实验犬浅静脉内皮细胞原位获取及体外培养*☆

施德兵，符伟国，何红兵，刘震杰，张祥满，史振宇

课题背景：课题由国家高技术研究发展计划（“八六三”计划）（2006AA03Z0448）资助。冠心病、外周动脉闭塞性疾病等较多需要小口径血管（直径< 6 mm）行动脉移植手术。目前临床上已用的小口径血管移植物包括自体大隐静脉或乳内动脉、涤纶和膨体聚四氟乙烯人工血管等各有缺陷。因此，人们迫切需要研制新的小口径动脉替代物。

临床应用性：实验采用原位插管、0.1%胶原酶灌注消化法获取犬浅静脉内皮细胞，经形态学、第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色法和透射电镜检测对获得细胞进行鉴定证实为内皮细胞来源，有效提高了血管内皮细胞培养成功率。

同行评价：课题选题较好，结合临床需要，对自体血管内皮细胞培养技术加以改进，为进一步的深化研究打下了基础，对组织工程血管进一步基础和临床应用研究有重大意义。

施德兵☆，男，1977年生，安徽省和县人，汉族，复旦大学附属中山医院血管外科在读博士，住院医师，主要从事血管外科临床和基础的研究。
shidebing7819@163.com

通讯作者：符伟国，博士，教授，博士生导师，复旦大学附属中山医院血管外科，上海市 200032
fu.weiguo@zs-
hospital.sh.cn

摘要
背景：自体血管内皮细胞数量有限且体外长期培养传代后存在功能老化，是目前制约组织工程血管发展的问题。
目的：实验拟验证通过体外分离和大规模培养方式为组织工程动脉支架体外内皮化提供血管内皮细胞的可行性。
设计、时间及地点：重复测量设计，实验于2007-03/12在复旦大学附属中山医院中心实验室完成。
材料：健康杂种犬6只，雌雄不拘，体质量35~40 kg，用于获取血管内皮细胞。
方法：将犬麻醉后前肢隐静脉原位插管，采用Ⅰ型胶原酶消化法获取血管内皮细胞，体外培养、传代并大规模扩增。采用微格法每日计数培养的细胞总数。
主要观察指标：倒置显微镜观察细胞生长情况，透射电镜和细胞免疫化学进行细胞鉴定，检测原代和传代细胞的条件培养液中6-酮-前列腺素F1α和Ⅷ因子相关抗原的含量。
结果：倒置显微镜下观察静脉内皮细胞呈典型的“纺锤样”梭形细胞，单层细胞贴壁生长至融合时呈铺路石样排列。透射电镜下见内皮细胞胞浆中特征性Weibel-Palade小体。细胞免疫化学显示血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原抗体染色阳性。原代及传代细胞培养上清液中6-酮-前列腺素F1α和Ⅷ因子相关抗原的含量差异无显著性意义（P > 0.05）。
结论：实验成功培养、传代并大规模扩增静脉血管内皮细胞。所培养的静脉内皮细胞可以为组织工程动脉支架体外内皮化提供足够数量和功能良好的细胞。
关键词：组织工程；犬；内皮细胞；体外培养；原位获取

施德兵，符伟国，何红兵，刘震杰，张祥满，史振宇.实验犬浅静脉内皮细胞原位获取及体外培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3831-3836 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3831(ps).pdf]

In situ harvest and in vitro culture of endothelial cells derived from adult canine superficial vein

