课题背景：血管紧张素转化酶2作为血管紧张素转化酶的同源酶，在肾素-血管紧张素系统中起重要的负向调节作用。课题观察了氧化低密度脂蛋白对血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2的影响。

应用要点：文章采用反转录-聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹方法，检测氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响，结果发现氧化型低密度脂蛋白显著上调血管紧张素转化酶蛋白及基因表达，下调血管紧张素转化酶2蛋白及基因表达，且呈剂量和时间依赖性。

同行评价：新近研究发现血管紧张素转化酶2与血管紧张素转化酶在功能上相拮抗。课题采用反转录-聚合酶链反应及Western blot方法，观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响，文章设计合理，数据可靠。

南方医科大学附属珠江医院，1心内科，2急诊科，广东省广州市
510280

周 鹏★，男，1972年生，四川省武胜县人，汉族，南方医科大学在读硕士。
zhoupeng707707@
sohu.com

通讯作者：李志樑，教授，博士生导师，南方医科大学附属珠江医院心内科，广东省广州市 510280 Liz06@163.com

广东省自然科学基金(06301193)*

摘要
目的：新近研究发现血管紧张素转化酶2与血管紧张素转化酶在功能上相拮抗。采用反转录-聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹方法，观察氧化型低密度脂蛋白对人血管内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响。
方法：实验于2007-05/08在南方医科大学附属珠江医院中心实验室完成。①用正常人新鲜血浆制备氧化低密度脂蛋白，人脐静脉内皮细胞株复苏、传代后取生长良好的3~6代用于实验。②实验分为7组：空白对照组加无血清培养基；20，40，80 mg/L氧化型低密度脂蛋白组分别与人脐静脉内皮细胞孵育24 h；40 mg/L氧化型低密度脂蛋白分别与人脐静脉内皮细胞孵育6，12，24 h。各组实验重复6次。③提取细胞总RNA及蛋白，应用反转录-聚合酶链反应检测血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2 mRNA表达水平；以蛋白质免疫印迹法检测血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2蛋白表达水平。
结果：①与空白对照组比较，氧化低密度脂蛋白20，40，80 mg/L组血管紧张素转化酶 mRNA表达增加，血管紧张素转化酶2 mRNA表达降低(P < 0.01)，不同剂量组间差异亦有显著性意义(P均 < 0.01)。40 mg/L氧化型低密度脂蛋白6，12，24 h组血管紧张素转化酶 mRNA表达增加，血管紧张素转化酶2 mRNA表达减少(P < 0.05)，不同时间点间差异亦有显著性意义(P均 < 0.05)。②与空白对照组比较，氧化低密度脂蛋白20，40，80 mg/L组血管紧张素转化酶蛋白表达增加，血管紧张素转化酶2蛋白表达减少(P < 0.01)，不同剂量组间差异亦有显著性意义(P均 < 0.01)。40 mg/L氧化型低密度脂蛋白6，12，24 h组血管紧张素转化酶蛋白表达增加，血管紧张素转化酶2蛋白表达降低 (P < 0.05)，不同时间点间差异亦有显著性意义(P均< 0.05)。
结论：氧化型低密度脂蛋白可上调血管紧张素转化酶蛋白及基因表达，下调血管紧张素转化酶2蛋白及基因表达，且呈剂量和时间依赖性。
关键词：脂蛋白类；肽基二肽酶A；内皮，血管；脐静脉/细胞学

周鹏，李志樑，徐春生，严全能，宋旭东，付强，陈文忠. 人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达与氧化型低密度脂蛋白的关系[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3869-3873
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3869(ps).pdf]

中图分类号:R329.412
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)20-03869-05

收稿日期：2007-08-14 修回日期：2007-10-25
(07-50-8-4408/G·Q)

Correlation of angiotensin converting enzyme and angiotensin converting enzyme 2 expressions to oxidized low-density lipoprotein in human umbilical vein endothelial cells

