大鼠缺血再灌注损伤肢体骨骼肌形态和组织中细胞因子变化及高压氧的干预*★

高博1，任为1，张彦2，宋红3，汪永强2，雷燕2，赵渝1

课题背景：国内外在缺血预处理或药物预处理等方面作了大量工作，但因后期疗效差或费用昂贵等原因，均难于广泛用于临床。因此，寻求一种便捷有效的治疗手段以保证尽早恢复缺血组织血流的同时减轻或防止缺血再灌注损伤,是其防治中亟待解决的重要课题。

应用要点：目前国内外关于高压氧治疗脑外伤、断肢再植等领域报道较多，将其应用于肢体缺血再灌注损伤的治疗尚较少见；本实验应用高压氧作用于大鼠不同时相的缺血再灌注肢体，证实其有效抑制了炎症因子激活释放，促进了纤溶系统激活，对缺血再灌注肢体的结构功能产生了较显著的保护作用。

同行评价：实验着眼于高压氧对大鼠不同时相肢体缺血再灌注所造成的炎症反应、凝血激活及组织形态学改变等方面的影响，以期证实高压氧对肢体缺血再灌注损伤的保护作用。文章有一定科学性，内容较新颖。

重庆医科大学， 1附属第一医院血管外科，2医学检验系，3公共卫生学院，重庆市 400016

高博★，男，1981年生，山东省临沂市人，汉族，2005年重庆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事血管外科基础与临床研究。
Bob_20000@
163.com

通讯作者：任为，博士，副教授，重庆医科大学附属第一医院血管外科，重庆市
400016

摘要
背景：近年有学者提出高压氧对缺血再灌注损伤氧自由基的清除有正性作用，并能提高三磷酸腺苷合酶的活性，调节钠钙平衡，抑制钙内流，从而有效保护细胞，减轻缺血再灌注损伤。
目的：从骨骼肌的病理和细胞因子改变角度，观察高压氧对不同时相肢体缺血再灌注的影响。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-04/09在重庆医科大学实验动物中心完成。
材料：健康SD大鼠108只，体质量250~300 g。随机分为空白对照组12只、缺血再灌注组48只与高压氧组48只，雌雄对等。
方法：空白对照组不做缺血再灌注；缺血再灌注组和高压氧组持续缺血8 h，分别行再灌注0，4，24，72 h。高压氧组造模后连续5 d给予高压氧处理。
主要观察指标：检测各组大鼠组织萃取液中白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物、组织纤溶酶原激活物抑制剂1含量；以大鼠腓肠肌制备电镜和光镜标本，观察其骨骼肌微血管超微结构和组织形态变化；
结果：①再灌注后各个时点，高压氧组组织纤溶酶原激活物含量较缺血再灌注组均显著升高；白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物抑制剂1含量较缺血再灌注组均显著降低(P < 0.05)。②再灌注24 h，与缺血再灌注组比较，高压氧治疗组骨骼肌细胞肿胀及炎性细胞浸润均较轻，微血管内几乎无微血栓形成，肌小节极少断裂，质膜较少破坏，少数线粒体肿胀，髓样结构形成。
结论：损伤后72 h之内高压氧对缺血再灌注肢体产生了较显著的保护作用，该作用可能与抑制炎症因子激活释放，促进纤溶系统激活有关。
关键词：再灌注损伤；细胞因子；高压氧；组织构建

高博，任为，张彦，宋红，汪永强，雷燕，赵渝. 大鼠缺血再灌注损伤肢体骨骼肌形态和组织中细胞因子变化及高压氧的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(20):3874-3878 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3874(ps).pdf]

中图分类号:R392.114
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)20-03874-05

Hyperbaric oxygen effects on the cytokines and morphological changes of the skeletal muscle in rats following ischemia/reperfusion injury

