内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管：最适比例验证*★

谢尚喆，刘水，方宁涛，高红阳，王松梅，潘銮凤

课题背景：课题为上海市科委基金资助重点项目(04JC14012)。外周血中的内皮前体细胞经过简单的静脉穿刺即可获得，在体外可以迅速分化为成熟的内皮细胞，增殖能力旺盛，且可有效减少血小板的黏附和血栓形成。人们发现内皮前体细胞虽然有多种优势，但单纯内皮前体细胞构成血管材料也存在问题：如应用至体内生理功能低下；血管材料缺乏弹性；在流体力学环境下，黏附能力下降等。本课题将内皮前体细胞与平滑肌共同培养，为克服这些不足作相应探索。

应用要点：①实验证实了内皮前体细胞在Ⅰ型胶原凝胶上与平滑肌细胞一样，具有很强的增殖能力，同时在平滑肌细胞帮助下可形成血管样结构。②并进一步证明了两种种子细胞共同培养的适宜比例。

相关链接：组织工程血管是利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料。多年前，就有研究者尝试用成熟内皮细胞和平滑肌细胞这两种血管壁的主要组成细胞联合培养构建组织工程血管。近年来，随着干细胞生物学的发展，开始有学者尝试将成体干细胞，如内皮前体细胞和间充质干细胞等作为种子细胞应用于组织工程血管构建研究。

谢尚喆★，女，1982年生，上海市人，汉族，2007年复旦大学上海医学院毕业，硕士，主要从事组织工程血管的研究。
xieshangzhe@
sina.com

通讯作者：潘銮凤，副教授，复旦大学上海医学院分子生物学实验室，上海市
200032

摘要
目的: 由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件。实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长，以及两种细胞的最适比例。
方法：实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。①实验材料：新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。②实验方法及评估：从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞，免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况；采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞，经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型；无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶，在其上以3∶1~4∶1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞，并观察两种细胞联合培养时的形态，分析两种细胞最合适的种植比例；免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况。
结果：①原代培养的平滑肌细胞呈典型“波峰谷”形态，荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性。②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后，呈现出“铺路石”样形态，表达CD31、vWF，结合荆豆凝集素，提示具备成熟内皮细胞特性。③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛，与平滑肌细胞以3∶1~4∶1的比例种植在Ⅰ型胶原凝胶培养一段时间后，内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持，形成血管样网络结构。④共培养1周后，CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接，形成环形结构。
结论：内皮前体细胞和平滑肌细胞以3∶1~4∶1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成。
关键词：内皮前体细胞；平滑肌细胞；联合培养；Ⅰ型胶原凝胶；血管组织工程

谢尚喆，刘水，方宁涛，高红阳，王松梅，潘銮凤．内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管：最适比例验证[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3826-3830
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3826(ps).pdf]

Co-culture of endothelial progenitor cells and smooth muscle cells to construct tissue-engineered blood vessel: Optimum culture ratio

Abstract

AIM：Co-culture of endothelial precursor cells (EPCs)-differentiated endothelial cells and smooth muscle cells (SMCs) makes the natural tissue-engineered blood vessels possible. This study explored the promoting effect of the co-culture of endothelial cells and SMCs on vascular endothelial cells (VECs) and investigated the optimal ratio of two kinds of cells.
METHODS: The experiment was performed at the Laboratory of Molecular Biology, Shanghai Medical College of Fudan University between January 2006 and May 2007. Fresh umbilical core was provided by Shanghai First Women and Children Health Care Hospital with the informed consent from the puerperant. Human SMCs were separated from the arteries of umbilical cords. The smooth muscle phenotype was confirmed by indirect α-actin immunofluorescent staining. EPCs were isolated from fresh human umbilical cord blood by density gradient centrifugation, and induced to differentiate into endothelial cells, followed by assessing their phenotype by immunofluorescent staining. Type Ⅰ collagen gel was fabricated aseptically, on which EPCs and SMCs were co-cultured at different ratios (3∶1 to 4∶1). The morphology of co-cultured cells was examined. Immunofluorescent staining was applied to observe CD31 and vWF expressions and endothelial cells growth on type Ⅰ collagen gel.
RESULTS: Primarily cultured SMCs displayed specific hill and valley morphology and expressed SM α-actin confirmed by immunofluorescent staining. EPC-derived endothelial cells showed a typical cobblestone morphology, expressed vWF and CD31, and bind human endothelial cell-specific lectin, Ulex Europaeus agglutinin-1. This suggested cell population became endothelial in nature. After seeded on type Ⅰ collagen gel, the cells grew well. At ratio of 3∶1 to 4 ∶ 1, EPCs with SMCs formed blood vessel-like network structure. vWF and CD31 immunofluorescent staining showed EPCs formed micro-vascular network only one week after co-cultured with SMCs on type Ⅰ collagen gel.
CONCLUSION: EPCs and SMCs co-culture at ratios of 3∶1 to 4 ∶1 can facilitate the formation of blood vessel-like network.

