破骨细胞三维培养体系的建立**☆

肖新华1，廖二元2，董源媛1，赵向1，刘江华1，曹仁贤1，文格波1

课题背景：破骨细胞是惟一能吸收矿化骨的细胞，在骨发育、骨形成、骨吸收和骨量的调节方面起着关键作用。到目前为止，虽然还没有建立成熟的破骨细胞株，但近年来随着对破骨细胞分化调控机制的深入认识，破骨细胞的体外培养基础研究进展迅速。因此获取纯度高，利于分子生物学研究，有骨吸收功能的破骨细胞非常重要。

同行评价：本实验选择孔径0.4 μm聚碳酸酯膜的Transwell培养板，将基质细胞与破骨前体细胞分层共培养，成功建立了可形成成熟的、有骨吸收功能的多核破骨细胞的三维培养体系。文章立意明确，选题新颖，设计严谨，有较高的学术水平与创新性。

重要的概念：骨组织持续地进行骨重建，包含成骨细胞和破骨细胞主导的2个对立的统一过程：成骨细胞的主导骨形成过程及破骨细胞的主导骨吸收过程。破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成之间的平衡是维持正常骨重建的基础。破骨细胞的数量及活性改变是导致各种代谢性骨病如骨质疏松症、Paget's骨病、类风湿性关节炎、癌症骨转移等的主要原因，也是代谢性骨病研究的热点和重点。

1南华大学附属第一医院内分泌科，湖南省衡阳市 421001；2 中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所，湖南省长沙市 410013

肖新华☆，男， 1973年生，湖南省衡阳市人，汉族， 2005年中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所毕业，博士，主治医师，主要从事骨质疏松临床和基础研究。
Xiaoxinhua139@
163.com

湖南省自然科学基金资助项目(07JJ6160)*；湖南省卫生厅课题资助(2007117)*

摘要
背景：建立基质细胞与骨髓细胞共培养模型能诱导破骨样细胞产生，但这种培养体系存在细胞不单纯，不适合基因转染等缺点。
目的：建立基质细胞MBA-1细胞与破骨前体细胞RAW264.7共培养形成不混杂基质细胞的成熟多核破骨细胞的新方法。
设计、时间及地点：开放性实验，于2006-10/2007-03在南华大学附属第一医院临床研究所实验室完成。
材料：小鼠源性破骨前体细胞RAW264.7细胞从ATCC引进，基质细胞MBA-1细胞由周厚德博士惠赠。
方法：RAW264.7 细胞以1×104/孔接种于Transwell三维培养板下层，将聚碳酸酯膜孔径0.4 μm的培养板上层先取出接种MBA-1细胞，待细胞贴壁胞体伸展后，将其重新与下层联合共培养，共培养体系细胞每3 d换液1次。
主要观察指标：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察染色阳性的破骨细胞形态特点。②扫描电镜观察骨吸收陷窝形态，评价共培养形成的破骨样细胞骨吸收活性。
结果：共培养体系中的RAW264.7细胞，第9天可见较多TRAP阳性单核细胞，出现TRAP阳性多核破骨样细胞。共培养14 d后，已分化成熟的破骨细胞，能形成骨吸收陷窝。
结论：MBA-1细胞与破骨前体细胞RAW264.7分层共培养可形成成熟的、有骨吸收功能的多核破骨细胞，且这种破骨细胞中不混杂基质细胞。
关键词：破骨细胞；共培养；基质细胞；组织构建

肖新华，廖二元，董源媛，赵向，刘江华，曹仁贤，文格波. 破骨细胞三维培养体系的建立[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3863-3866 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3863(ps).pdf]

中图分类号:R329.471
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)20-03863-04

BACKGROUND:Coculture model of stromal cells and bone marrow cells can induce production of osteoclast. However, the cells by this culture system are not purified and not suitable for gene transfection.
OBJECTIVE: To establish a coculture model of stromal cells MBA-1 and osteoclast precursor RAW264.7 in order to provide a new method for studying coupling mechanism of the osteoblasts and osteoclasts.
DESIGN, TIME AND SETTING: The open experiment was performed at the laboratory of Institute of Clinical Research, First Hospital OF Nanhua University from October 2006 to March 2007.
MATERIALS: MBA-1 cells were graciously provided by Dr. Zhou and RAW264.7 cells were brought from ATCC.
METHODS: RAW264.7 cells were seeded onto the lower layer of Transwell 3D culture plate with a density of 1×104 cells per hole and MBA-1 cells were seeded on the separated upper layer of the culture plate (polycarbonate membrane diameter, 0.4 μm). When the MBA-1 cells began to attach and expand, they were cocultured with RAW264.7 cells by combining the two layers of culture plate. The culture solution was replaced every three days.
MAIN OUTCOME MEASURES: The morphological features of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive osteoclasts; The activity of bone absorption of osteoclast-like cells from coculture system by observing the absorption lacuna under a scanning electron microscopy.
RESULTS: There were many TRAP positive monocytes and a small quantity of TRAP positive multinucleated osteoclast-like cells in coculture system when cultured for 9 days. Mature osteoclasts and bone absorption lacunas appeared after coculture for 14 days.
CONCLUSION: Separate layer and co-culture of MBA-1 cells and RAW264.7 cells form mature multinucleated osteoclasts in vitro with bone absorption capacity but no stromal cells.