Abstract

BACKGROUND:Hyperbaric oxygen has positive effects on clearance of oxygen free radical following ischemia/reperfusion injury, increases adenosine triphosphate synthase activity, regulates natrium-calcium balance, inhibits calcium influx, resulting in effectively protecting cells and relieving ischemia/reperfusion injury.
OBJECTIVE: To investigate the effects of hyperbaric oxygen on the limb ischemia/reperfusion at different phases from the angle of pathology and cytokine of the skeletal muscle.
DESIGN, TIME AND SETTING: Randomized controlled animal experiments were performed at the Laboratory Animal Center of Chongqing Medical University from April to September 2007.
MATERIALS: 108 healthy SD rats weighing 250-300 g (male or female equally) were randomly divided into a blank control group (n=12), an ischemia/reperfusion group (n=48) and a hyperbaric oxygen group (n=48).
METHODS: Rats in the blank control group did not treat by ischemia/reperfusion injury. Rats in the ischemia/reperfusion group and the hyperbaric oxygen group underwent different phases of reperfusion including 0, 4, 24 and 72 hours after 8 hours of sustained ischemia. Rats in the hyperbaric oxygen group were treated with hyperbaric oxygen for 5 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: Interleukin 1, interleukin 6, interleukin 8, plasminogen activator inhibitor 1, and tissue plasminogen activator levels were measured in protein extracts for each experimental interval. Electron microscope and light microscope were used to observe the ultramicrostructure and morphology changes in the skeletal muscle and capillary of rat gastroenemius.
RESULTS: In hyperbaric oxygen group, tissue plasminogen activator levels significantly increased compared with the ischemia/reperfusion group. Interleukin 1, interleukin 6, interleukin 8 and plasminogen activator inhibitor 1 levels in various time points significantly decreased compared with the ischemia/reperfusion group (P < 0.05). Compared with the ischemia/reperfusion group, the cellular swelling of skeletal muscle and the local cytokine response were significantly lower, almost without microvascular thrombosis in capillary vessel; The sarcomere was rarely collapsed, little plasma membrane was shattered, little mitochondrial swelled or formatted the myelinfigure in the hyperbaric oxygen group 24 hours after reperfusion.
CONCLUSION: Hyperbaric oxygen had a more significant protective effect on limb ischemia and reperfusion within 72 hours following injury. This effect is associated with inhibition of inflammatory factor activation and release as well as promotion of fibrinolytic system activation.

Gao B, Ren W, Zhang Y, Song H, Wang YQ, Lei Y, Zhao Y. Hyperbaric oxygen effects on the cytokines and morphological changes of the skeletal muscle in rats following ischemia/reperfusion injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(20): 3874-3878(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-20/20k-3874(ps).pdf]

0 引言

高压氧疗法指机体处于高气压（大于1个标准大气压）环境中呼吸与环境等压的高压纯氧或高压混合氧（97%O2+ > 3%CO2）。实验着眼于高压氧这一手段，旨在认识肢体缺血-再灌注损伤的发生情况和病理改变与高压氧在不同时相干预后肢体缺血再灌注的变化。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2007-04/09在重庆医科大学实验动物中心完成。
材料：清洁级健康SD大鼠108只，体质量250~300 g，雌雄对等（重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(渝)2007-0001；使用许可证号：SYXK(渝)2007-0001）。将108只实验大鼠随机分为空白对照组12只、缺血再灌注组48只与高压氧组48只。缺血再灌注组和高压氧组分别行再灌注0，4，24，72 h，每时间点12只，雌雄对等。

