桃核承气改良方对兔血管内膜剥脱术后内皮素和一氧化氮及一氧化氮合酶的影响*★

时广容，宫丽鸿，徐琳，张雨

课题背景：课题受辽宁省教委资助（05L246）。项目名称：桃核乘气改良方对家兔血管球囊损伤术后血浆脑利钠肽和信号转导及转录激活因子3影响的实验研究。

应用要点：实验结果提示，桃核乘气改良方能有效地降低冠心病介入治疗技术术后兔血中内皮素的含量，升高一氧化氮含量，对内皮素、一氧化氮分泌具有调整治疗作用，促进两者之间的平衡协调；抑制血管内皮增生，促进损伤内膜修复。

同行评价：实验通过建立动脉粥样硬化模型，对比分析各组内皮素和一氧化氮含量差异，为中药桃核乘气改良方促进血管内皮细胞正常生长增生提供实验依据。

时广容★，1981年生，女，辽宁省丹东市人，辽宁中医药大学在读硕士，主要从事冠心病的临床与实验研究。
Shiguangrong
0701@163.com

通讯作者：宫丽鸿，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，辽宁中医药大学，辽宁省沈阳市 110032
Linda1795@sina.
com.cn

摘要
背景：大量的研究结果已证实，内皮细胞如能够早期覆盖受损的血管内膜层，则可避免血管内再狭窄的发生。
目的：通过与西药作用对比，观察中药桃核承气改良方对兔血管损伤后内皮细胞生长及功能的影响。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-04/11在辽宁中医药大学和中国医科大学完成。
材料：健康新西兰大耳白兔40只，体质量2.0~2.5 kg，高酯饲料喂养4周行腹主动脉内膜剥脱造模，制备动脉粥样硬化模型。桃核承气改良方为辽宁中医药大学附属第一医院制剂产品；舒降之为杭州默沙东制药有限公司产品；阿司匹林为拜尔药业集团有限公司产品。
方法：40只兔随机数字表法分为4组。造模后模型组、中药组、西药组正常饲料喂养，中药组予桃核承气改良方13.5 mL/kg 灌胃4周，西药组予舒降之、阿司匹林混合液13.5 mL/kg 灌胃4周，模型组、空白组予生理盐水13.5 mL/kg 灌胃4周。
主要观察指标：①造模后1，28 d 采用硝酸还原法法和比色法测定血浆内皮素1、血清一氧化氮含量。②免疫组织化学法测定血管中内皮素1、内皮型一氧化氮合酶蛋白表达。
结果：32只新西兰大耳白兔进入结果分析，模型组(n=8)、中药组(n=10)、西药组(n=8)和空白组(n=6)。①与空白组相比，其他3组造模后1 d 血浆内皮素1升高，血清一氧化氮含量下降（P < 0.05）。造模后28 d 兔中药组、西药组血浆内皮素1较模型组明显降低，血清一氧化氮明显升高（P < 0.05）。②血管中内皮素1表达模型组明显高于其他3组(P < 0.05)；中药组、西药组较模型组显著减弱(P < 0.05)。模型组内皮型一氧化氮合酶表达明显低于其他3组(P < 0.05)；中药组、西药组较模型组显著增强（P < 0.05)。
结论：桃核承气改良方能够促进内皮素与一氧化氮之间的平衡协调，有利于血管内皮细胞的修复。
关键词：桃核承气改良方；血管内膜剥脱术；内皮素1；一氧化氮；内皮型一氧化氮合酶

时广容，宫丽鸿，徐琳，张雨. 桃核承气改良方对兔血管内膜剥脱术后内皮素和一氧化氮及一氧化氮合酶的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3837-3840 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3837(ps).pdf]

Effects of improved prescription of Taoren Chengqi decoction on endothelin, nitric oxide and nitricoxide synthase after balloon angioplasty