Abstract

BACKGROUND:Current issues in vascular tissue engineering included limited sources and aging of autuolgous vascular endothelial cells after long-term subculture in vitro.
OBJECTIVE：To investigate the feasibility of providing vascular endothelial cells for the confluent in vitro lining of the scaffolds of tissue-engineered artery by in vitro isolation and large-scale culture.
DESIGN, TIME AND SETTING: The repeated measurement design experiment was performed at the Central Laboratory of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University from March to December 2007.
MATERIALS: Six healthy hybrid canines of both genders and weighing 35-40 kg were selected to isolate canine vascular endothelial cells.
METHODS：Enzymatic endothelial cell detachment was achieved by the in situ cannulation with type Ⅰ collagenase to short saphenous vein segments of experimental canine after anesthesia. The vascular endothelial cells were cultured in vitro and mass cultured. A microgrid technique was used to enable the daily in situ quantification of available endothelial cells.
MAIN OUTCOME MEASURES: Vascular endothelial cells were identified by the morphologic characteristics observed under an inverted microscope, a transmission electron microscope and by immunohistochemical staining. The both 6-keto-PGF1α and factor Ⅷ contents in the supernatant of primary and subcultured passages were analyzed.
RESULTS: Vascular endothelial cells presented typical “spindle-shaped”, elongated, polygonal or round appearance and formed monolayer that arrayed in “cobblestone-like” morphology under the inverted microscope. Endothelial cell Weibel-Palade (“W-P”) body was sometimes observed under the transmission electron microscope. Immunohistochemical analysis indicated that these cells were positively stained for factor Ⅷ. The 6-keto-PGF1αand factor Ⅷ contents in the supernatant of primary and subcultured passages did not have significant difference (P > 0.05).
CONCLUSION：A mass of endothelial cells we cultured may be used as a source for providing well functional and a sufficient number of cells for the endothelialization of the scaffolds of tissue-engineered artery.

Shi DB, Fu WG, He HB, Liu ZJ, Zhang XM, Shi ZY. In situ harvest and in vitro culture of endothelial cells derived from adult canine superficial vein.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3831-3836(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3831(ps).pdf]

采用组织工程技术体外构建小口径组织工程动脉首要的步骤就是分离种子细胞。种子细胞来源有多种，自体血管细胞是较理想的种子细胞之一，血管内皮细胞在调节血液循环、维持内环境稳定和生命活动的正常进行中具有十分重要的意义。由于构建组织工程动脉需要接种高浓度内皮细胞，而自体血管内皮细胞数量有限以及体外长期培养传代后存在功能老化问题，因此如何在体外成功分离和大规模培养，并能在传至一定代次内维持正常生理功能是本实验首先需要解决的问题。