干预措施：
大鼠肢体缺血模型建立：采用止血带建立大鼠肢体缺血模型[1]。刮除大鼠大腿根部、髋关节稍下方部位体毛，应用压力为0.04 kg左右的止血带结扎，造成不完全缺血模型，持续缺血 8 h后松解止血带行再灌注。预试验证实不完全缺血8 h以上方可产生再灌注损伤。经激光多普勒灌注监测仪证实各组大鼠再灌注后患肢血供良好。
各组处理：空白对照组：仅刮除结扎部位体毛，不做缺血再灌注；缺血再灌注组：持续缺血8 h，分别行再灌注0，4，24，72 h。高压氧组：持续缺血8 h，分别行再灌注0，4，24，72 h，连续5 d经过高压氧处理。
试验动物行高压氧疗，绝对压力为0.2 MPa，治疗时间120 min/d，持续5 d；具体为：将大鼠置于实验舱内，纯氧洗舱5 min，升压15 min至 0.1 MPa后稳压，吸纯氧60 min，减压45 min。
生化指标的测定：提取各组大鼠组织萃取液检测组织白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物、组织纤溶酶原激活物抑制剂1的含量。①组织萃取液的制备：新鲜样品与冰上快速剪切成小块，于液氮中冷冻，经研钵研磨成干粉，取适量干粉装入放有1 mL RIPA缓冲液及10 μL蛋白酶抑制剂的离心管中，低温离心机4 ℃以13 000 g/min转速高速离心 10 min，取上清液冻存于-80 ℃冰箱备用。②生化指标检测：将各组大鼠组织萃取液按酶联免疫反应试剂盒操作步骤（双蛋白夹心法）检测组织中各生化指标的浓度。
形态学检测：选取再灌注损伤24 h后的缺血再灌注组与高压氧组自缺血再灌注肢体腓肠肌切取电镜和光镜标本，进行组织病理学检测。观察不同干预措施下骨骼肌微血管超微结构和组织形态变化；取新鲜组织于40 g/L多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，行苏木精-伊红染色，于光镜下观察。取新鲜组织于5g/L戊二醛中固定，制备超薄切片于透射电镜下观察。
主要观察指标：①各组大鼠再灌注后不同时间点组织萃取液中白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物、组织纤溶酶原激活物抑制剂1的含量。②组织病理学变化。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一作者，评估为第三和第七作者。

统计学方法：由第4作者采用SAS 8.2统计软件进行分析，资料满足正态性和方差齐性，检验造模是否成功采用单因素方差分析，实验组与对照组间的差异比较采用Dunnett-t检验；对两因素实验设计的统计分析采用两因素的析因设计方差分析，并对因素水平间的差异进行两两比较。检验水准α=0.05。

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠108只，无脱失，全部进入结果分析。
2.2 统计推断各组大鼠组织萃取液中生化指标含量变化：见表1~5。

缺血再灌注组再灌注后各时点与空白对照组行两两比较的Dunnett-t检验得：再灌注后4，24，72 h组织中白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物抑制剂1含量均明显高于再灌注前水平 (P < 0.05)，而组织纤溶酶原激活物含量明显低于再灌注前水平(P < 0.05)，即是说缺血再灌注组大鼠肢体缺血8 h后行再灌注促炎及炎性因子大量产生，凝血系统激活，产生了较明显的再灌注损伤。
将再灌注后各时点结果行两两比较，高压氧组较缺血再灌注组再灌注后4 h 白细胞介素1含量显著降低；再灌注后24 h组织纤溶酶原激活物含量显著升高，白细胞介素6 、白细胞介素8、组织纤溶酶原激活物抑制剂1含量显著降低 (P < 0.05)。说明在再灌注损伤初期应用高压氧干预可使炎性因子白细胞介素1下降，再灌注损伤24 h后应用高压氧方可产生较显著的白细胞介素6、白细胞介素8等炎性和促炎因子的下降以及凝血系统的抑制。
2.3 统计描述缺血再灌注组与高压氧组大鼠腓肠肌组织再灌注病理学变化：①光镜观察：缺血再灌注组：骨骼肌细胞水肿明显，部分有细胞间隙的扩张，大量炎性细胞浸润，微血管内血栓形成，个别的呈片状出血、坏死，见图1。

高压氧组：骨骼肌细胞轻度水肿，间质有少量出血、坏死、炎性细胞漫润，见图2。 ②电镜观察：缺血再灌注组：肌小节大量断裂，质膜广泛破坏，绝大多数线粒体肿胀，髓样结构形成，见图3，图4。高压氧组：肌小节极少断裂，质膜较少破坏，少数线粒体肿胀，髓样结构形成，见图5，6。