Abstract

BACKGROUND:Plenty of studies have demonstrated that early growth of endothelial cells to injured tunica intima can prevent intravascular restenosis.
OJECTIVE: To investigate the effects of improved prescription of Taoren Chengqi decoction (Peach Kernel decoction for strengthening qi) on the growth and activation of endothelial cells in rabbits after balloon angioplasty.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized controlled animal trial was performed at the Liaoning University of Traditional Chinese Medicine and China Medical University from April to November 2007.
MATERIALS: Forty healthy New Zealand White Rabbits weighing 2.0-2.5 kg were fed with high fat diet for 4 weeks, and created models of artherosclerosis by stripping abdominal aortic tunica intima. The improved prescription of Taoren Chengqi decoction was product of the First Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine; Zocor (simvastatin) is product of Hangzhou Moshadong Pharmaceutical Co., Ltd., Zhejiang Province; aspirin was product of Bayer.
METHODS: Forty rabbits were randomly divided into model group (n=11), Chinese medicine group (n=12), western medicine group (n=11), and blank group (n=6). After modeling, the model group, Chinese medicine group, western medicine group were fed with normal diet. Additionally, the Chinese medicine group was intragastrically infused improved prescription of Taoren Chengqi decoction (13.5 mL/kg) for 4 weeks; the western medicine group was infused with simvastatin and aspirin mixture (13.5 mL/kg) for 4 weeks; the model group and blank group were infused with normal saline (13.5 mL/kg) for 4 weeks.
MAIN OUTCOME MEASURES: The levels of plasma endothelin-1 (ET-1) and serum nitric oxide (NO) were measured by radio-immunity and colorimetry; vascular ET-1 and nitricoxide synthase (NOS) protein expressions were determined using immunohistochemical method.
RESULTS: Thirty-two rabbits were included in the final analysis. Compared with the blank group, the plasma ET-1 was significantly increased and serum NO was significantly decreased in the other groups one day after modeling (P < 0.05). The plasma ET-1 was significantly decreased but serum NO was significantly increased in the Chinese medicine group and western medicine group 28 days after modeling (P < 0.05). The expression level of vascular ET-1 was significantly higher than the other groups (P < 0.05); the expression level of vascular ET-1 significantly decreased in the Chinese medicine group and western medicine group (P < 0.05). NOS expression in the model group was significantly lower than the other groups (P < 0.05), and NOS significantly increased in the Chinese medicine group and western medicine group (P < 0.05).
CONCLUSION: The improved prescription of Taoren Chengqi decoction can improve endothelin and NO balance in serum and injured vessels, and aid normal growth of vascular endothelial cells.

Shi GR, Gong LH, Xu L, Zhang Y. Effects of improved prescription of Taoren Chengqi decoction on endothelin, nitric oxide and nitricoxide synthase after balloon angioplasty.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3837-3840
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3837(ps).pdf]

冠状动脉由内膜、中膜、外膜组成。内膜是管壁的最内层，由内皮和内皮下层组成。血管内皮细胞具有复杂的酶系统，能合成与分泌多种生物活性物质如内皮素、前列环素以及具有舒张血管作用的内皮细胞舒张因子。血管内皮的完整性决定着内皮细胞的功能。冠状动脉单纯球囊扩张后血管再狭窄发生率30%~50%[1]；冠状动脉金属裸支架置入术（Percutaneous coronary intervention, PCI）后血管再狭窄发生率10%~40%[2]；药物洗脱支架如雷帕霉素洗脱支架置入后发生率仍有8.9%。研究表明，血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等环节互相影响，最终导致血管再狭窄。再狭窄的形成为血管内膜损伤后的过度修复反应，同皮肤创伤后瘢痕形成类似。而始动环节为血管内膜剥脱、内皮细胞损伤。内皮细胞不仅是血液和组织之间物质交换的选择性通透屏障，而且还是多种血管活性质、细胞因子及生长因子的来源和靶器官，在调节血管舒缩状态、凝血和纤溶，防止有害脂蛋白浸润及氧自由基损伤等方面起着重要作用。研究表明，内皮细胞早期得以覆盖于受损的血管内膜，则可避免再狭窄发生。故早期促使内膜的修复，使内皮细胞迅速生长覆盖于损伤的血管内膜为血管再狭窄防治的关键[3]。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2007-04/11在辽宁中医药大学和中国医科大学完成。
材料：健康新西兰大耳白兔40只，由辽宁中医药大学动物实验中心提供(合格证号：辽实动质字[2000]028号)，清洁级，兔龄4个月，体质量2.0~2.5 kg，雌雄不拘。家兔普通饲料、家兔高脂饲料(基础饲料79%、15%蛋黄粉、猪油5%、胆固醇1%)均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。桃核承气改良方：大黄30 g，芒硝15 g，甘草15 g，肉桂15 g，桃仁15 g，水蛭25 g，金银花20 g，由辽宁省中医院提供。药物用水浸泡半小时，先武火再文火煎1 h，倒出药汁，共煎3次，将药汁合并，纱布过滤后100 ℃ 水浴浓缩至100 mL，4 ℃ 冰箱保存。