Xiao XH, Liao EY, Dong YY, Zhao X, Liu JH, Cao RX, Wen GB. Three-dimensional coculture system for osteoclasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3863-3866(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3863(ps).pdf]

0 引言

骨重建是一种有序、偶联的骨吸收和骨形成过程。在正常骨重建中，破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成紧密关联并具程序控制，即骨形成与骨吸收偶联以达到骨代谢动态平衡。成骨细胞的培养较为容易，方法也比较成熟。而破骨细胞属于终末细胞，在体内的数量较少，分离纯化也很困难，且不能分化传代，限制了对破骨细胞进一步研究，因此如何获得大量的纯度高的破骨细胞成为研究破骨细胞的重点。目前破骨细胞培养技术相对滞后，本实验采用基质细胞与破骨前体细胞RAW264.7共同分层三维培养，期望找到一种有效便捷的获得高纯度破骨细胞的方法。
在细胞培养中小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞及基质细胞MBA-1用含体积分数为0.1的 FBS的无酚红DMEM培养液培养，其中含50 U/mL青霉素和50 mg/L庆大霉素。细胞接3 d换液1次。

设计：开放性实验。
单位：南华大学附属第一医院。
材料：实验于2006-10/2007-03在南华大学附属第一医院临床研究所实验室完成。

实验过程：
共培养体系建立：RAW264.7 细胞以1×104/孔接种于三维培养板(Transwelll培养板)下层，将膜孔径0.4 μm的Transwell培养板上层先取出置另一培养皿中，接种MBA-1细胞，待细胞贴壁胞体伸展后，将Transwell培养板上层重新与下层联合共培养。
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：共培养体系细胞每3 d换液1次，第9天取下层的RAW264.7细胞TRAP染色(sigma,387-A)，细胞用柠檬酸盐/丙酮溶液固定30 s, 在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37 ℃孵育1 h，蒸馏水洗3次，苏木精复染2 min，干燥后二甲苯透明，DPX封固，光镜观察。
骨吸收功能鉴定：骨磨片的制备与处理：用钢锯将新鲜牛股骨皮质切成200 μm厚的骨片，再磨成厚 10 μm长的骨片，超声波清洗3次，5 min/次。用DMEM培养液（含1×104 U/L青霉素，１g/L链霉素，3 g/L两性霉素B）浸泡，置-20 ℃冰箱待用。用前紫外线照射1 h。将预先处理好骨片置Transwell培养板下层中，W264.7 细胞接种在骨片上，余方法同前，与MBA-1细胞联合培养14 d后，取出骨片，PBS洗涤，5%次氯酸钠孵育5 min，PBS漂洗。
电镜扫描：把生长有破骨细胞的骨片以0.25%氢氧化铵超声处理10 min，清除骨片上的破骨细胞,然后以2.5%戊二醛固定，再经1%锇酸固定，乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，二氧化碳临界点干燥，镀金，扫描电镜观察骨吸收陷窝并摄片。
主要观察指标： ①抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞形态。②共培养形成的破骨样细胞骨吸收活性。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施和评估为第一、二、三作者。

2.1 TRAP染色阳性的破骨细胞形态对照组（没有与MBA-1细胞共培养）RAW264.7细胞很少有TRAP阳性单核细胞，没有TRAP阳性多核破骨样细胞形成，见图1。

共培养体系中的RAW264.7细胞第9天可见较多TRAP阳性单核细胞，胞浆呈红色，出现TRAP阳性多核破骨样细胞，见图2。

2.2 骨吸收陷窝
RAW264.7与MBA-1细胞共培养14 d 后:
RAW264.7细胞贴附在骨片上，其大小及形态各异。
胞体小，密度高的细胞是尚未分化的破骨细胞前体细胞, 没有形成骨吸收陷窝。