Abstract

AIM:Present studies have confirmed that angiotensin-converting enzyme (ACE) 2 has contrary function as ACE. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to investigate the effect of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) on the expressions of ACE and ACE2 in human vascular endothelial cells (hVECs).
METHODS: Experiments were performed at the Central Laboratory of Zhujiang Hospital of Southern Medical University from May to August 2007. ox-LDL was produced from human fresh plasma. Human umbilical vein endothelial cells (hUVECs) of 3rd-6th passages were rolled into the experiment. Cells in the blank control group were treated with serum-free medium. Cells in the 20, 40, 80 mg/L ox-LDL groups were separately inoculated with hUVECs for 24 hours. 40 mg/L ox-LDL were separately inoculated with hUVECs for 6, 12, 24 hours. Experiment was repeated six times in each group. Total RNA and protein were extracted. mRNA and protein expressions of ACE and ACE2 were respectively determined by RT-PCR and Western blot.
RESULTS: Compared to the blank control group, ACE mRNA expression increased, whereas ACE mRNA expression decreased in the 20, 40, 80 mg/L ox-LDL groups (P < 0.01). Significant differences were detected in different doses of groups (P < 0.01). ACE mRNA expression increased, whereas ACE mRNA expression decreased in the 40 mg/L ox-LDL groups at 6, 12, 24 hours (P < 0.05). Significant differences were detected at different time points (P < 0.05). Compared to the blank control group, ACE protein expression increased, whereas ACE protein expression reduced in the 20, 40, 80 mg/L ox-LDL groups (P < 0.01). Significant differences were detected in different doses of groups (P < 0.01). ACE protein expression increased, whereas ACE protein expression reduced in the 40 mg/L ox-LDL groups at 6, 12, 24 hours (P < 0.05). Significant differences were detected at different time points (P < 0.05).
CONCLUSION: Ox-LDL up-regulates the protein and gene expression of ACE and down-regulates the protein and gene expression of ACE2 in a concentration and time dependent manner.

Zhou P, Li ZL, Xu CS, Yan QN, Song XD, Fu Q, Chen WZ. Correlation of angiotensin converting enzyme and angiotensin converting enzyme 2 expressions to oxidized low-density lipoprotein in human umbilical vein endothelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20):3869-3873(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3869(ps).pdf]

0 引言

肾素-血管紧张素系统参与动脉粥样硬化的发生发展过程，与脂代谢紊乱在动脉粥样硬化形成中相互影响，氧化型低密度脂蛋白在其中占有重要地位[1-2]。血管紧张素转化酶2是Donogue等[3-4]于2000年首先发现并命名的肾素-血管紧张素系统新成员，是血管紧张素转化酶的同系物，血管紧张素转化酶2水解血管紧张素Ⅱ生成血管紧张素(1~7)，是血管紧张素的一种新的代谢方式，发挥与血管紧张素转化酶相抗衡的作用。本文采用反转录-聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法，观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响，分析氧化型低密度脂蛋白与血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2在动脉硬化形成中的作用。

1 材料和方法

设计：观察对比实验。
单位：南方医科大学附属珠江医院心内科。
材料：实验于2007-05/08在南方医科大学附属珠江医院中心实验室(absl-2)完成。人脐静脉内皮细胞株购自Cascade biologics公司。山羊抗人血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2多克隆抗体（购于美国Sanata Cruz公司），鼠抗山羊多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术公司，内皮细胞生长添加物购自美国Sigma公司，M200培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，反转录-聚合酶链反应试剂盒购于TIANGEN生化科技有限公司，乳酸脱氢酶试剂盒购自广州威佳科技有限公司，6孔细胞培养板和25 cm2培养瓶均购自美国Corning公司。CO2培养箱为美国 Thermo Forma公司，梯度聚合酶链反应仪及电泳仪为德国Biometra公司。实验方法符合医学伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者，均经过正规培训。
方法：
氧化型低密度脂蛋白制备：正常人新鲜血浆经密度梯度超速离心(50 000 r/min，10 ℃ 5 h)分离低密度脂蛋白，吸取低密度脂蛋白后置于生理盐水中透析24 h (4 ℃，每6 h换液1次)，后置于含50 μmol/L CuSO4的缓冲液中，37 ℃ 温育24 h，使其氧化修饰成为氧化型低密度脂蛋白，加EDTA终止氧化反应，4 ℃ 透析6 h×现出6次，以充分除去Cu2+和EDTA。制备的氧化型低密度脂蛋白经4 g/L的琼脂糖疑胶电泳，苏丹黑染色后观察迁移率以验证氧化程度，Bradford法蛋白质定量。
人脐静脉内皮细胞冻存细胞复苏、传代：冻存细胞复苏后接种于M200培养液(pH 7.4，含体积分数为0.1的胎牛血清、50 ng/L的内皮细胞生长添加物、5 kU/L肝素、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素)，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天换液1次，两三天后铺满培养瓶，在倒置显微镜下，细胞呈梭形鱼贯状排列或呈多角形镶嵌排列。2.5 g/L胰蛋白酶进行消化、传代，取3~6代增殖细胞制成细胞悬液，20 g/L椎虫蓝染色判断细胞活性，活细胞数占细胞总数96%以上。人脐静脉内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的SP免疫组织化学染色法可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆丰富，并有棕黄色的染色颗粒，证实培养的细胞为内皮细胞。按1.0×106个/孔的细胞密度接种于6孔板，加含体积分数为0.1的胎牛血清的M200培养基置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中进行培养，待人脐静脉内皮细胞生长呈亚融合状态时，换以无血清培养基培养24 h，分别加入不同剂量氧化型低密度脂蛋白刺激。