Xie SZ, Liu S, Fang NT, Gao HY, Wang SM, Pan LF. Co-culture of endothelial progenitor cells and smooth muscle cells to construct tissue-engineered blood vessel: Optimum culture ratio.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3826-3830(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3826(ps).pdf]

0 引言

组织工程血管是具有临床应用潜力的血管移植物，由种子细胞种植于生物可降解材料上构建[1]。构建组织工程血管的关键种子细胞为血管内皮细胞和平滑肌细胞，目前主要来源于自体血管组织，不但技术复杂，采集的细胞数量低，而且还会给机体造成创伤，因此常规的临床应用并不现实[2]。内皮前体细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）是近年来发现的、来源于外周血的一类能够自我更新、增殖分化的定向干细胞，在体外适宜条件下可很快分化为成熟的内皮细胞，并表现出极强的增殖能力[3-4]，是一种非常有应用前景的组织工程血管种子细胞来源。
前体细胞分化的内皮细胞与平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件[5]。在血管生成的调控机制尚不完全清楚的情况下，联合细胞培养技术为复杂的细胞诱导分化和体外构建血管提供了新思路、新方法[6]。

设计：单一样本观察。
单位：复旦大学上海医学院分子生物学实验室。
材料：实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。
主要试剂：M199培养液（Gibco-BRL，美国）；胰酶-乙二胺四乙酸、HISTOPAQUE-1083、FITC-UEA-1、DAPI（Sigma公司）；小鼠抗人SM α-actin、小鼠抗人CD31单抗、兔抗人vWF多抗（NeoMarkers公司）；罗达明标记羊抗小鼠IgG（1∶100）（Miles Scientific公司）；EGM-2-MV培养液（Cambrex公司）；FITC-马抗小鼠IgG、罗达明-羊抗兔IgG（1∶150）（Chemical公司）；胶原（BD Biosciences公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、六作者，干预实施为第一作者，评估为全部作者。均受过正规系统培训，未采用盲法评估。
方法：
人血管平滑肌细胞的分离与培养：无菌条件下取 25 cm 长新鲜脐带，各剪去脐带两端1 cm 后，用镊子分离出脐动脉膜层，眼科剪将其剪成约 1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，并用长吸管将其均匀排放于培养瓶底部，组织块在瓶底贴牢后，翻转培养瓶，用M199培养液进行培养。待细胞长出，融合率达到70%~80%时，以0.25 g/L 胰酶-0.1 g/L EDTA消化传代，按1×104 cm-2 的密度接种。取3~6代用于实验。
平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定平滑肌细胞：细胞爬片固定封闭后，一抗滴加小鼠抗人平滑肌肌动蛋白单抗（1∶400）100 μL，室温孵育30 min，二抗滴加罗达明标记羊抗小鼠IgG（1∶100）100 μL，室温孵育30 min，最后加0.5 mg/L 的DAPI，衬染细胞核3 min。免疫荧光显微镜观察拍照。