设计：重复测量设计。
时间及地点：实验于2007-03/12在复旦大学附属中山医院中心实验室完成。
材料：健康杂种犬6只，雌雄不拘，体质量35~40 kg，购买并饲养于复旦大学附属中山医院动物实验中心(动物合格证号：沪医动字026号)。
静脉血管标本的获取、原位插管[1]和灌洗：实验犬复合麻醉成功后取仰卧位，前肢小腿前缘纵形切口，逐层切开皮肤和皮下组织，显露并游离较粗的1根隐静脉，尽可能不触摸血管，结扎其属支，用1号丝线结扎该段血管近、远端，并牵拉血管使其有一定张力，然后由两端分别向血管腔插入末端带有“三通”的医用头皮针管。由远端“三通”用不完全M199培养基(不含胎牛血清和生长因子)搏动性灌注血管3次，由近端“三通”收集灌洗液。然后关闭近端“三通”测量血管的长度和直径。
酶消化法分离静脉内皮细胞、培养和纯度检测：该段血管灌洗后由远端“三通”缓慢注入 10 mL 1 g/L Ⅰ型胶原酶，待近端有少量酶液流出时关闭近端“三通”，将剩余的胶原酶注入使静脉管壁微微充盈后关闭远端“三通”。取出该段盛有Ⅰ型胶原酶的静脉，放入37 ℃ 恒温水浴箱中孵育15 min。于细胞培养室超净台中收集消化液，并用含有体积分数为0.1胎牛血清的M199培养液冲洗静脉腔，轻柔血管中间段，收集冲洗液于同一个离心管中，室温下离心 (100 g，10 min)。去上清，加入1.5 mL M199完全培养液(内含体积分数为0.1的胎牛血清和25 μg/L 人碱性成纤维细胞生长因子)重悬沉定细胞。用1 mL 注射器接4.5号针头吸打细胞悬液均匀分散细胞团。
取样50 μL，加入结晶紫溶液50 μL，混匀，室温放置10 min，血球计数板计数细胞总数，按公式计算：细胞总数(个)=(4大格细胞数之和/4)×104×细胞悬液体积(mL)。另取样 50 μL，加入0.4%锥虫蓝溶液50 μL 混匀，血球计数板计数100个细胞，计数着色的细胞数再按公式计算：细胞存活率(%)=(100－着色细胞数)/100×100%。细胞的获取率(cm-2)=获取的细胞总数/所取血管的表面积(cm-2)；将细胞悬液混匀后滴加少许于血球计数板上，甩干后用4 ℃ 丙酮固定，晾干，滴加鼠抗人Ⅷ因子相关抗原抗体(1∶200)，37 ℃ 孵育30 min，滴加二抗工作液(羊抗鼠IgG-FITC)，室温孵育2 h。
在普通和荧光显微镜下对同一视野中细胞进行计数，按公式计算：获取细胞纯度(%)=(荧光染色阳性细胞/细胞总数)×100%。然后将上述细胞悬液接种于直径3.5 cm 培养皿，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内静置培养。以后每周换液2次，每次半量换液。每日倒置显微镜下观察细胞生长情况，微格法每日计数细胞。
静脉内皮细胞传代培养：原代细胞在接种7~10 d 后可生长至融合，倒置显微镜下计数，细胞密度达(5.85±2.37)×104 cm-2，即行传代。向培养皿内加入0.25%胰蛋白酶液。倒置显微镜下观察，发现约2/3的细胞圆缩、细胞间隙增大但未漂浮，加入完全培养液中止消化，同时用细胞刮刀顺序刮取培养皿底部制成细胞悬液。
用1 mL 注射器接4.5号针头吸打细胞悬液均匀分散细胞团。取样50 μL 行结晶紫法计数后，将细胞悬液加入直径为 100 mm 的培养皿中，再向培养皿中加入M199完全培养液后混匀，传代比例为1∶8，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内静置培养，每周换液2次，每次半量换液。一般在5~7 d 后再次传代，传代比例为1∶4。倒置显微镜下观察细胞生长情况，并采用微格法每日计数培养的细胞总数。
静脉内皮细胞的冻存和复苏：待上述传代细胞生长达到(7.12±2.06)×104 cm-2 时，用上述方法消化获取细胞并置液氮中保存。具体方法如下：用新鲜配制的细胞冻存液(70%M199＋20%胎牛血清＋10%二甲基亚砜)重悬上述细胞制成(1~2)×109 L-1 的细胞悬液，每1.5 mL 分装入冻存管中，直接放入-70 ℃ 冰箱，隔夜取出冻存管直接置液氮中冻存。复苏时，从液氮内取出冻存管，立即投入37 ℃ 水浴内解冻，吸出细胞悬液，室温下离心(100 g，10 min)，后用M199完全培养液重悬制成细胞悬液。同上述方法计数活细胞数和细胞总数。以1×105 cm-2 接种密度将上述细胞悬液接种于直径10 cm 培养皿，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内静置培养。
微格法计数[1]测定静脉内皮细胞生长曲线：在倒置显微镜目镜上安装微格，用显微测量尺测定10倍、20倍和40倍物镜视野下微格的长与宽，求出相应面积，细胞密度小时，用低倍物镜，细胞密度大时，用高倍物镜。从细胞原代和传代培养接种之日起，每日同一时间点计数1次，每次随机计数10个视野的细胞数，按下列等式换算成每cm2的细胞数；ECs/cm2=1/10∑/AV；ECs：内皮细胞数；∑：10个视野细胞总数；AV：选定的物镜视野下微格的面积(cm2)。再由以下等式计算出细胞倍增时间(Population doubling time，PDT)以了解细胞增殖速率；PDT=24/细胞倍增数(Population doubling number，PDN)，PDN=[log∑(n)－log∑(n－1)]/log2；其中，∑(n)为当前细胞总数，∑(n－1)为24 h 前细胞总数，分别由当前和24 h 前细胞密度乘以培养皿面积获得。以逐日细胞数对细胞培养时间在计算机上采取Microsoft Office Excel 2003软件作出细胞生长曲线。
犬静脉内皮细胞的鉴定：用鼠抗人Ⅷ因子相关抗原抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG对原代和传代细胞进行免疫组织化学检测，荧光显微镜观察。透射电镜观察内皮细胞Weible-Palade小体。以PBS代替一抗作为阴性对照片。
犬静脉内皮细胞的功能检测：用放射免疫法和酶联免疫法分别检测原代及传代(第1，2，5代)内皮细胞单层接触抑制形成后，条件培养液中6-酮-前列腺素F1α和Ⅷ因子相关抗原因子含量，检测方法按试剂盒中说明书进行。同样方法检测成纤维细胞培养上清液和M199完全培养液中两种物质的量，分别作为阴性对照和空白对照。
主要观察指标：倒置显微镜观察细胞生长情况，透射电镜和细胞免疫化学进行细胞鉴定，检测原代和传代细胞的条件培养液中6-酮-前列腺素F1α和Ⅷ因子相关抗原的含量。
设计、实施、评估者：实验设计与评估为第二、三作者，干预实施为第一、四、五、六作者。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0统计软件对多组间比较进行One-Way ANOVA分析，组间比较进行LSD检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 血管腔表面积、内皮细胞获取率、细胞存活率和细胞纯度结果

