表达hVEGF121/EGFP融合蛋白骨髓间充质干细胞的制备及缺氧干预*☆

王耀晟1，王伶2，杨人强1，程晓曙1

课题背景：课题名称“转基因联合自体骨髓干细胞移植治疗严重缺血性心脏病”，受到江西省科技攻关计划重点项目资助，主要研究开发内容为评价VEGF转基因联合自体骨髓干细胞移植治疗严重缺血性心脏病。简要技术路线：构建携带VEGF编码基因的真核表达质粒并转染骨髓干细胞；建立慢性缺血性心脏病动物模型，冠脉内注入法移植转VEGF基因的干细胞；超声心动图、SPECT、心肌酶谱和心脏病理检测等评价疗效。目前已完成携带VEGF编码基因的真核表达质粒构建，并转染了骨髓干细胞，已进入动物实验及临床试验准备。应用要点：①成功构建了携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因的人类VEGF121真核表达质粒pEGFP-N2-hVEGF121。②用pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染骨髓间充质干细胞，在骨髓间充质干细胞中获得hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。③证实了表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在一定的时间内（< 24 h）耐受缺氧环境，获得较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的VEGF表达。偏倚或不足：①仅对体外模拟缺氧后转染pEGFP-N2-hVEGF121质粒骨髓间充质干细胞的VEGF mRNA表达水平进行了初步检测，对具体的蛋白分泌情况尚须进一步探讨。②hVEGF121/EGFP融合蛋白是否能保留天然VEGF121的生物学功能，尤其能否保留其成血管功能，有待深入探讨。③将pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染入骨髓间充质干细胞以表达hVEGF121/EGFP融合蛋白是否会影响其生物学特性，还有待深入观察。④表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能否在急性缺氧微环境下维持有效的VEGF表达，并发挥其治疗效应，还应在活体心肌梗死动物模型甚至人体中进行深入探讨。

应用要点：①成功构建了携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因的人类VEGF121真核表达质粒pEGFP-N2-hVEGF121。②用pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染骨髓间充质干细胞，在骨髓间充质干细胞中获得hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。③证实了表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在一定的时间内（< 24 h）耐受缺氧环境，获得较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的VEGF表达。

偏倚或不足：①仅对体外模拟缺氧后转染pEGFP-N2-hVEGF121质粒骨髓间充质干细胞的VEGF mRNA表达水平进行了初步检测，对具体的蛋白分泌情况尚须进一步探讨。②hVEGF121/EGFP融合蛋白是否能保留天然VEGF121的生物学功能，尤其能否保留其成血管功能，有待深入探讨。③将pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染入骨髓间充质干细胞以表达hVEGF121/EGFP融合蛋白是否会影响其生物学特性，还有待深入观察。④表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能否在急性缺氧微环境下维持有效的VEGF表达，并发挥其治疗效应，还应在活体心肌梗死动物模型甚至人体中进行深入探讨。

南昌大学第二附属医院，1心血管内科，2检验科，江西省南昌市 330006

王耀晟☆，男，1982年生，江西省景德镇人，汉族，南昌大学在读博士，主要从事冠心病治疗方面的研究。
calvinwait@
sohu.com

通讯作者：程晓曙，博士，教授，主任医师，博士生导师，南昌大学第二附属医院心血管内科，江西省南昌市 330006

摘要
目的: 构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的人血管内皮细胞生长因子121的真核质粒，检测所制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮细胞生长因子的水平。
方法：设计携带酶切位点的扩增引物，通过PCR技术扩增人血管内皮细胞生长因子121编码基因全序列，以粘端连接克隆法将其编码片段定向连接入质粒载体pEGFP-N2的多克隆位点中，构建pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒，采用酶切法、PCR以及DNA序列测定法鉴定所构建的重组质粒。全骨髓差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，体外扩增传代，通过形态学观察及表面标记物进行细胞鉴定。通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染体外培养的骨髓间充质干细胞，使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。将制备好的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞在体外缺氧环境下分别培养6，12，24 h，另设相同缺氧干预下的空白骨髓间充质干细胞组，以转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组作为对照，采用RT-PCR法检测血管内皮生长因子mRNA的表达量。
结果：酶切鉴定法、PCR鉴定法、DNA序列测定皆证实pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功。使用pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染骨髓间充质干细胞后，荧光显微镜检测提示hVEGF121/EGFP蛋白在骨髓间充质干细胞中存在表达。在体外模拟心肌缺氧的环境下分别培养6，12，24 h后，RT-PCR检测示转染重组质粒的骨髓间充质干细胞组各时间段缺氧后的血管内皮生长因子mRNA表达量均高于对照组（P < 0.01），且不同时间段间差异无显著性意义（P > 0.05）；空白骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达量随缺氧时程的延长而增加。
结论：①成功构建携带人VEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒，并在骨髓间充质干细胞中获得表达。②证实表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能在24 h以内的不同时长缺氧下，维持较空白骨髓间充质干细胞更强、更稳定的血管内皮生长因子表达。
关键词：血管内皮细胞生长因子；骨髓间充质干细胞；绿色荧光蛋白；真核表达质粒；缺氧

王耀晟，王伶，杨人强，程晓曙.表达hVEGF121/EGFP融合蛋白骨髓间充质干细胞的制备及缺氧干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4001-4006 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4001(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)21-04001-06

