课题背景：课题为南通市社会发展计划资助项目（S2005023）。目前对AT1受体拮抗剂的作用研究主要集中于球囊扩张后的血管再狭窄，对于移植静脉重塑干预作用的报道尚不多见。实验通过建立兔颈部自体静脉移植模型，观察AT1受体拮抗剂缬沙坦对自体静脉移植后血管内膜增生的干预作用。

应用要点：实验观察到缬沙坦对兔颈部自体移植静脉再狭窄具有抑制作用，并降低移植静脉中增殖细胞核抗原的表达，结果为临床应用AT1受体拮抗剂防治移植静脉再狭窄提供了依据，对相关患者的初步观察也显示了令人鼓舞的结果。AT1受体拮抗剂用于治疗高血压效果显著、耐受良好，其对抑制移植静脉再狭窄的作用预计会得到进一步的研究肯定。

相关链接：冠状动脉旁路移植术后静脉桥再狭窄是心血管外科研究的热点之一，包括肾素-血管紧张素系统以及多种细胞因子、生长因子参与了再狭窄过程。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统中最重要的活性物质，与AT1受体结合，促进静脉桥中平滑肌细胞增殖、迁移、内膜增生，形成再狭窄病变。

南通大学第二附属医院心胸外科，江苏省南通市 226001

仲崇俊，男，1962年生，江苏省南通市人，1983年南通医学院毕业，主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病外科治疗的研究。
zhongcjnt@sina.com

南通市社会发展计划资助项目(S2005023)*

摘要
目的：内膜增生是移植静脉再狭窄的主要原因，血管紧张素Ⅱ在血管组织增生中发挥着重要作用，缬沙坦作为AT1受体拮抗剂可在受体水平阻断血管紧张素Ⅱ的生物学作用。实验拟验证AT1受体拮抗剂缬沙坦对兔颈部静脉移植术后血管内膜增生的干预作用。
方法：实验于2005-10/2006-10在南通大学动物实验中心完成。①实验分组：雄性新西兰大白兔20只，微生物控制级别Ⅰ级，兔龄16~18周，体质量（2.5±0.5） kg，随机排列表法分为对照组和治疗组，每组10只。②实验方法：所有动物行颈部自体静脉移植手术，对照组予普通饲料饲养；治疗组则予普通饲料+缬沙坦[10 mg/（kg·d）]喂养。③实验评估：饲养4周后观察两组动物治疗前后的血压变化情况；取出静脉移植物行病理形态学检查；采用图像分析系统计算血管腔内膜的厚度、面积及中膜的厚度、面积；免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原的表达。
结果：纳入大白兔20只，均进入结果分析，术后切口无感染，两组移植静脉无闭塞。①对照组和治疗组动物的血压在治疗前后无明显变化(P > 0.05)。②对照组移植物内膜明显增厚，内膜下大量平滑肌细胞增殖，中膜稍有增厚；治疗组内膜增厚较对照组减弱，中膜平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖较对照组明显减轻，中膜增厚不明显。③治疗组新生内膜厚度、面积及增殖细胞核抗原均低于对照组(P < 0.01)。
结论：缬沙坦可以显著抑制兔自体静脉移植后的再狭窄，并抑制移植静脉桥中增殖细胞核抗原的表达。
关键词：AT1受体拮抗剂；自体移植静脉；增殖细胞核抗原

仲崇俊，蒋庚西.兔自体移植静脉内膜增生与缬沙坦的干预效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3859-3862 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3859(ps).pdf]

中图分类号:R622.4
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)20-03859-04

收稿日期：2007-10-20
修回日期：2007-11-21
(07-50-10-5741/WL·A)

Inhibitory effect of valsartan on intimal hyperplasia in rabbit autogenous grafted veins

Abstract

AIM:Intimal hyperplasia (IH) is the main cause of the restenosis of grafted veins. Angiotensin Ⅱ plays an important role in vascular tissue hyperplasis. Valsartan, AT1 receptor antagonist, can inhibit the biological effect of angiotensin Ⅱ. This study investigated the inhibitory effect of valsartan on IH in rabbit autogenous grafted veins.
METHODS: The experiment was performed in Animal Experiment Center of Nantong University from October 2005 to October 2006. Twenty male New Zealand white rabbits of 16-18 weeks old and (2.5±0.5) kg were randomly divided into control group and treatment group (n=10). All rabbits underwent autogenous vein grafting. The control group was fed with common diet, whereas the treatment group was fed with an admixture of valsartan (10 mg/kg·d ) and common diet. Four weeks after operations, the mean arterial pressure (MAP) of the rabbits were monitored before and after operation. The grafted veins were harvested for pathomorphologic examinations; the thickness and area of the intima and media of the veins were calculated with Image Analyzer System; the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in veins were examined with immunohistochemistry.
RESULTS: Twenty rabbits were involved in the result analysis. There was no wound infection in rabbits and none of the vein grafts was occluded. No significant difference was observed between pre- and post-treatment MAP in both groups (P > 0.05). In the control group, the intima of grafted veins were thickened evidently with proliferated vascular smooth muscle cells (VSMCs) and the media thickness were slight. Compared with the control group, the intima was slightly thickened in the treatment group, but there were significant reductions in proliferated VSMCs. Additionally, the media thickness was unobvious in treatment group. Compared with the control group, the thickness and area of neointima and the expression of PCNA in the treatment group were significantly lower than those in the control group (P < 0.01).
CONCLUSION: Valsartan can significantly attenuate IH in rabbit autogenous grafted veins and decrease the expression of PCNA in veins.