内皮前体细胞的分离培养与诱导分化：无菌条件下取脐血20 mL，肝素抗凝，等体积磷酸盐缓冲液稀释。分别将6 mL 稀释脐血平铺于4 mL HISTOPAQUE-1083分离液上。2 000 r/min 离心20 min，收集分离液和血清交界处细胞层，用10 mL 磷酸盐缓冲液稀释，800 r/min 离心8 min，弃上清。如此洗涤细胞二三次，以去除分离液成分和血小板。用EGM-2-MV（Sigma）重悬细胞，并调整单个核细胞浓度为1×109 L-1，接种于6孔板中。在培养的第4天吸掉未贴壁细胞，并更换新EGM-2-MV培养液，以后每二三天换液1次，每天观察细胞生长情况。
内皮细胞鉴定：①抗人CD31免疫荧光染色：一抗滴加小鼠抗人CD31单抗（1∶100）100 μL，室温孵育30 min，二抗滴加FITC-马抗小鼠IgG（1∶100）100 μL，室温孵育30 min。②抗人vWF免疫荧光染色：一抗滴加兔抗人vWF多抗（1∶100）100 μL，室温孵育30 min，二抗滴加罗达明-羊抗兔IgG（1∶150）100 μL，室温孵育30 min。③荆豆凝集素（UEA-1）结合实验：将 10 mg/L FITC-UEA-1滴加于固定并封闭的细胞爬片上，室温孵育1 h。冲洗后滴加防荧光淬灭封片介质，封固。荧光显微镜下观察拍照。
Ⅰ型胶原凝胶的制备：冰上加入所需凝胶终体积1/10的10×磷酸盐缓冲液；计算所需要加入商品胶原的体积使凝胶终体积为1.5 g/L；加入1 mol/L NaOH，体积为所需要商品胶原体积的2.3%；加入ddH2O以补足终体积；混匀上述加的各种溶液；最后加入商品胶原。24孔板每个孔加入300 μL 凝胶，37 ℃ 放置1 h 后使用。
内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养：将培养的已分化成熟的内皮细胞与平滑肌细胞分别从培养瓶中消化并制成单个细胞悬液，分别将内皮细胞与平滑肌细胞以3∶1~4∶1的比例混匀和对照组内皮细胞滴加在已凝固的Ⅰ型胶原凝胶上。
主要观察指标：①脐血中的内皮前体细胞定向分化为内皮细胞及其表型鉴定。②内皮前体细胞与平滑肌细胞在Ⅰ型胶原凝胶上最合适比例的种植与网络状血管形成。

2.1 人平滑肌细胞的培养及鉴定从人脐带动脉中分离培养第3代的平滑肌细胞增殖力旺盛，细胞形态比较均一，呈长梭形，有一卵圆形或圆形的核，核中有1~4个大小不一的深色核仁，细胞浆丰富，含少量颗粒。传代细胞生长特性与原代细胞基本相同，四五天就可以汇合并表现出波峰波谷样形态；部分细胞密集的区域会有多层细胞重叠生长的现象，见图1a。细胞平滑肌肌动蛋白染色阳性，细胞内可见排列规则的细胞骨架结构，见图1b；人胚胎肾细胞作为阴性对照无此现象，仅可见DAPI衬染的细胞核，见图1c。
2.2 由内皮前体细胞分化来的内皮细胞的培养与鉴定内皮前体细胞来源的内皮细胞呈现出典型的“铺路石”样形态，见图2a；用成熟内皮细胞标志物检测，内皮细胞的膜上有CD31（PECAM）表达，尤其是在细胞相互接触的部位CD31强阳性表达，见图2b；内皮细胞的胞浆里高表达vWF，而且可以观察到典型的W-P小体结构，见图2c；内皮细胞可以结合FITC-荆豆凝集素，在荧光显微镜下，整个细胞均阳性着色，见图2d。
2.3 光镜观察内皮细胞与平滑肌细胞在Ⅰ型胶原凝胶支架上的生长将内皮细胞与平滑肌细胞以3∶1~4∶1的比例种植在Ⅰ型胶原凝胶支架上。1 d 后，细胞在支架上逐渐慢慢铺展开来，见图3a；再培养2 d 以后，细胞体积变大，数量也明显增多，见图3b；种植5 d 后，细胞增殖明显，并且两种细胞之间互相关联，显出形成环形结构的潜能，见图3c；培养1周后，两种细胞均增殖力旺盛，初步形成脉管样的结构，见图3d。而对照组单独培养的内皮细胞则无此特性。