干预分组：40只白兔随机数字表法将兔分为模型组(n=11)、中药组(n=12)、西药组(n=11)和空白组(n=6)。除空白组外其他3组高酯饲料喂养4周后行腹主动脉内膜剥脱术造模，造模后3组正常饲料喂养，中药组、西药组、空白组分别予桃核承气改良方、舒降之和阿司匹林混合液、生理盐水13.5 mL/kg 灌胃4周。
模型制备：模型组、中药组、西药组高酯饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型[4]，然后行腹主动脉内膜剥脱术造模：250 g/L 乌拉坦4 mL/kg 腹腔麻醉，右侧腹股沟部进行脱毛消毒后利多卡因少量局麻，切皮拨肉分离股动脉，经导丝导入直径1.5~2.0 mm 球囊导管至肾动脉下方，盐水充盈球囊（压力为4~6 kPa），缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体，重复上述过程3次，达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管，结扎股动脉，缝合，术后3 d 肌注青霉素80万U/(d·只)，预防感染。
实验取材：腹主动脉内膜剥脱术后4周麻醉并处死兔，切开腹壁，将肠管翻至一侧，见腹主动脉与下腔静脉并行，分离腹主动脉，截取2 cm长腹主动脉生理盐水冲洗后放于体积分数为0.1的中性甲醛溶液中-20 ℃ 贮存。术后1，28 d 耳缘静脉采血，检测ET-1、NO的含量。
观测指标：血浆ET-1的测定：取2 mL 血置预冷的含10 g/L EDTA二钠30 μL 和40 μL 抑肽酶的试管中，4 ℃ 3 000 r/min 离心10 min，取血浆置-30 ℃ 冰箱中待测ET-1。
血清NO的测定：抽血2 mL 1 500 r/min 离心10 min，分离血清，-30 ℃ 冰箱冻存。采用比色法，在酶标仪570 nm 测定样品吸光度（A）值，以亚硝酸钠为标准品，按标准曲线，可以间接测定一氧化氮浓度。
损伤血管中ET-1、eNOS分布测定：免疫组织化学法将标本经乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋；5 μm 连续切片；体积分数为0.03的H2O2室温孵育5~10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min×2；抗原修复；50~100 g/L 正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清勿洗。滴加一抗，37 ℃孵育1.0~2.0 h；PBS冲洗，5 min× 3次；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10~ 30 min；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育10~30 min；PBS冲洗，5 min×3次；DAB显色3~15 min；自来水冲洗，复染，脱水，透明，封固。PBS代替一抗作为阴性对照。
阳性判断标准：细胞浆呈棕黄色为阳性。经Smart View 2001生物电泳图像分析软件进行处理、分析测定ET-1、eNOS在内皮和平滑肌细胞中的阳性表达。
主要观察指标：①血浆ET-1、血清NO水平。②血管中ET-1、eNOS蛋白表达。
设计、实施、评估者：实验设计为通讯作者，干预实施及评估为第一作者。经过正规培训，采用盲法评估。
统计学分析：第一作者采用SPSS 11.5软件统计，均数间经方差齐性检验后以_x±s表示，以单因素方差分析统计结果；相关分析采用直线回归分析法。图像经Smart View 2001生物电泳图像分析软件进行处理、分析。

2.1 实验动物数量分析纳入健康新西兰大耳白兔40只，32只进入结果分析。
2.2 桃核承气改良方对家兔血浆ET-1及血清NO含量的影响术后1 d 模型组和中、西药组统称造模组，见表1。