Zhong CJ, Jiang GX.Inhibitory effect of valsartan on intimal hyperplasia in rabbit autogenous grafted veins.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3859-3862(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3859(ps).pdf]

0 引言

移植静脉内膜增生导致再狭窄病变，是冠状动脉旁路移植术失败的重要原因，血管紧张素Ⅱ在血管组织增生中发挥着重要作用。缬沙坦作为AT1受体拮抗剂可在受体水平阻断血管紧张素Ⅱ的生物学作用，本实验通过建立兔颈部自体静脉移植模型，观察AT1受体拮抗剂缬沙坦对自体静脉移植术后内膜增生的干预作用，现将结果报告如下。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：南通大学第二附属医院心胸外科。
材料：实验于2005-10/2006-10在南通大学动物实验中心完成。雄性新西兰大白兔20只，微生物控制级别Ⅰ级，兔龄16~18周，体质量(2.5±0.5) kg，由南通大学动物实验中心提供(动物合格证号：2005120012)，普通环境中喂养，自由饮水。缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供，批号：200508X0019。
主要试剂及仪器：青霉素(华北制药有限公司，批号U0504603)；免疫组织化学检查试剂盒购自Neo Markers公司；8/0锦纶单丝线(上海医用缝合线厂)；Philips V24E监护仪、Philips IU22彩色多普勒超声检测仪(荷兰菲利普公司)；Olympus BX50生物显微镜(日本奥林巴斯公司)。
设计、实施、评估者：实验设计及评估为第一作者，干预实施为第二作者。干预实施者经过动物实验从业培训（证书编号：203231），采用盲法评估。
方法：
干预分组：20只大白兔随机排列表法分为对照组和治疗组，每组10只。对照组予自体静脉移植手术，普通饲料饲养；治疗组在对照组自体静脉移植手术基础上予普通饲料+缬沙坦[10 mg/（kg·d）]喂养，均饲养4周。
建立自体静脉移植模型：兔手术前禁食、禁水4 h，建立耳缘静脉通道，予30 g/L 异戊巴比妥按30 mg/kg 行静脉麻醉。仰卧位固定，颈部备皮，颈前正中纵行切口，游离、切取颈外静脉一段30~35 mm，肝素-生理盐水冲洗、浸泡。游离右侧颈总动脉，耳缘静脉内注射 10 g/L 肝素1 mL/kg，使其肝素化。颈总动脉置管，Philips V24E监护仪测定平均动脉压，阻断颈总动脉近、远段，切除相应长度，静脉倒置，采用8-0锦纶单丝线作端-端间断吻合8~10针，两端吻合完成后开放动脉夹排气，确定静脉桥通畅、无出血后，逐层缝合切口。送回单笼喂养，术后3 d 每日耳缘静脉注射10 g/L 肝素1 mL/kg 防治血栓，注射青霉素80万单位预防感染。手术次日及取标本当日用Philips IU22彩色多普勒超声检测仪行血管检查，证实静脉桥通畅。
取材、切片与增殖细胞核抗原检测：术后4周，再予30 g/L 异戊巴比妥静脉麻醉，左侧颈总动脉置管，测定平均动脉压，游离右侧静脉移植物，快速、准确切取所需移植物组织，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，封固，光镜观察。用Olympus BX50生物显微镜和北航医学图像分析系统进行图像分析，计算血管腔内膜的厚度、面积及中膜的厚度、面积。用S-P法进行增殖细胞核抗原免疫组织化学检查，免疫组织化学阳性颗粒为棕黄色或棕褐色颗粒，分布在细胞核中。随机计算5个400倍视野中阳性细胞数（P）及观察细胞总数（A），得出阳性细胞百分率（%）=P/A×100%。
主要观察指标：治疗前后平均动脉压的变化，移植静脉内膜的厚度、面积及中膜的厚度、面积，以及静脉桥中增殖细胞核抗原的表达情况。
统计学分析：由第二作者采用Stata 7.0软件包完成统计处理，所有数据以_x±s表示，组间样本均数比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入大白兔20只，均进入结果分析，无脱落。术后切口无感染，两组移植静脉无闭塞。
2.2 治疗前、后两组动物血压变化 见表1。
 
两组兔在实验前后血压变化差异无显著性意义 (P > 0.05)。
2.3 苏木精-伊红染色观察两组移植物的形态 肉眼可见对照组移植物管壁增厚，治疗组管壁增厚不明显。光镜下，对照组移植物内膜明显增厚，管腔缩小，内膜下出现大量平滑肌细胞增殖，增殖的平滑肌细胞排列紊乱，呈典型的分泌型细胞，细胞周围有较多的胶原纤维，中膜稍有增厚，见图1；治疗组内膜增厚较对照组减弱，中膜平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖较对照组明显减轻，中膜增厚不明显，见图2。