2.4 免疫荧光染色观察已分化的内皮细胞与平滑肌细胞在Ⅰ型胶原凝胶支架上的生长在胶原凝胶上共培养已分化的内皮细胞与平滑肌细胞1周后，对血管内皮细胞标志物vWF（见图4a）和UEA-1（图4b）进行免疫荧光染色，可见这些标志物阳性的内皮细胞互相连接形成微血管网络结构。

内皮前体细胞存在于脐带血和成人外周血中，通过简单的静脉抽血即可获得，创伤小；而且比血管来源的细胞生长快并且有分化到各种细胞的潜能[7-8]。内皮前体细胞的功能不仅可代替成熟内皮细胞作为种子细胞，还可分泌细胞因子和生长因子增强成熟内皮细胞的功能与存活[9-11]。此外，外源性细胞生长因子（如血管内皮生长因子和粒细胞集落刺激因子）可以动员骨髓中的内皮前体细胞到外周血中，使外周血中内皮前体细胞数量成倍增加，克服了外周血中内皮前体细胞数量少这一缺陷[12]。近年来，大量研究表明，平滑肌细胞与内皮细胞联合种植对于构建组织工程血管有重要意义[13-14]。Wu等[15]将内皮细胞与人平滑肌细胞联合种植在多孔生物可降解三维支架上，在支架中观察到血管样结构，而在只种有内皮细胞的支架中则无血管化迹象。本实验同样证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长和形成血管结构。本实验还提示当内皮细胞与平滑肌细胞以3∶1 ~4∶1比例种植时，最易形成血管样结构。当内皮细胞过多时，不易从平滑肌细胞处得到支撑从而形成环形结构；而当平滑肌细胞过多时，由于平滑肌细胞增殖能力强过内皮细胞，具有生长优势的平滑肌细胞极易限制内皮细胞的增殖。
平滑肌细胞的促内皮细胞形成血管样结构功能，可能与平滑肌前体细胞分泌血管内皮生长因子、弹性蛋白等有关[16]，也可能与促进内皮细胞的迁移有关[17]。平滑肌细胞还可以通过直接或间接的方式影响内皮细胞前列腺环素的合成和分泌活动，使得联合培养内皮细胞中前列腺环素的分泌量增加最多[18]。因此，联合培养的内皮细胞种植后还可以更有利于抑制血小板在移植物局部的聚集，更有利于防止血栓的形成[19]。
鼠尾腱胶原在结构和抗原性方面与人体组织的Ⅰ型胶原基本相同，来源广泛、成分较为单一、制备较方便，血管平滑肌细胞在该基质中能长时间地保持活力，故被选用作为培养基质[20]。本实验中利用的鼠尾胶原（Ⅰ型胶原为主）浓度为1.5 g/L，制成的凝胶是适合细胞生长的三维结构，既利于内皮细胞贴附、迁移和分支，又可提供清晰视野。除促进细胞增殖分化外，胶原凝胶中若添加血管内皮生长因子等生长因子还促进细胞表达VE-Cadherin、CD31以及整合素等，这些黏附分子有利于内皮细胞相互连接成管状以及黏附于胶原进而迁移[21]。与平滑肌共同培养的内皮细胞可以与平滑肌细胞互相融合，从平滑肌细胞得到形成血管的支持，在体外较快形成管腔样结构。
已经十分清楚，血液动力学变化可对内皮细胞及平滑肌细胞的形态、功能等产生巨大影响[22]。因此，笔者希望将来能选择合适的血管组织工程学培养环境，包括机械或物理刺激的调整等，构建更接近天然的组织工程血管。

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