高压氧自20世纪80年代用于临床以来，因其能够增强氧的弥散能力，促进局部侧枝循环的建立，改善微循环，利于血管神经功能的恢复和创伤愈合，显著改善外伤等所致的脑水肿、脑梗死与肢体坏死[2]，故而在脑外伤、断肢再植等方面应用较多；但在缺血再灌注损伤方面仍较少应用，然而近年少数学者提出高压氧对缺血再灌注损伤氧自由基的清除有正性作用，并能提高三磷酸腺苷合酶的活性，调节钠钙平衡，抑制钙内流，从而有效保护细胞，减轻缺血再灌注损伤[3-4]。
3.1 高压氧对肢体超微结构的作用肢体缺血再灌注损伤后骨骼肌细胞结构严重破坏，肿胀明显，大量出血、坏死、炎性细胞漫润，微血管内大量血栓形成。肌小节大量断裂，质膜显著破坏，线粒体肿胀，髓样结构形成。
本实验应用高压氧治疗后，骨骼肌细胞结构完整、清楚，个别有肿胀，有少量出血、坏死、炎性细胞漫润，微血管内几乎无血栓形成。肌小节极少断裂，质膜较少破坏，少数线粒体肿胀，髓样结构形成。其机制可能为：高压氧可迅速改善组织供氧，有氧氧化增强，能量生成增加，酸性代谢产物减少，纠正酸中毒，促进细胞代谢。且由于细胞产能增多，细胞膜上的离子泵功能恢复，细胞内外离子恢复正常，细胞膜与细胞器膜通透性改善、功能结构得以保持，血管活性物质减少，减轻了缺血再灌注对各种细胞器的损害[5]。
3.2 高压氧对纤溶系统的作用肢体缺血再灌注损伤发生后，血管内皮细胞、血小板和血液抗凝、凝血、纤溶系统等有关因子发生一系列变化[6]，血流动力学发生异常，有利于血栓形成，即所谓的血栓前状态。组织纤溶酶原激活物和组织纤溶酶原激活物抑制剂1等是反映机体血栓前状态的敏感指标[7]。Imperatore等[8]则应用高压氧有效抑制组织纤溶酶原激活物抑制剂1等的升高，从而抑制了酵母聚糖所诱发的凝血反应。李雁等[9]研究发现高压氧对血管内皮细胞损伤大鼠纤溶系统有显著激活作用。
本实验应用高压氧治疗后，在再灌注后24，72 h两个时点组织纤溶酶原激活物含量显著升高、组织纤溶酶原激活物抑制剂1含量显著降低；该结果表明，在两个绝对大气压的氧压下实验动物血凝系统被抑制，抗凝血系统激活，血液中纤溶蛋白活性升高，并且此变化在减压可持续数天，是机体对血管内壁上一过性血栓形成的一种保护性反应[10]。其机制为：①高压氧迅速改善缺氧组织的氧供，促进有氧氧化，保护了线粒体功能，促进了能量生成，加速了血管内皮功能的恢复。②由于能量供应改善，细胞膜上的离子泵得以保护，抑制了钙离子内流，进一步减轻了内皮损伤。③高压氧干预后可迅速影响特异核苷酸的表达从而促进血管内皮细胞产生组织纤溶酶原激活物和组织纤溶酶原激活物抑制剂1 [11]。由于血液凝固系统被有效抑制，纤溶系统激活，利于血栓溶解，使微循环明显改善，从而增加局部灌流量，减轻无复流现象，减轻了缺血再灌注损伤[12-13]。