实验中原位获取实验犬前肢隐静脉6条：
术中测量血管的长度(4.32±0.5) cm和直径(0.21±0.03) cm。
计算其表面积(2.80±0.22) cm2。
获取内皮细胞总数(141.01±13.64)×103个细胞。
内皮细胞获取率(50.36±1.70)×103 cm-2。
细胞存活率为(98.39±0.01)%，细胞纯度为(98.73±0.01)%。

经胶原酶消化获得的内皮细胞：
个体稍小，为方圆形或长梭形，数目不等的细胞团聚集在一起，保持体内的形态和关系，见图1a。

原代细胞：
多在4~12 h 贴壁。
培养24 h 后，细胞团的外围细胞逐渐伸展，并向外围移形，但细胞团中央的细胞转变较慢。
随着时间推移，内皮细胞逐渐变为短梭形、方形或多角形，少见细胞内颗粒，见图1b。
原代细胞生长较缓慢，由于分布不均，很难生长达到80%以上的细胞融合。

原代细胞在接种7~10 d 后：
可生长至部分融合，细胞密度达(5.85±2.37)×104 cm-2，即以 1∶8的比例传第1代。

传代内皮细胞：
个体较小，呈现短梭形、方形或多角形。贴壁时间较原代细胞缩短，一般为30 min~4 h，细胞分裂、生长速度明显加快，一般5~7 d 就可达80%以上细胞融合。
再以1∶4的比例传第2代，经过3~5 d 的培养就可达80%以上细胞融合。
从原代细胞的培养到第2代细胞收获共经历(18.6±2.55)d，最后收获细胞总数达(8.48±0.39)×106个，细胞数增长了(60.59±6.15)倍。细胞密集时，细胞间接触紧密，但不形成重叠生长，镜下表现为“铺路石”样排列，见图2。多次传代后，偶见细胞伸出大量伪足并相互融合，表现为巨细胞形态，见图3，4。

冻存内皮细胞：
解冻、复苏培养情况基本类似传代培养，冻存3个月以内的内皮细胞复苏后，存活率达90%以上。

原代细胞：
接种后三四天内处于静止生长期，细胞增殖缓慢。
第5~10天细胞生长迅速，进入对数生长期，此时，细胞增殖迅速，PDT为24~31 h，10 d 后细胞单层接触抑制逐渐形成。
第1代细胞：
接种后第一二天处于静止生长期，细胞黏附和伸展，增殖缓慢，第3~7天处于对数生长期，细胞增殖迅速，PDT为18~24 h，7 d 后细胞单层形成，生长速度明显减慢。
采用微格法对实验犬原代、第1代和第2代静脉内皮细胞逐日计数，并以逐日细胞数对细胞培养时间在计算机上采取Microsoft Office Excel 2003软件绘制细胞生长曲线，见图5。

培养的内皮细胞：
经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测，荧光显微镜下观察99%以上原代和传代细胞的细胞核周围呈现FITC绿色荧光，见图6a；阴性对照片未见荧光表达，见图6b。
体外培养的内皮细胞经抗Ⅷ因子抗体免疫组织化学染色、苏木精衬染后，光镜下观察胞核为蓝色，胞浆内充满棕色颗粒样物质，见图7a。
阴性对照片胞浆内未见棕色颗粒样沉积，见图7b。证实培养的细胞来源是内皮细胞来源。