 

2.4 两组移植静脉管腔内膜、中膜厚度及面积的改变 见表2。

对照组与治疗组内膜厚度分别为(107.50±12.73)，(41.34±14.53) μm，差异具有显著性意义(P < 0.01)；内膜面积分别为(1.031±0.043)，(0.533±0.022) μm2，差异具有显著性意义(P < 0.01)。对照组与治疗组静脉移植物中膜厚度分别为(115.04±15.42)，(103.38±11.13) mm，差异无显著性意义(P > 0.05)；中膜面积分别为(1.092±0.051)，(1.054±0.030) mm2，差异无显著性(P > 0.05)。
2.5 增殖细胞核抗原免疫组织化学染色计算机图像分析 增殖细胞核抗原阳性表达表现为细胞核呈棕黄色染色，主要集中在新生内膜。对照组与治疗组的增殖细胞核抗原表达率分别为(65.04±4.56)%，(39.67±4.38)%；治疗组增殖细胞核抗原的表达明显低于对照组，差异具有显著性意义(P < 0.01)，见图3，图4。

3 讨论

冠状动脉旁路移植术后，静脉移植物的再狭窄严重地影响了手术疗效。目前认为，血管内膜增生、中膜平滑肌细胞向内膜下移行、增殖是再狭窄的主要病理过程[1-2]。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统中最重要的活性物质，产生途径包括经典的血管紧张素转化酶途径在肺内生成，或者由胃促胰酶、组织蛋白酶等旁路途径在血管壁局部生成[3-4]。在静脉移植物中，也可以观察到血管紧张素转化酶和胃促胰酶的含量明显增加，致血管紧张素Ⅱ产生增多[5-6]。血管紧张素Ⅱ与主要位于血管平滑肌细胞的AT1受体结合后，促进了血管内膜增生、平滑肌细胞增殖、迁移[7-8]。因此，血管紧张素Ⅱ在移植静脉病变过程中发挥了重要作用。研究证实，无论使用血管紧张素转化酶抑制剂干预经典途径还是使用胃促胰酶抑制剂干预旁路途径，对血管重建术后的再狭窄均显示了相应的抑制作用[9-11]。这也提示，如果同时阻断两种途径产生的血管紧张素Ⅱ或者在受体水平阻断其与AT1受体的结合，应该能更有效地抑制静脉移植物的再狭窄。因此，本实验选择AT1受体拮抗剂缬沙坦，观察了其对兔颈部自体移植静脉的干预作用。
本实验发现，治疗组兔颈部移植血管内膜厚度及内膜面积均较对照组明显减少，差异具有显著性意义(P < 0.01)；中膜厚度及中膜面积两组差异无显著性意义(P > 0.05)。表明自体静脉移植术后，移植物内膜增生是移植物失效的主要原因，而缬沙坦能有效抑制移植物的内膜增生。
增殖细胞核抗原阳性细胞数的增加是内膜增生在组织学上的表现之一。增殖细胞核抗原是DNA多聚酶δ的一个辅助亚单位，在G1晚期和S期表达，协助DNA引导链和随从链的合成，是细胞增殖的特异性标志[12]。移植血管受损后，血管紧张素Ⅱ表达增加并与受体结合，刺激平滑肌细胞增殖、迁移、内膜增厚，增殖细胞核抗原阳性细胞数显著增加，其表达越多说明增殖越强[13]。一般认为正常血管中的增殖细胞核抗原表达极低[14]，本实验测得正常颈外静脉的增殖细胞核抗原阳性表达率仅为（0.073±0.022）%，而对照组与治疗组移植静脉中的增殖细胞核抗原表达均显著增高，分别为（65.04±4.56）%、(39.67±4.38)%，而治疗组增殖细胞核抗原的表达程度较对照组低，差异具有显著性意义(P < 0.01)，表明缬沙坦可抑制新生内膜表达增殖细胞核抗原，减轻平滑肌细胞的增殖，抑制移植物内膜增生，干预移植静脉的再狭窄。
本实验中，对照组和治疗组的平均动脉压在用药前后的变化差异无显著性意义(P > 0.05)，表明缬沙坦不降低实验动物的正常血压，其抑制移植物内膜增生的作用不依赖于降压效应而实现，这与其他实验相符[15-16]。
对人的大隐静脉的研究表明，静脉内胃促胰酶含量远高于内乳动脉内含量，而植入动脉系统后，静脉桥内的血管紧张素转化酶活性比原位大隐静脉明显升高，因此，在受体水平阻断血管紧张素系统，对抑制静脉桥的再狭窄具有一定的临床意义[17-18]。缬沙坦是临床上效果明确、耐受良好的抗高血压药物，Val-PREST试验与Valvace试验证实了缬沙坦对支架术后再狭窄的防治作用，而且其效果优于血管紧张素转化酶抑制剂[19-20]。因此，本实验为临床验证缬沙坦对移植静脉再狭窄的防治作用提供了依据。对于AT1受体拮抗剂干预移植静脉再狭窄的分子生物学机制，有待于进一步的研究。

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