2.3 桃核承气改良方对家兔损伤血管中内皮素1及内皮型一氧化氮合酶含量的影响

免疫组织化学染色图像分析结果显示：
阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆，动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆。
ET-1抗原表达：
模型组明显高于其他3组(P < 0.05)，中、西药组较模型组显著减弱(P < 0.05)，中、西药组抗原表达差异无显著性意义（P > 0.05）。
内皮细胞生长状态：
模型组内皮不光滑、有增生，中药组、西药组内皮连续、增生减低，空白组内皮光滑、未见增生，见图1，说明桃核承气改良方能抑制ET-1抗原阳性表达。
eNOS抗原表达：
模型组明显低于其他3组(P < 0.05)，中药组、西药组较模型组显著增强（P < 0.05），中药组、西药组之间相比，差异无显著性意义 (P > 0.05)。模型组血管内皮不光滑，有增生和不连续。中药组、西药组血管内皮较连续，增生减低。空白组血管内皮光滑，未见增生，见图2，说明桃核承气改良方能促进eNOS抗原阳性表达。

2.4 ET-1与NO含量的相关性分析术后28 d ET-1与NO含量的相关分析示两者呈负相关 (r =-0.684，P < 0.05)。

ET是1988年由日本学者Yanagisawa等从猪的主动脉内皮细胞中分离和纯化的一种21个氨基酸组成的、作用强烈的缩血管多肽[5]；主要由血管内皮细胞产生和分泌[6]，有强大的收缩血管、促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和促进细胞外基质积聚、加速生长因子、黏附分子等合成与释放，及其调节其他基因表达等多种生物学作用[7]，是目前所知的最强血管收缩因子。在内皮素的4种异构肽中，以ET-1生物活性最强[8]。ET-1由各种细胞合成，包括内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞，在心血管系统的自分泌/旁分泌方式中扮演角色，通过有成对的球蛋白受体信号细胞调节局部血管紧张度。ET-1通过不同的受体发挥不同的作用，根据受体的不同分成两种亚型即ETA、ETB。两种蛋白都是成对的跨膜球蛋白，根据不同的区域有不同的分子组成上的、药理上的特性和功能[9-10]。ETB受体主要分布在内皮细胞起舒张作用的ETB1受体和分布在平滑肌细胞起收缩作用的ETB2受体[11]。
NO是由完整血管内皮细胞内NOS催化L-精氨酸而合成、释放的内皮依赖性舒张因子。内皮NO调整血管舒张；阻止血小板聚集和平滑肌增生；通过增强超氧化物歧化酶的表达有抗氧化的作用；能阻止脂链反应，在对抗动脉粥样硬化方面作为内源性保护因素扮演了重要角色[12-13]。NO是体内重要的生理递质和细胞间、细胞内的化学信使，它参与机体生理过程的调节和宿主防御以及免疫反应，同时在炎症反应中也发挥着重要作用[14-15] 。一氧化氮在平滑肌舒张、神经传导、抑制血小板聚集等生理过程中是关键的调节因素。
NO和ET之间的平衡是体循环调节和局部血流灌注的主要决定因素。研究提示，心血管支架置入后血循环中ET浓度明显增高，而NO的基础释放水平和活性减低，本实验结果亦证实了这一点NO与ET间平衡的破坏，是动脉内皮受损的显著特征，PCI术后血管再狭窄的发生、发展过程中起重要作用。同时有观察表明NOS的基因多态性以及ET活性均与NO的含量有关[16-17]。
因PCI系为外源性创伤，导致血脉受损，瘀血内停，毒邪壅于局部，与外科的创伤过程类似，并根据病变局部的感染因素和炎症反应，提出PCI术后再狭窄的中医发病机制不单纯是痰瘀和虚，局部特点应为瘀毒互结，兼以正气亏虚。由于新旧病因的综合作用，再次心脉闭阻的可能增加，这可能是RS形成的另一主要机制。本实验运用伤寒方《桃核承气汤》为基础的改良方中大黄、芒硝为软坚散结要药防治毒邪壅于局部、防止增生、预防再狭窄共为君药；桃仁为活血祛瘀之药，水蛭为破血逐瘀之药，金银花为清热解毒之药共为臣药；肉桂补元阳、暖脾胃、除积冷、通血脉为佐药；炙甘草入心经，能补益气血以鼓动血脉，又有调和诸药之功效为使药。该方的组成特点是具有活血化瘀，通下瘀毒兼扶正气。
本实结果提示桃核承气改良方能有效地降低PCI术后兔血中ET的含量，升高NO含量，抑制血管内皮增生，促进损伤内膜修复。显示桃核承气改良方对PCI术后兔内皮细胞的ET、NO分泌具有调整治疗作用，促进ET、NO之间的平衡协调，从而防止损伤内皮细胞增生预防PCI术后再狭窄。

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