膝骨关节炎模型兔关节液中细胞因子白细胞介素1水平及复方归芪液的干预效应

曲俊才

课题背景：研究表明，白细胞介素1是关节软骨破坏中最重要的一种细胞因子，能促进滑膜细胞的增殖和分化，促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2及胶原酶，后者能导致滑膜炎症反应和软骨基质的崩解，促进关节炎的发生、发展。因此抑制细胞因子特别是白细胞介素1的产生，对关节炎的治疗是有益的。本实验通过对兔膝骨性关节炎模型动物关节液中细胞因子白细胞介素1水平检测，探讨复方归芪液对骨性关节炎的治疗作用，为其临床应用提供可靠的实验依据。

应用要点：实验结果提示复方归芪注射液对兔膝关节炎的防治作用，可能是通过抑制骨性关节炎细胞因子白细胞介素1的分泌而实现的。

相关链接：目前中医对骨关节炎的研究已深入到微循环、骨内压、自由基、细胞因子等分子水平，在骨细胞学水平上也有不少突破，主要集中在中药复方及相应提取物对成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞及成纤维细胞的直接及间接干预上。

曲俊才，男，1973年生，辽宁省大连市人，汉族，1992年中国医科大学毕业，主治医师，主要从事关节创伤的研究。
philipjiajia@hotmail.com

摘要
目的：实验表明，白细胞介素1是关节软骨破坏中最重要的细胞因子。实验拟进一步观察兔膝骨性关节炎模型关节液中白细胞介素水平的变化以及复方归芪注射液的干预作用。
方法：实验于2007-04/09在大连市第二人民医院骨科实验室完成。①实验分组：健康清洁级新西兰大白兔25只，6个月龄，体质量2.14~3.20 kg，随机抽签法分为正常组、模型组、生理盐水组、透明质酸组和中药治疗组。每组5只。②实验方法：采用兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎的病理模型，正常组、模型组正常饲养，其他3组均于术后第8天给药（右下肢关节腔注射），以后每周2次，共10次。生理盐水组：每次注射9 kg/L 生理盐水0.15 mL；透明质酸组：生理盐水稀释成浓度2 kg/L，每次注入0.15 mL；中药治疗组：每次注入生理盐水稀释液1 kg/L 和复方归芪注射液0.15 mL。③实验评估：于造模后取材，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法分别测定各组兔膝关节液中白细胞介素水平。
结果：纳入大白兔25只，均进入结果分析。正常组未检出白细胞介素1，模型组、透明质酸组、中药治疗组白细胞介素1均呈高表达，但模型组与正常组比较差异显著(P < 0.01)。透明质酸组、中药治疗组与模型组比较，白细胞介素1水平均降低(P < 0.01)，而透明质酸组的作用优于中药治疗组(P < 0.05)。
结论：白细胞介素1在骨性关节炎发病过程及复方归芪注射液治疗中起重要作用。
关键词：骨性关节炎/中医药疗法；复方归芪注射液；白细胞介素1

曲俊才. 膝骨关节炎模型兔关节液中细胞因子白细胞介素1水平及复方归芪液的干预效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3845-3848 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3845(ps).pdf]

中图分类号:R684.3
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)20-03845-04

Effects of compound Guiqi injection on interleukin-1 levels in synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis models

Abstract

AIM:Interleukin-1 is a major cytokine in arthrodial cartilage destruction. This study investigated the effects of compound Guiqi injection on changes in interleukin levels in the knee of rabbit osteoarthritis models.
METHODS: Experiments were performed at the Laboratory of Department of Orthopaedics, Second People's Hospital from April to September 2007. Twenty-five healthy clean 6-month New Zealand rabbits of 2.14-3.20 kg were divided into five groups randomly, normal, model, saline, hyaluronic acid and Chinese herb groups with 5 in each group. Genu osteoarthritis models were made by intraarticular injection with caroid. Rabbits were normally fed in the normal and model groups. Administration was performed at day 8 after the surgery in the saline, hyaluronic acid and Chinese herb groups by injection into joint cavity of right lower limbs, twice a week, totally 10 times. 9 kg/L saline (0.15 mL) was injected into rabbits of the saline group. 2 kg/L saline (0.15 mL) was injected into rabbits of the hyaluronic acid group. 1 kg/L saline and compound Guiqi (0.15 mL) were injected into rabbits of the Chinese herb group. Interleukin levels in knee synovial fluid were measured in each group by double antibodies sandwich Enzymelinked Immurosorbent Assay.
RESULTS: Twenty-five rabbits were included in the final analysis. Interleukin-1 levels were not detected in the normal group. Interleukin-1 levels were high in the model, hyaluronic acid and Chinese herb groups There was no significant difference between the model and normal groups (P < 0.01). When comparing hyaluronic acid and Chinese herb groups to the model group, interleukin-1 levels were reduced (P < 0.01). The effect was better in the hyaluronic acid group than in the Chinese herb group (P < 0.05).
CONCLUSION: Interleukin-1 plays an important role in the onset of osteoarthritis and compound Guiqi injection treatment.