实验共分为7组：①空白对照组。②不同剂量组：分别加入终浓度分别为20，40，80 mg/L的氧化型低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞孵育24 h。③不同时间组：氧化型低密度脂蛋白终浓度为40 mg/L，分别与人脐静脉内皮细胞孵育6，12，24 h。各组实验重复6次。
反转录-聚合酶链反应检测血管紧张素转化酶2 mRNA表达：①总RNA提取：各组刺激结束后，每孔加入Trizol裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀，体积分数为0.75的乙醇（DEPC水配制）洗涤，无RNase水溶解沉淀，-70 ℃保存备用。所得RNA吸光度值(A260/A280)在1.8~2.0，纯度适合作反转录-聚合酶链反应模板。②cDNA的聚合酶链反应扩增：将RNA反转录生成的cDNA作为模板进行扩增。血管紧张素转化酶2引物序列：上游引物5’-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3’，下游引物5’-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3’，目的产物，的扩增片段为108 bp。血管紧张素转化酶引物序列：上游引物 5’-TCGGCCATGTTGA GCTACTTC -3’，下游引物5’-TCCCCATGCAGCT CGTTC-3’，目的产物的扩增片段为68 bp。GAPDH引物序列：上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，目的产物的扩增片段为258 bp。聚合酶链反应条件均为：95 ℃ 预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2分别以58.6 ℃、55.0 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，循环34次，最后延伸7 min。聚合酶链反应产物的定量：取12 μL扩增产物于质量分数为15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶图像分析仪扫描分析各条带，测定其吸光度值，并与恒量表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶相对比值作为半定量指标。
Western blot：RIPA（使用前加入单去污裂解液）裂解组织总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，分装后-70 ℃ 保存。制备80 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶，取50 μg蛋白质煮沸持续5 min使蛋白质变性，上样后分离胶60 V，浓缩胶100 V电泳，总时间3 h左右，转至聚偏二氟乙烯膜上，用50 g/L的脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入按1∶250稀释的一抗(山羊抗人血管紧张素转化酶2多抗)，4 ℃ 培育过夜，用含体积分数为0.001的吐温20的Tris缓冲液洗3次；加入按1∶500稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记鼠抗羊IgG)，室温培育1 h，进行化学发光反应。膜扫描后分析吸光度值，各实验组之间进行半定量分析和比较。
主要观察指标：各组脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2 mRNA及蛋白表达。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.5软件对数据进行统计学分析，计量资料以_x±s表示，多组均数间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析；P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 人脐静脉内皮细胞培养上清液乳酸脱氢酶活性比较 空白对照组、氧化型低密度脂蛋白20，40，80 mg/L组、40 mg/L氧化型低密度脂蛋白6，12，24 h组人脐静脉内皮细胞培养上清液乳酸脱氢酶活性分别为（986.31±106.70，1 005.76±101.49，1 044.65±100.94，1 072.44±126.37，1 030.76±96.29，1 050.21±97.20及1 069.67±100.33）nkat/L，各组乳酸脱氢酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)，表明干预因素对各组人脐静脉内皮细胞生存无明显影响。
2.2 氧化型低密度脂蛋白对血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2 mRNA表达的影响 见图1。

