胞生长状态良好，增殖较快。
本实验发现所培养的细胞为类圆形，大小均一，如铺路石状密集排列，胞核大，符合尿道移行上皮细胞形态特点。活细胞荧光碘化丙啶染色是检测细胞死活状态的灵敏方法。本实验碘化丙啶荧光染色显示，细胞疏密均匀，着色鲜明。细胞核显示橙黄色，胞体扁平铺路石样形态，显示绿色。视野中未见到核着染呈红色的细胞，说明培养的细胞为成活细胞，生长、增殖状态良好，未见明显死亡细胞。细胞接种3~5 d后细胞增殖加速，传代后细胞生长稳定。在第9~10代后细胞增殖逐渐减慢，第4~6代细胞显示良好生长形态。扫描电镜下细胞多呈镶嵌状排列，细胞突起明显，表面可见丰富的微绒毛和脊样胞浆皱褶，表明细胞活力良好。角蛋白是上皮细胞的主要结构蛋白和分化的标志产物，是上皮细胞特异性表达蛋白。本实验采用广谱单克隆角蛋白抗体免疫组织化学染色，证实分离培养的细胞胞浆、胞膜染色阳性，阴性对照组(成纤维细胞)未见着色，可证明培养细胞为尿道上皮细胞[20]。PAS染色结果显示，尿道上皮组织细胞和培养的细胞均呈阳性着色，为深紫红色。上皮组织细胞外基质对中性粘多糖亦呈较均匀阳性反应，只是着色程度比上皮细胞浆淡。说明细胞胞浆中含丰富的中性粘多糖。进一步证明培养的细胞为尿道上皮细胞，而且保持分泌中性粘多糖的基本功能。
本实验采用组织工程技术，成功培养尿道上皮种子细胞，结果表明，以活检法获得尿道上皮细胞，培养操作比较简单、易行。所培养的细胞经特异性免疫组织化学及形态学鉴定，为纯化的尿道上皮细胞。为进一步种植尿道上皮细胞生物可降解尿道支架的研究提供了实验基础。

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