细胞体大, 胞体边缘明显可见短刺状、掌状、指状突起，伪足多,密度低的细胞是已分化成熟的破骨细胞，能形成骨吸收陷窝。

细胞体平铺于骨片或低于骨表面，细胞下方隐约可见骨吸收窝，见图3。去除细胞的骨片上吸收陷窝边界清晰，见图4。

骨质疏松是以骨量减少，骨微结构破坏和脆性增加为特征的代谢性骨病。目前国内正在步入老龄化社会，预防和治疗骨质疏松症的重要性不言而喻。骨质疏松的发生, 大多由于破骨细胞产生增多、活性增强导致骨吸收大于骨形成，骨基质降解明显大于形成，导致骨量丢失和骨质量下降[1]。破骨细胞属单核细胞/巨噬细胞谱系，起源于造血干细胞或骨髓远祖细胞，经增殖、分化、生存与融合发育为多核的成熟破骨细胞，最后被活化成为有骨吸收功能的成熟破骨细胞。破骨细胞是惟一能吸收矿化骨的细胞，在骨发育、骨形成、骨吸收和骨量的调节方面起着关键作用。当前骨质疏松的主要治疗措施是通过抑制破骨细胞的活化和功能从而延缓骨吸收[2]。到目前为止，虽然还没有建立成熟的破骨细胞株，但近年来随着对破骨细胞分化调控机制的深入认识，破骨细胞的体外培养基础研究进展迅速[3-8]。
目前根据实验的要求、所需破骨细胞的纯度和数量，分离纯化破骨细胞的方法各异。如四肢长骨机械分离法，操作简单但获得的破骨细胞纯度低；骨髓诱导培养法，需成骨细胞系的支持和1，25（OH）2D3、地塞米松等促分化的作用，也不能获得很纯的破骨细胞。而且这些方法均需从动物（大鼠、小鼠及兔等）骨髓中获得破骨细胞，操作复杂且其纯度仍不十分理想。近年来，对破骨细胞分化调控机制的深入认识，用RANKL和M-CSF可直接诱导破骨细胞的产生[9-10]。成骨/基质细胞参与了破骨细胞分化、融合及活化的所有阶段，而RANKL和M-CSF可取代成骨/基质细胞刺激破骨细胞的形成。因破骨细胞起源于骨髓造血干细胞中的单核细胞前体细胞并由前体破骨细胞融合而成，且骨髓细胞取材相对容易，因此近年来采用骨髓细胞诱导破骨样细胞的方法逐渐增多，但目前仍无统一的培养标准[3,11-13]。
RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞，来自Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤，代表早期分化阶段的破骨细胞[14]。用RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞，第5天即可出现TRAP+的多核细胞[15]。这种方法所得的破骨样细胞不会污染其他细胞，便于破骨样细胞形态和功能的研究。但用于骨髓细胞或RAW264.7细胞诱导的细胞因子RANKL和M-CSF价格昂贵，在一定程度上限制了该培养法的应用。由于基质细胞和成骨细胞可分泌破骨细胞分化的关键因子RANKL和M-CSF，众多研究开始将基质细胞或成骨细胞与骨髓或脾细胞混合共培养[5-7,16-17]。
在体外由脾细胞或骨髓单核细胞向破骨细胞诱导的培养过程, 需要成骨或基质系的支持和活性维生素D、地塞米松的促分化作用, 培养体系较复杂, 且混合共育时，由于成骨细胞的生长优势作用，破骨细胞会大量消失，不利于长期的研究。基质细胞与骨髓共培养模型的建立加深了人们对破骨细胞的生物学行为的理解。然而, 这种培养体系存在细胞不单纯，含有其他细胞成分, 且不适合基因转染研究等缺点[18]。
本实验在此基础上改良，选择孔径0.4 μm聚碳酸酯膜的Transwell培养板，聚碳酸酯膜将基质细胞与破骨前体细胞分层共培养，由于小于3.0 μm孔径条件下，细胞不会迁徙通过，培养的介质和细胞因子可自由通过，将基质细胞与破骨前体细胞分层共培养（三维培养）。这种三维培养法使不同的细胞处在同一个培养环境下，但细胞并不直接接触，而是通过细胞分泌的各种物质影响对方的生物学功能。这既能利用基质细胞分泌的破骨细胞分化的关键因子RANKL和M-CSF，又避免基质细胞与破骨前体细胞的直接接触，这种三维培养体系所获破骨样细胞不会混杂基质细胞，有利于基因转染等分子生物学研究。

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