 

如图1所示，基础状态下，培养的人脐静脉内皮细胞即有一定量的血管紧张素转化酶、血管紧张素转化酶2 mRNA表达。经氧化型低密度脂蛋白刺激后，血管紧张素转化酶 mRNA表达增加，血管紧张素转化酶2 mRNA表达量减少，呈剂量与时间依赖性。氧化低密度脂蛋白20，40，80 mg/L组血管紧张素转化酶 mRNA表达水平为空白对照组的1.34，2.53，3.11倍，血管紧张素转化酶2 mRNA表达水平为空白对照组的0.74，0.45，0.28倍(P < 0.01)，不同剂量组间差异亦有显著性意义(P均< 0.01)。40 mg/L氧化型低密度脂蛋白6，12，24 h组血管紧张素转化酶 mRNA表达水平为空白对照组的1.83，2.23，2.61倍，血管紧张素转化酶2 mRNA表达水平为空白对照组的0.61，0.47，0.40倍(P < 0.05)，不同时间点间差异亦有显著性意义（P均 < 0.05）。
2.3 氧化型低密度脂蛋白对血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2蛋白表达的影响 见图2。
如图2所示，经氧化型低密度脂蛋白刺激后，氧化低密度脂蛋白20，40，80 mg/L组血管紧张素转化酶蛋白表达水平为空白对照组的1.29，1.81，2.80倍，血管紧张素转化酶2蛋白表达水平为空白对照组的0.81，0.50，0.32倍(P < 0.01)，不同剂量组间差异亦有显著性意义 (P均< 0.01)。40 mg/L氧化型低密度脂蛋白6，12，24 h组血管紧张素转化酶蛋白表达水平为空白对照组的1.53，1.70，1.79倍，血管紧张素转化酶2蛋白表达水平为空白对照组的0.63，0.53，0.49倍 (P < 0.05)，不同时间点间差异亦有显著性意义（P均 < 0.05）。