培养的血管内皮细胞：
一般呈不规则的扁平形，多数细胞间出现紧密连接结构。
胞核呈卵圆形或肾形，位于中央，染色质细密，远离胞核处的胞浆内有少量粗面内质网、管泡状滑面内质网，偶尔见到体积小而嵴少的线粒体或簇状核糖体。
核周的胞浆较为丰富，含有高尔基复合体、中心体和多泡体等。
在胞浆内可见散在、高电子密度的棒状小体--Weibel-Palade小体，见图8，是内皮细胞特有的超微结构。

原代、第1代、第2代(用于构建组织工程动脉)和第5代内皮细胞培养液：
均含有6-酮-前列腺素F1α和Ⅷ因子相关抗原，且随培养代数的增加含量有所下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)。
较阴性对照组和空白对照组培养液中含量明显增高(P < 0.01)。
提示体外培养扩增的内皮细胞可分泌前列环素和Ⅷ因子相关抗原因子，且随着培养代数的增加这种分泌功能有下降趋势，但在5
代之内无明显差异，见表1，2。

自Jaffe等[2]首先报道了脐带静脉内皮细胞培养方法，以后在此基础上内皮细胞的培养方法得到了不断完善和改进，多种因素可对内皮细胞的体外培养产生影响[3-8]。根据笔者在犬静脉内皮细胞培养过程中积累的一点经验，认为以下几方面较为重要。
3.1 静脉内皮细胞原位获取法的应用本实验采取原位插管犬前肢浅静脉，冲洗后立即灌注胶原酶来消化内皮细胞，较其他方法如离体消化酶消化法[9-11]有如下明显的优势：①操作简便，明显缩短静脉血管离体至灌注胶原酶开始消化的时间。②避免了灌注胶原酶前对血管的任何操作，因为这些操作可能使得血管内皮细胞过早机械性脱落，使其下方的血管平滑肌细胞在灌注胶原酶后消化下来，从而造成培养的内皮细胞纯度降低。③避免血管离体后的痉挛所造成的内皮细胞脱落和消化酶灌注的困难，提高消化效率，降低失败率，因为实验犬浅静脉往往较细，管壁较薄易破损。因此，实验中获取的内皮细胞存活率高达(98.39±0.01)%，细胞纯度达(98.73±0.01)%。
3.2 最佳的培养体系也会对内皮细胞生长有直接的影响培养液pH在6.8~7.2时对细胞生长有利，内皮细胞对酸性环境的耐受要好于碱性，即使是已贴壁的在碱性环境中也易脱壁死亡。血清的性质对内皮细胞的生长也有重要影响[10-11]，在内皮细胞体外培养时，要求胎牛血清的浓度一般是10%~15%，小牛血清浓度一般是20%才能维持内皮细胞生长。体外培养血管内皮细胞时一般需要加入最适浓度的内皮细胞生长因子，如血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子以加速生长并多次传代，否则细胞生长缓慢，仅传数代后就死亡[12]。
3.3 消化酶的影响消化酶的浓度和消化时间对细胞的获取和存活也至关重要。选择胰蛋白酶或胶原酶消化法来获取血管内皮细胞是一种常用的经典方法[9，11，13]。胰蛋白酶相对于胶原酶价格便宜，但它与胶原酶一样常因产地、批号的不同导致酶的最佳活性及作用时间不易掌握，浓度过低则达不到消化的目的，过高则可能破坏细胞结构，甚至造成细胞死亡。原代培养细胞对常规应用的胰蛋白酶消化容易产生细胞膜损伤，用后所获得细胞皱缩，难以贴壁，即使贴壁成功的细胞，以后生长也较差，绝大部分细胞在原代培养时就死亡，而且消化时间不易掌握。本实验采用对细胞膜作用相对柔和的0.1%胶原酶溶液，为保存较正常的内皮细胞基底面以促进细胞的贴壁，反复摸索胶原酶消化时间及细胞分离条件，不破坏内皮细胞成簇团聚的状态，酶消化时间严格控制在37 ℃ 消化15 min，并在收集消化液时轻柔血管中段以促使内皮细胞脱壁，这种方法使得内皮细胞获取率高达(50.36±1.70)×103 cm-2，细胞纯度达(98.73±0.01)%，而且细胞获取量稳定，细胞存活率高。