但再灌注后0，4 h两个时点组织纤溶酶原激活物抑制剂1显著升高，组织纤溶酶原激活物含量显著降低；其机制可能为再灌注初期高压氧干预所造成的缩血管效应引起血压升高，导致血管内皮机械性损伤，二者由损伤的内皮释放入血，由于前者活性增加更明显，中和了后者，使其活性反而更低，因而血液凝固性增高，纤溶活性下降；24，72 h两个时点未出现反常的原因可能为此时肢体已发生较显著再灌注损伤，高压氧缩血管效应引起血压升高的作用较弱。
3.3 高压氧对炎性因子的作用大量研究证实，炎症反应介导了肢体再灌注损伤，而中性粒细胞的聚集和浸润及白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8等大量炎性因子的释放是炎症反应发生、发展的关键[14]。白细胞介素1由激活的单核巨噬细胞产生，可激活T淋巴辅助细胞及促发多种体内全身炎性反应如发热、血管阻力减低、毛细血管通透性增加等。Benson等[15]发现高压氧可抑制单核巨噬细胞产生白细胞介素1而减轻全身炎症反应；白细胞介素6为巨嗜细胞所分泌，可增强炎性反应，破坏细胞连接，增加血管内皮通透性；在缺氧过程中可使免疫系统过度加强，造成组织进一步损伤。Yamashita 等[16]证实高压氧可显著抑制白细胞介素6的产生，唐杭军等[17]亦指出高压氧治疗在脑梗死急性期可快速降低白细胞介素6，减轻炎性反应，保护神经细胞。白细胞介素8产生于单核细胞、内皮细胞等，再灌注损伤早期由于机体过度应激、组织缺血缺氧，刺激内皮细胞、单核巨噬细胞导致白细胞介素8升高。白细胞介素8可促使中性粒细胞活化，产生氧自由基和蛋白水解酶，导致细胞结构和功能的破坏；同时可介导中性粒细胞聚集和活化导致肺脑等远隔脏器的损伤。吕仁荣等[18]研究发现高压氧可改善烧伤后组织器官的缺血缺氧，可在一定程度上减少机体白细胞介素8的产生。
本实验应用高压氧治疗后，在再灌注后4，24，72 h 3个时点白细胞介素1含量降低；在再灌注后24 h和72 h两个时点白细胞介素6、白细胞介素8含量显著降低 ( P < 0.05)。说明在再灌注损伤初期应用高压氧干预可使炎性因子白细胞介素1下降，再灌注损伤24 h后白细胞介素6、白细胞介素8可产生较显著的下降,有力证实炎症反应被有效抑制。其机制可能为高压氧可有效抑制中性粒细胞功能及血管内皮黏附分子的表达，从而减少炎性因子释放和炎性细胞的聚集，改善局部缺血状态，减轻脂质过氧化，抑制过度炎症反应[19-20]。但再灌注后0 h和4 h两个时点白细胞介素6、白细胞介素8出现显著升高，其机制尚未完全明确，推断与再灌注早期高压氧缩血管效应刺激单核巨噬细胞有关。