3 讨论

肾素-血管紧张素系统与脂质紊乱在动脉粥样硬化发生发展中相互作用，动脉粥样硬化组织中血管紧张素转化酶的活性、血管紧张素Ⅱ及血管紧张素Ⅱ1型受体水平明显增高，且血管紧张素Ⅱ1型受体表达量与动脉粥样硬化的严重程度和动脉内膜的厚度关系密切[5]，血管紧张素Ⅱ可以通过其1型受体激活巨噬细胞膜上还原型辅酶1的氧化酶系统，氧化修饰低密度脂蛋白生成氧化型低密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白及其脂质成份激活血管内皮细胞是动脉硬化发生和发展的重要环节，可以引起血管内皮细胞功能紊乱[6]。血管紧张素转化酶2是1种Ⅰ型膜内在蛋白，基因定位于X染色体，是肾素-血管紧张素系统建立以来发现的第1个血管紧张素转化酶同系物，主要分布于血管内皮细胞和肾小管上皮细胞，在心脏、肾脏、子宫、脑和胃肠组织中表达，在功能上，参与高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肝损伤、急性呼吸窘迫征、妊娠等疾病的发生、发展过程[7-9]。Zulli等[10]通过免疫组织化学方法证实，在动脉粥样硬化病变内巨噬细胞、平滑肌细胞及新生内膜内皮细胞中均可检测到血管紧张素转化酶2蛋白表达，并认为血管紧张素转化酶2参与动脉粥样硬化发生发展并具有抗动脉粥样硬化作用。
本实验通过体外培养人脐静脉内皮细胞，采用反转录聚合酶链式反应和Western Blot方法，从不同水平观察氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶2表达的影响。Diet等[11]发现氧化型低密度脂蛋白可攻击血管紧张素转化酶基因，在局部血管壁内产生血管紧张素Ⅱ，通过组织肾素-血管紧张素系统发挥其病理生理作用。作者将人脐静脉内皮细胞与氧化型低密度脂蛋白共同培养，发现氧化型低密度脂蛋白呈剂量及时间依赖性上调人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶基因和蛋白表达，与Li等[12]报道一致，其结果可使血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ增多。增加的血管紧张素Ⅱ促进低密度脂蛋白氧化为氧化型低密度脂蛋白，还促进内皮、巨噬细胞、平滑肌细胞表达LOX-1，进一步促进氧化型低密度脂蛋白的摄取，加重脂质沉积[13-14]。
在肾素-血管紧张素系统中，血管紧张素转化酶2作为1种专一的单羧基肽酶(锌依赖性金属蛋白酶)，以胞外酶的形式水解血管紧张素Ⅰ羧基末端的亮氨酸残基将其转换为血管紧张素(1~9)，并进一步在血管紧张素转化酶或其他肽酶水解下生成血管紧张素（1~7）；或者直接水解血管紧张素Ⅱ生成血管紧张素(1~7)，研究证实血管紧张素转化酶2水解血管紧张素Ⅱ时的催化活性较水解血管紧张素Ⅰ高400倍[15]，是血管紧张素Ⅱ水解的主要途径。人类心力衰竭和心肌梗死过程的血管紧张素转化酶2研究都表明血管紧张素转化酶2的上调有助于其产物血管紧张素(1~7)预防血管紧张素Ⅱ诱导的心室重构[16]。本文结果显示在翻译和转录水平，氧化型低密度脂蛋白呈浓度及时间依赖性使血管紧张素转化酶2表达下调，其作用除直接减少血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ降解外，还可减少与血管紧张素转化酶竞争同一底物血管紧张素Ⅰ，间接增加血管紧张素Ⅱ生成。这说明氧化型低密度脂蛋白一方面通过细胞毒性损害内皮细胞及增加内皮细胞表达黏附分子，有利于单核细胞及低密度脂蛋白进入内膜下促进动脉硬化形成，另一方面还具有影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统的多效性作用，通过增加血管紧张素转化酶、血管紧张素Ⅱ1型受体表达及降低血管紧张素转化酶2表达两条途径增加血管紧张素Ⅱ，并彼此影响，共同促进动脉硬化，还降低血管紧张素转化酶2表达使具有扩血管作用血管紧张素(1~7)生成减少，最直接的结果就是收缩血管，通过升高血压这一机械因素促进动脉粥样硬化的发生。
有研究证实氧化型低密度脂蛋白通过激活MAPKp42/44信号传导途径上调人内皮细胞上血管紧张素转化酶基因表达，使血管紧张素转化酶活性增加，血管紧张素Ⅱ生成增多，还可促进内皮细胞血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA及其蛋白表达增加，结合更多血管紧张素Ⅱ[17]。但氧化型低密度脂蛋白下调血管紧张素转化酶2的机制尚未明了。Ferrario等[18]报道血管紧张素转化酶抑制剂或肾上腺素受体阻断剂引起血管紧张素转化酶2的高表达或酶活性升高，导致血管紧张素Ⅱ的减少，最终使得血压下降、靶器官损害减轻，Tallant等[19]发现血管紧张素Ⅱ能够通过其血管紧张素Ⅱ1型受体降低血管紧张素转化酶2的表达。氧化型低密度脂蛋白所诱导的血管紧张素转化酶2表达降低是血管紧张素转化酶表达增加后的代偿还是协同作用，尚需进一步探讨。发展血管紧张素转化酶2的活性调节剂，明确治疗靶点，均是将来需要研究的课题。
血管紧张素转化酶2作为血管紧张素转化酶的同源酶，可产生具有血管舒张活性和抗增生作用的血管紧张素（1~7），产生与经典的肾素-血管紧张素系统拮抗的作用，这种平衡决定了循环和器官局部肾素-血管紧张素效应肽的水平，对维持血压和心脏正常结构功能有重要意义[20]。血管紧张素转化酶2不仅是体内惟一的能够直接降解血管紧张素Ⅱ的物质，还降解去9位精氨酸缓激肽、神经降压肽1~13、apelin-13、强啡肽A(1~13)和运动升压素等[21]，通过这些底物多角色、多途径的参与血管功能调节。目前该酶的生理意义和功能还不完全清楚，深入了解血管紧张素转化酶2分子机制、生理功能以及如何有效地调控它的表达，具有重要的意义。

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