3.4 原代内皮细胞的获取率及接种率的影响潘玉先等[14]研究发现原代内皮细胞接种率低于(9.92±3.34)×103 cm-2 时细胞则难以扩展，细胞将增大，胞核增多，胞浆内出现黑色颗粒直至细胞自溶，本实验中也发现类似的结果。因此，为了获取较多的内皮细胞，所取静脉必须有足够的长度和直径。
3.5 微格法细胞计数的应用和准确把握传代时间及传代比例微格计数法是根据统计学原理，随机计数10个视野里的细胞数，然后来推断总体细胞数，直接每日对所培养细胞进行计数，较传统的结晶紫计数法更方便快捷，根据结果绘制的生长曲线与每日消化细胞计数绘制的曲线相符，均反应了内皮细胞生长情况。并由结果计算出不同细胞密度时的PDT，较准确把握细胞传代时间和传代比例。犬原代内皮细胞一般不可能象传代细胞一样达到80%以上的融合，一般培养7~10 d 就可达大部分融合，这时就需要及时传代，否则细胞相互紧密排列，产生接触抑制，影响细胞生长。本实验采取原代按1∶8的比例传代，以后按1∶4的比例传代，这样培养的细胞不仅能正常存活，而且在相对较短的时间内可获得足够量且功能良好的细胞。但是如果传代比例太高，传代后每个培养皿的细胞量过少，便会出现细胞变形、生长缓慢最终死亡而导致培养失败，这在本实验中得到了证实。然而何红兵等[15]报道成功将成人静脉内皮细胞在体外以1∶27的比例进行单次传代培养，结果细胞生长良好，在(15.0±1.4) d 使细胞数量扩增了(333.0±40.3)倍。
本实验所获取的细胞当发生大部分融合后，倒置显微镜下可观察到明显的“铺路石”样排列(见图3)，同文献中报道相吻合[9，11]。W-P小体仅存在于内皮细胞中，为内皮细胞的特异性表征[11]，但由于其出现的概率小于30%，故不能作为鉴定内皮细胞的必须依据，但是在本实验中观察到了W-P小体，而且还发现多数细胞间存在紧密连接，这是可能出现的混杂细胞(如平滑肌细胞和成纤维细胞)所没有的形态学特征。Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞特有的抗原，目前，除猪体外培养的内皮细胞未检测到Ⅷ因子相关抗原外，多数哺乳动物内皮细胞均可检测到Ⅷ因子相关抗原[9]，本实验免疫组织化学检测结果证实培养的原代及传代细胞为Ⅷ因子相关抗原染色阳性细胞(见图7，8)。以上3方面的检测可证实本实验所培养的细胞是内皮细胞来源。
前列环素作为舒血管物质之一，是至今所知最强的抗血小板聚集和释放的抑制因子，它也能增强纤维活化素的功能，抑制血管平滑肌细胞的增殖，但是其性质极不稳定，约3.5~30.0 min 就可转变为6-酮-前列腺素F1α，该产物性质相对稳定。本实验通过检测内皮细胞的基数细胞分泌量发现，实验犬静脉内皮细胞能同时合成和分泌Ⅷ因子相关抗原和前列腺素F1α。原代、第1代、第2代和第5代内皮细胞分泌Ⅷ因子相关抗原和前列腺素F1α的量之间无明显差异。说明静脉内皮细胞经体外培养5代以内，仍保持良好的功能状态。
本实验采用原位插管、0.1%胶原酶灌注消化法获取犬浅静脉内皮细胞，并经过(18.6±2.55) d 的体外扩增培养，最后收获细胞总数达(8.48±0.39)×106，细胞数增长了(60.59±6.15)倍；细胞纯度达(98.73±0.01) %；经形态学、第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色法和透射电镜检测对获得细胞进行鉴定证实为内皮细胞来源，而且细胞在培养5代以内分泌的前列环素和Ⅷ因子相关抗原无明显差异。这说明本实验所用方法可靠、成熟，有效提高了血管内皮细胞培养成功率，较其他方法如离体物理消化法和离体化学消化法有无可比拟的优点：①操作简便。②减少污染机会。③提高了细胞的获取率。可以为下一步小口径组织工程动脉的研究提供足够量、功能良好的血管内皮细胞来源。

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