本实验应用高压氧作用于实验大鼠不同时相的缺血再灌注肢体，有效抑制了炎症因子激活释放，促进了纤溶系统激活，对缺血再灌注肢体的结构功能产生了较显著的保护作用。因而，在今后的临床工作中，对肢体缺血再灌注损伤的治疗中早期应用高压氧对促进损伤组织的再生，加速患者的康复，减少其并发症的发生，降低其临床死亡率将会大有帮助。

1 Bonheur JA, Albadawi H, Patton GM, et al. A noninvasive murine model of hindlimb ischemia-reperfusioninjury. J Surg Res 2004;116:55-63
2 Qin Z, Karabiyikoglu M, Hua Y, et al. Hyperbaric oxygen-induced attenuation of hemorrhagic transformation after experimental focal transient cerebral ischemia. Stroke 2007; 38(4):1362-1367
3 Zhao XX,Jiang H. Hyperbaric oxygen therapy for promoting the Intellectual rehabilitation of Infants with severe hpoxic-ischemic encephalopathy. Neural regeneration research 2007;2(10):629-632
4 Zhou ZF,Xie P,Mu J,et al.Zhongqing Yike Daxue Xuebao 2004,29(2): 138-140
周泽芳,谢鹏,牟君,等.高压氧对大鼠局灶性脑缺血/再灌注脑线粒体能量代谢的影响[J].重庆医科大学学报,2004,29(2):138-140
5 Magdi M IY,Denis WH,Aires AB,et al.Lower limb ischemia- reperfusion injury triggers a systemic inflammatory response and multiple organ dysfunction．World J Surg 2002;26; 115-121
6 Chen L,Shen B,Jin KK,et al.Zhongyiyao Xuekan 2006,24(6):1040-1042
陈雷,沈斌,金可可,等.肢体缺血再灌注家兔凝血和纤溶系统的变化及葛根素的干预[J].中医药学刊,2006,24(6):1040-1042
7 Cai JH,Liu WY,Yi DH,et al.Zhonghua Chuangshang Zazhi 1997;13: 345-348
蔡建辉,刘维永,易定华,等．重度心肌挫伤早期血栓前状态的实验研究[J].中华创伤杂志,1997,13:345-348
8 Imperatore F,Cuzzocrea S,De Lucia D,et al.Hyperbaric oxygen therapy prevents coagulation disorders in an experimental model of multiple organ failure syndrome. Intensive Care Med 2006; 32(11): 1881-1888
9 Li Y,Han T,Yao ZW,et al.Zhonghua Hanghai Yixue yu Gaoqiya Yixue Zazhi 2003,10(1):42-45
李雁,韩涛,姚祖武,等.高压氧对血管内皮细胞损伤大鼠纤溶系统和血小板的影响[J].中华航海医学与高气压医学杂志,2003,10(1):42-45
10 Horrevoets AJG. Plasminogen activator inhibitor-1: in vitro activities and clinical relevance. Br J Haematol 2004;125:12-23
11 Tjarnstrom J,Holmdahl L,Arnell P,et al. Treatment with hyperbaric oxygen affects endothelial cell fibrinolysis. Eur J Surg 1999 ; 165(9): 834-838
12 Tsuboi H, Naito Y, Katada K. Role of the thrombin/protease-activated receptor 1 pathway in intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007;292(2):G678-683
13 Dobrovolsky AB, Titaeva EV. The fibrinolysis system: regulation of activity and physiologic functions of its main components. Biochemistry 2002;67:116-126
14 Zhang Z,Chen J,Yao J,et al.Jiangsu Yiyao 2005,31(7):515-516
张忠,陈瑾,姚菊,等.炎性介质在肢体缺血再灌注时的表达和临床意义[J]江苏医药,2005,31(7):515-516
15 Benson RM,Minter LM,Osborne BA,et al.Hyperbaric oxygen inhibits stimulus-induced proinflammatory cytokine synthesis by human blood-derived monocyte-macrophages. Clin Exp Immunol 2003; 134(1): 57-62
16 Yamashita M, Yamashita M. Hyperbaric oxygen treatment attenuates cytokine induction after massive hemorrhage. Am J Physiol Endocrinol Metab 2000; 278(5): E811-816
17 Tang HJ,Li SC.Yixue Linchuang Yanjiu 2006;23(6):964-965
唐杭军,李顺池.高压氧治疗对急性脑梗死患者血清中hsCRP及IL-6的影响[J].医学临床研究,2006,23(6):964-965
18 Lv RR,Huo R,Wang MQ.Shandong Yiyao 2005;45(36):53-54
吕仁荣,霍然,王明青.高压氧治疗对严重烧伤患者血浆IL-8水平的影响[J].山东医药,2005,45(36):53-54
19 Bertoletto PR, Chaves JC, Fagundes AT.Effect of different periods of hyperbaric oxygen on ischemia-reperfusion injury of rat small bowel. Acta Cir Bras 2008;23(1):11-15
20 Kihara K, Ueno S, Sakoda M.Effects of hyperbaric oxygen exposure on experimental hepatic ischemia reperfusion injury: relationship between its timing and neutrophil sequestration. Liver Transpl 2005;11(12):1574-1580