人脐静脉内皮细胞损伤过程中核转录因子κB及单核细胞趋化蛋白1mRNA的变化★

刘镘利1，王宗仁1，张筠1，雷战军2

课题背景：课题受辽宁省教委资助（05L246）。项目名称：桃核乘气改良方对家兔血管球囊损伤术后血浆脑利钠肽和信号转导及转录激活因子3影响的实验研究。

应用要点：实验结果提示，桃核乘气改良方能有效地降低冠心病介入治疗技术术后兔血中内皮素的含量，升高一氧化氮含量，对内皮素、一氧化氮分泌具有调整治疗作用，促进两者之间的平衡协调；抑制血管内皮增生，促进损伤内膜修复。

同行评价：实验通过建立动脉粥样硬化模型，对比分析各组内皮素和一氧化氮含量差异，为中药桃核乘气改良方促进血管内皮细胞正常生长增生提供实验依据。

1解放军第四军医大学西京医院中医科，陕西省西安市 710032；2解放军第四军医大学唐都医院烧伤整形科，陕西省西安市 710038

刘镘利★，女，1982年生，陕西省西安市人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，主要从事心血管病的研究
manliyan@fmmu.
edu.cn

通讯作者：王宗仁，博士生导师，教授，主任医师，解放军第四军医大学西京医院中医科，陕西省西安市 710032
ZongrenWang@ fmmu.edu.cn

摘要
背景：既往实验表明，炎性因子与内皮细胞的功能有密切的关系，观察保护和损伤因素对体外培养人血管内皮细胞炎性因子作用的报道较少。
目的：实验拟观察姜黄素和肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞分泌核因子κB以及单核细胞趋化蛋白1 mRNA的影响。
设计、时间及地点：细胞观察实验，于2006-12/2007-08在解放军第四军医大学组织工程实验室完成。
材料：健康人脐带由解放军第四军医大学唐都医院提供。内皮细胞培养采用M199完全培养基。
方法：实验分为3组，正常对照组为无血清M199培养基；肿瘤坏死因子α组：在正常细胞培养液中加入浓度为10 μg/L 的肿瘤坏死因子α诱导损伤1.5 h；姜黄素组：先在培养液中加入10 μg/L 的肿瘤坏死因子α30 min 诱导损伤，再分别加入终浓度为6.25，12.5，25，50，100 mg/L 的姜黄素孵育1 h。
主要观察指标：①四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度姜黄素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。②免疫细胞化学染色法观察胞核内核转录因子κB的表达。③反转录-聚合酶链反应检测单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达。
结果：姜黄素可以提高肿瘤坏死因子α诱导损伤的人脐静脉内皮细胞活性（P < 0.01），并呈一定剂量依赖性。肿瘤坏死因子α可刺激核因子κBp65表达的强度，姜黄素可以减少核因子κBp65的表达。与正常对照组相比，肿瘤坏死因子α作用30 min 后，单核细胞趋化蛋白1 mRNA相对表达量明显增高（P < 0.01）；加入不同浓度的姜黄素作用1 h 后，单核细胞趋化蛋白1 mRNA相对表达量明显减低（P < 0.05，P < 0.01）。
结论：姜黄素对损伤的内皮细胞具有保护作用，其作用途径可能通过抑制核转录因子κB活性，并下调单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达，从而阻滞了单核细胞的聚集。
关键词：核转录因子κB；姜黄素；人脐静脉内皮细胞；肿瘤坏死因子α；单核细胞趋化蛋白1

刘镘利，王宗仁，张筠，雷战军. 人脐静脉内皮细胞损伤过程中核转录因子κB及单核细胞趋化蛋白1 mRNA的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3841-3844 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3841(ps).pdf]

Changes in nuclear factor kappa B and monocyte chemotactic protein 1 mRNA during the process of human umbilical vein endothelial cells injury

Abstract

BACKGROUND:Inflammatory factor is closely associated with the function of endothelial cells. Studies on effects of protective and injured factors on inflammatory factors of in vitro cultured human vascular endothelial cells are few.
OBJECTIVE: In this study, we observed the influence of curcumine and tumor necrosis factor (TNF-α) on nuclear factor-κB (NF-κB) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in human umbilical vein endothelial cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: A cell observational experiment was performed at the Laboratory of Tissue Engineering of Fourth Military Medical University of Chinese PLA from December 2006 to August 2007.
MATERIALS: Healthy human umbilical vein was provided by Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University of Chinese PLA. Endothelial cells were inoculated in M199 complete medium.
METHODS: The experiment included 3 groups. Endothelial cells were cultured in serum-free M199 medium in the normal control group. 10 μg/L TNF-α was added in the normal culture medium for 1.5 hours in the TNF-α group. Endothelial cells were inoculated in medium supplemented with 10 μg/L TNF-α for 30 minutes, and then incubated with different dosages of curcumine (6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg/L) for 1 hour in the curcumine group.
MAIN OUTCOME MEASURES: Different dosages of curcumine effects on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). NF-κB expression was examined by immunocytochemistry. MCP-1 mRNA expression was detected were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
RESULTS: Curcumine could improve the activity of human umbilical vein endothelial cells after injury by TNF-α(P < 0.01), with dose-dependent effects to some extent. TNF-α could stimulate the expression of NF-κBp65. Curcumine could decrease the expression of NF-κBp65. Compared with the normal control group, levels of MCP-1 mRNA significantly increased after TNF-α intervention for 30 minutes (P < 0.01), but reduced after different dosages of curcumine intervention for 1 hour (P < 0.05，P < 0.01).
CONCLUSION: Curcumine displays a protective action on injured endothelial cells. Curcumine prevent the aggregation of mononuclear cells by inhibiting NF-κb activity and depressing MCP-1 mRNA expression.