Qu JC. Effects of compound Guiqi injection on interleukin-1 levels in synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis models.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3845-3848(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3845(ps).pdf]

骨性关节炎是由多种病因引起的关节退化、关节软骨破坏所致的慢性关节炎，致残率较高。随着社会老龄化，发病率明显上升。西医多采用关节腔药物注射、手术等方法，由于多种原因应用受到一定的限制，中医对骨关节炎的研究已深入到微循环、骨内压、自由基、细胞因子等分子水平，发现白细胞介素1等细胞因子在骨性关节炎发病中起到重要的作用，能引发滑膜炎症和介导关节软骨的破坏，同时还可诱导痛觉过敏。有实验表明，复方归芪注射液对兔膝关节炎关节软骨有明显的保护作用，但未说明其作用机制。本实验检测纯中药制剂复方归芪注射液对兔膝关节炎细胞因子白细胞介素1的含量，探讨其对膝关节骨关节炎炎性细胞因子的影响，为其临床应用提供可靠的实验依据，同时为患者提供一种治疗骨性关节炎安全、有效的中药制剂及中西医结合治疗该病的新途径。

设计：随机对照动物实验。
单位：大连市第二人民医院。
材料：实验于2007-04/09在大连市第二人民医院骨科实验室完成。健康清洁级新西兰大白兔25只，6个月龄，体质量2.14~3.20 kg，由大连医科大学动物实验室提供。药物：复方归芪注射液由黑龙江中医药大学药学院制备，浓度2 kg/L；生理盐水应用同一厂家同一品牌产品的市场购得；透明质酸应用市售产品“阿尔治”。
主要试剂及仪器：白细胞介素1检测试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，标号：865000096；实验仪器酶标仪（型号：Tecamunrise Austria）及其他检测设备由大连市第二人民医院检验科提供并完成。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施及评估为本文作者。经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
模型制备：采用膝关节内注射木瓜蛋白酶方式造模（参照上海中医药研究院骨伤科研究所汪青春等[4]方法）。将兔用戊巴比妥钠(30 mg/kg 静脉注射)麻醉后双后腿膝关节周围剃毛，然后用碘酒、乙醇消毒皮肤，轻弯曲膝关节，经关节正中或两侧进针，将16 g/L 木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5 mL 通过髌上韧带注入兔膝关节腔。隔3天1次，连续注射3次。
干预分组：将大25只白兔随机抽签法分为正常组、模型组、生理盐水组、透明质酸组和中药治疗组。每组5只。正常组、模型组正常饲养，其他3组均于术后第8天给药（右下肢关节腔注射），以后每周2次，共10次。生理盐水组：每次注射9 g/L 生理盐水0.15 mL；透明质酸组：生理盐水稀释成浓度2 g/L，每次注入0.15 mL；中药治疗组：每次注入生理盐水稀释液1 g/L 和复方归芪注射液0.15 mL。
取材及检测：于末次给药后第8天取材。戊巴比妥钠(30 mg/kg 体质量)静脉注射麻醉后用空气栓塞法处死，立即切取各组兔的右侧膝关节（胫腓骨上1/3至股骨下1/3骨段，去除关节周围的肌肉等硬组织，保留完整的关节囊）。切开膝关节囊，用1 mL 生理盐水灌洗关节腔，收集关节液，取少量关节囊、滑膜等组织，离心5 min，取上清液保存待检。用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测白细胞介素1含量。
主要观察指标：各组兔膝关节液中白细胞介素1的表达。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0软件完成统计处理，实验数据以_x±s表示，经F检验后行组间q检验。

2.1 实验动物数量分析纳入大白兔25只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 各组动物关节液中白细胞介素1的含量见表1。

正常组未检出白细胞介素1，模型组、透明质酸组、中药治疗组白细胞介素1均呈高表达，但模型组与正常组比较差异显著(P < 0.01)。白细胞介素1的高表达，说明其是参与骨性关节炎发病进程的重要介质。透明质酸组、中药治疗组与模型组比较，白细胞介素1水平均降低(P < 0.01)，说明透明质酸与复方归芪注射液均能有效抑制骨性关节炎发病病理过程中的炎性细胞因子，而透明质酸组的作用优于中药治疗组(P < 0.05)。