Liu ML, Wang ZR, Zhang Y, Lei ZJ. Changes in nuclear factor kappa B and monocyte chemotactic protein 1 mRNA during the process of human umbilical vein endothelial cells injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3841-3844(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3841(ps).pdf]

姜黄素是中药姜黄的主要有效成分，目前的研究主要集中在对其抗脂质过氧化作用以及在细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1和P-选择素等炎性因子表达的抑制[1-5]，从而改善血管内皮细胞舒张功能[6-7]，起到有效保护血管内皮细胞的作用。本实验采用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α， TNF-α)体外诱导的人脐静脉内皮细胞，建立细胞损伤模型，观察TNF-α和姜黄素对细胞分泌核转录因子κB及单核细胞趋化蛋白1 (Monooyte chermtach protein-1, MCP-1) mRNA的影响。

设计：以细胞为对象的对照观察实验。
时间及地点：实验于2006-12/2007-08在解放军第四军医大学组织工程实验室完成。
材料：健康人脐带由西京医院产房提供，产妇及家属知情同意。
主要试剂：M199培养基(Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(华美生物工程公司)；姜黄素(Curcumin)、TNF-α、四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)；兔抗人核因子κBp65单抗、兔抗人单核细胞趋化蛋白1单抗、SP试剂盒、DAB显色试剂盒、Ⅷ因子多抗(北京中山试剂公司)；Trizol (Gibco BRL公司)；PCR所用引物由上海生工公司合成。
人脐静脉内皮细胞原代培养：无菌条件下取脐带20~30 cm 长，用PBS冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳颊住一端，另一端注入1 g/LⅠ型胶原酶，37 ℃ 温箱中消化30 min，收集消化液，离心后弃去上清收集细胞，加入含体积分数为0.2胎牛血清的M199培养液悬浮细胞，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合状态再用2.5 g/L 胰蛋白酶和0.4 g/L EDTA混合液进行消化传代，取第3代用于实验。
实验分组：将用于检测的人脐静脉内皮细胞分为正常对照组：为无血清M199培养基；在无血清M199培养液中加入浓度为10 μg/L 的TNF-α与细胞共同温育1.5 h；姜黄素组：先加入浓度为10μg/L 的TNF-α预孵育细胞 30 min，再分别加入终浓度为6.25，12.5，25，50，100 mg/L 的姜黄素，各组均在37 ℃ 条件下温育1 h。用于检测核因子κB表达的细胞盖玻片，分组同上。
四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活力：细胞终止培养后，每孔加入5 g/L 的四甲基偶氮唑盐10 μL，孵育4 h 后吸弃上清，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜，振荡10 min，在酶标仪570 nm 处读取吸光度（A）值。
SP免疫细胞化学染色检测胞核中核因子κB的表达：将各组细胞按以上分组处理后用无水乙醇和丙酮混合液固定。一抗为兔抗人核因子κBp56单克隆抗体，滴度为1∶200，染色步骤按试剂盒说明书进行。染色时用磷酸盐缓冲液代替一抗做阴性对照，用阳性片作为阳性对照。阳性染色判定标准：核因子κBp56阳性物质于胞核内表达，呈棕黄色颗粒状。
反转录-聚合酶连反应检测MCP-1 mRNA的表达：
总RNA提取：按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA。
反转录-聚合酶连反应：取每组总RNA各 2 mg，反转录合成cDNA，取该产物进行PCR循环。94 ℃ 温育2 min，94 ℃ 变性45 s，57 ℃ 复性45 s，72 ℃ 延伸 1 min，共35个循环，末次循环72 ℃ 延伸10 min。单核细胞趋化蛋白1的引物序列为：上游：5’-CTC ATA GCA GCC ACC TTC AT-3’(20 bp)，下游：5’-TCA CAG CTT CTT TGG GAC AC-3’(20 bp)；PCR扩增产物长度为160 bp。β-actin的引物序列为：上游：5’-ggg ACC TgA CTA ACT ACC TC-3’，下游：5’-CAg TgA TCT CCT TCT gCA TC-3’；PCR
扩增产物长度为396 bp。用各组目的基因扩增片段与 β-actin基因扩增片段的灰度值之比代表MCP-1 mRNA的表达。
主要观察指标：①四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞存活数量。②免疫细胞化学染色法观察胞核内核转录因子κB的表达。③反转录-聚合酶链反应检测MCP-1 mRNA的表达。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预实施及评估为第一、三作者，接受过专业训练，未采用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0软件分析系统进行处理，数据以_x±s表示，组间比较用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 人脐静脉细胞的鉴定大部分细胞贴壁良好，由球形逐渐伸展成梭形，单层铺路石状排列，锥虫蓝染色细胞活性在95%以上，经第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定阳性，细胞纯度在90%以上，符合本次实验的要求。
2.2 姜黄素对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞活性影响见表1。