3.1 动物造模的可行性关节内注入木瓜蛋白酶造成骨关节发生退行性改变模型与临床极为相似。国外文献20世纪70年代即有报道，该法快速、简单、成功率高。本实验造模后，结果出现了兔膝关节软骨的破坏，与正常组比较，模型组白细胞介素1的表达增高(P < 0.01)，说明造模是成功的。
3.2 中国传统医学对骨性关节炎的认识骨关节炎又称退行性骨关节炎、增生性骨关节炎，属中国传统医学骨痹范畴，《内经》有：“五劳所伤，久立伤骨，久行伤筋”的记载，“膝乃筋之腑”。“伤之，步履斜行。久立久行或外伤直接损伤筋骨，血瘀气滞，不通而痛”。不论外伤还是劳损，最终都导致局部血瘀气滞而发病。说明血瘀气滞是骨性关节炎的主要病机。
3.3 白细胞介素1与骨性关节炎发病机制的探讨现代医学认为，骨关节炎是一种非特异性疾病，临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限为主要表现，其特征是功能退变，软骨损害，骨关节面周围的新骨形成。其损伤的病因主要为外伤、劳损引起局部缺血，不能进行正常的营养物质交换造成的。关节内力学性质的改变，关节内压力的增高或降低，主要是关节内动静脉血流异常所致，关节制动引起关节囊和肌肉挛缩使关节面压力增加。由此可见，骨性关节炎主要与髓内血液循环改变有关，血液循环系统紊乱可造成骨关节软骨下骨松质的改变。软骨下骨板渐增厚，骨骺部位渐增粗。这与中医病机中的血瘀气滞致病较为相似。
近年来发现，在已知的细胞因子中白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子是参与骨性关节炎发病进程中的重要介质，是炎症反应的重要调节剂，是调节炎症的始动因素。白细胞介素1对关节软骨细胞代谢的干扰作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅸ型胶原蛋白的合成，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成，而使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和合成蛋白多糖，白细胞介素1还通过促进软骨细胞合成与分泌金属蛋白酶提高软骨基质中溶剂蛋白分子酶类的活性而降解关节软骨。白细胞介素1还能强烈抑制关节软骨蛋白聚糖的合成。肿瘤坏死因子即协同白细胞介素1的作用，又激活白细胞介素6基因，诱导白细胞介素6的生成，在骨性关节炎的发生发展中有可能起着决定性作用。关节内局部性高水平白细胞介素1在骨关节炎中的作用或许与其影响软骨细胞增殖软骨损伤反应性，以及增强关节炎反应性和增加由白细胞介素1诱导的金属蛋白酶的分泌有关。实验研究也发现骨性关节炎破坏可用白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子的选择性抗体及抗受抗体，细胞因子受体拮抗蛋白，可溶性或转移性细胞因子受体的分子所修复，说明细胞因子与软骨破坏密切相关。本实验模型组中白细胞介素1始终保持高含量，说明白细胞介素1是骨性关节炎中起主要调控作用的一种炎性介质，对骨性关节炎的发生具有促动作用。同时对骨性关节炎引起的继发病理过程也有影响，白细胞介素1本身可能是一种强有力的致痛物质。
3.4 复方归芪注射液对防治骨性关节炎的作用机制祖国医学认为痹症乃因“气滞血淤，肝肾不足”引起，所以确立了“活血化淤，强筋补肾”的治疗法则。纯中药制剂复方归芪注射液用三七总皂苷(三七提取物)、当归和黄芪提取物、药用辅料、注射用水组合制成复方归芪注射剂，三七总皂苷(三七提取物)主要含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1，当归和黄芪提取物主要含当归多糖、藁本内酯、阿魏酸、黄芪皂苷、黄芪黄酮、黄芪多糖。即在这一法则下的处方，其功能为：补气养血、活血化淤、通脉止痛。当归、川芎活血化瘀，黄芪补气，气行则血行，骨碎补益肾添髓，四药合用，可达活血化瘀、补益肝肾之功用。复方归芪注射液所含成分的水提醇沉液具有抗炎镇痛、改善血循环、清除自由基、改善软骨细胞功能、促进软骨修复、促进蛋白多糖合成等作用。本实验中药治疗组与透明质酸组白细胞介素1的含量差异显著(P < 0.05)，提示复方归芪注射液对免膝关节炎的防治作用，可能是通过抑制骨性关节炎细胞因子白细胞介素1的分泌而实现的，这就为中药制剂的治疗提供了较广阔的应用前景。
复方归芪注射液具有补气养血、活血化淤、通脉止痛的功效，关节腔内注射中药制剂具有直接起效、作用直接、用量小的特点；副作用较少、费用低廉，适用于不能应用激素，不能承担透明质酸费用及不接受手术的患者。白细胞介素1是骨性关节炎中起主要调控作用的一种炎性介质，本身可能是一种强有力的致痛物质，测定其含量对评价骨性关节炎治疗效果有一定的临床意义。本实验观察纯中药制剂复方归芪注射液对兔膝关节炎细胞因子白细胞介素1的影响，评定复方归芪注射液对人类膝骨性关节炎的治疗作用，为临床治疗提供实验依据。

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