TNF-α组中细胞活力明显低于正常对照组（P < 0.01）；姜黄素组中除6.25 mg/L 组外均高于TNF-α组（P < 0.01），且细胞活力随浓度升高而增高。
2.3 姜黄素对核因子κB表达的影响
核因子κB在各组人脐静脉内皮细胞中的表达
正常对照组
在正常的胞浆中核因子κBp65有一定程度的表达，核内不表达。

TNF-α组
加入TNF-α后，可刺激核因子κBp65表达强度增加，表现为细胞
内棕黄色染色加深，阳性细胞数目增多，且呈现部分核内表达。

姜黄素组
加入姜黄素干预后，可以减少核因子κBp65的表达，低浓度时对TNF-α引起的核因子κB表达升高无明显改善作用，随着浓度增高，阳性细胞数目逐渐减少，核因子κB表达受到明显抑制。
核因子κB在各组人脐静脉内皮细胞中的表达见图1，2。

2.4 姜黄素对MCP-1 mRNA表达的影响 TNF-α组（0.493±0.021）与正常对照组（0.197±0.009）相比,MCP-1表达水平明显升高（P < 0.01）；用姜黄素作用后，其表达较 TNF-α组显著降低（0.349±0.019, 0.342±0.007, 0.298±0.029，0.249±0.01，P < 0.05）。见图3。

血管内皮细胞结构受损和功能改变，导致了黏附因子、趋化因子等多种炎症因子的释放，引发一系列网络调节紊乱。因此，修复受损的血管内皮细胞具有重要意义。TNF-α是一种前炎性细胞因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，它不仅对细胞具有直接毒性作用[8]，而且通过产生趋化因子[9]、诱导内皮细胞黏附分子表达[10]、诱导核转录因子κB活化[11]等途径导致内皮细胞损伤。本实验选用10 μg/L TNF-α诱导损伤30 min，保证了实验的可行性，与某些文献报道的浓度基本吻合。
MCP-1的主要功能是趋化和激活单核/巨噬细胞至炎症部位，参与炎症反应，使与血管内皮细胞黏附的单核细胞易通过血管内皮间隙迁移至内皮下，最终导致动脉粥样硬化性脂质条纹形成，在动脉粥样硬化的形成促进血管再生当中起核心调节作用[12]。核因子κB是一类关键性的核转录因子，参与炎症过程中的多种信号传导途径[13-14]。Brand等[15]证实了人动脉粥样硬化斑块中存在核因子κB激活，表明其在动脉粥样硬化的炎症反应、免疫应答及细胞增生中起重要作用。核因子κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异性结合的核蛋白，参与许多与机体防御反应有关的应答基因的表达调控。细胞处于静息状态时，核因子κBp65亚基与κB抑制蛋白(Inhibitory kappaB，ⅠκB)单体结合的复合物以失活状态存在于胞质中。当机体受到外界因素如TNF-α刺激时ⅠκB发生磷酸化并解离，核因子κB得以激活，移位入细胞核，启动基因转录[16]。TNF-α刺激人脐静脉内皮细胞，通过活化核因子κB促进E-选择素和细胞间黏附分子1的转录[16-17]，在黏附分子介导下，单核细胞与内皮细胞黏附并迁移至内皮下形成瘢块。因此，核因子κB参与动脉粥样硬化形成过程中的多种信号传导途径。MCP-1表达增加也常与核因子κB的活化相关，且MCP-1的基因转录受核因子 κB的调控[17-18]。
姜黄素为天然的酚类抗氧化剂，可以通过抑制细胞间黏附分子1、P-选择素等表达来发挥其抑制脂质过氧化，防止血管内皮损伤及泡沫细胞形成[19-20]的作用。本实验采用原代培养的人脐静脉内皮细胞，更接近于体内细胞的生理特性。实验结果表明，TNF-α可使核转录因子κB和MCP-1表达明显增高；而用姜黄素处理后， TNF-α的损伤作用明显减轻，核因子κB和MCP-1的表达较TNF-α组均明显降低，证实姜黄素具有逆转内皮细胞损伤的功能。其机制可能通过抑制内皮细胞胞浆内核因子κB活化，从而抑制细胞表面MCP-1的表达。姜黄素选择性下调MCP-1的mRNA表达，从而抑制TNF-α诱导的单核细胞对血管内皮细胞黏附的效应，其确切机制尚有待进一步研究。

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