Preparation of bone marrow mesenchymal stem cells expressing hVEGF121/EGFP fusion protein and hypoxia intervertion

AIM:AIM: To construct human vascular endothelial growth factor121 (hVEGF121) eukaryotic plasmid that contains enhanced green fluorescent protein (EGFP) report gene, and to investigate the VEGF expression of hVEGF121/EGFP-expressing bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) after different time courses of hypoxic culture.
METHODS: We designed the total length amplification primer of hVEGF121 with restriction endonuclease cutting sites, amplified the coding fragment of hVEGF121 by polymerase chain reaction (PCR), ligated the hVEGF121 coding fragment directly into multiple clone site (MCS) of pEGFP-N2 by sticky ends ligating clone method. Then, the recombinant plasmid-pEGFP-N2-hVEGF121 was constructed. Recombinant was identified by digestion, PCR, DNA sequencing technology. BMSCs were isolated by whole bone marrow differential attachment method, and then in vitro passaged several times. Cells were identified according to morphology and surface markers analysis. BMSCs were transfected with pEGFP-N2-hVEGF121 by positive ionic liposome transfection method. Under fluorescent microscope, the expression of hVEGF121/EGFP fusion protein was detected. The hVEGF121/EGFP-expressing BMSCs were cultured under hypoxic condition for 6, 12, 24 hours. Control group was blank BMSCs and BMSCs transfected with blank vector-pEGFP-N2 under the same hypoxic intervention. The VEGF mRNA expression of each group was detected by reserve transcription (RT)-PCR method.
RESULTS: Digestion, PCR and DNA sequencing completely confirmed that we constructed the plasmid pEGFP-N2- hVEGF121 successfully. The BMSCs, which transfected with pEGFP-N2-hVEGF121, was observed under the fluorescent microscope. After 6, 12, 24 hours' hypoxic culture which mimic the microenvironment of myocardial hypoxia in vitro, RT-PCR results showed that recombinant transfected BMSCs expressed higher levels of VEGF mRNA than control group (P < 0.01) after each time course of hypoxic culture, and there was no statistic differences among each time course (P > 0.05). The VEGF mRNA expression of control group was upgrading along with the prolongation of the hypoxic culture time.
CONCLUSION: This study successfully constructed human VEGF121/EGFP fusion protein expressed in BMSCs. Confirmed that hVEGF121/EGFP fusion protein-expressing BMSCs can endure adequate time of hypoxic environment in 24 hours, and sustain stronger and more stable VEGF expression.

Wang YS, Wang L, Yang RQ, Cheng XS. Preparation of bone marrow mesenchymal stem cells expressing hVEGF121/EGFP fusion protein and hypoxia intervertion.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4001-4006
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4001(ps).pdf]

骨髓间充质干细胞植入能通过多种途径改善梗死心脏的心功能及心肌供血[1-3]。血管内皮生长因子可促进血管新生，增加缺血心肌的灌注[4]。如向心肌梗死区移植转血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞，对于存活心肌将产生重要意义。但在心梗早期，梗死区缺氧严重，移植细胞植入后可能受到缺氧压力的影响而发生生物学特性的改变甚至凋亡[5-6]，且骨髓间充质干细胞在转染入血管内皮生长因子编码基因后，要对其进行表达，其代谢负担必然加重，从而更不易耐受缺氧压力。本实验拟制备高表达血管内皮生长因子蛋白的骨髓间充质干细胞，同时探讨所制备的转血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞能否在急性缺氧下维持有效的血管内皮生长因子表达。

设计：开放性实验。
单位：南昌大学第二附属医院心血管内科，检验科。
材料：实验于2005-09/2006-12在南昌大学第二附属医院分子医学实验中心完成。①动物：清洁级新西兰大耳白兔3只（南昌大学医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：JXA2004085），体质量（2.0±0.2）kg，雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂与仪器：含VEGF121编码基因的pCD2-VEGF121质粒菌株（由南昌大学第二附属医院消化科张吉翔教授惠赠）；载体质粒pEGFP-N2菌株（由南昌大学第二附属医院分子医学实验中心提供）；高效感受态细菌JM109（北京博大泰克公司）；酵母提取物、胰化蛋白胨、细菌培养用琼脂粉(英国Oxoid公司)；限制性核核酸内切酶XhoI、EcoRI、HincII及DL2000 marker(日本 TakaRa公司)；2×Taq PCR MasterMix（北京TIANWEI）；反转录酶M-MLV、Rnasin、dNTP、Oligo（DT）15、T4DNA连接酶(美国Promega公司)；Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；Wizard? SV凝胶及PCR纯化试剂盒、Wizard?质粒DNA提取试剂盒(美国Promega公司)；流式细胞仪（美国BD公司）；CO2恒温培养箱 (美国Forman Scientificn公司)；PTC-100型基因扩增仪 (美国MJ Research公司)。③引物：根据NHI Genebank中公布的hVEGF121 mRNA序列，使用引物设计软件Primer Premier5.0设计hVEGF121普通引物（Sense: 5’-TGC CTT GCT GCT CTA CCT-3’，Antisense: 5’-CTA TGT GCT GGC CTT GGT –3’）；结合载体质粒的多克隆位点设计设计正义引物5’端带有XhoI酶切位点，反义引物5’端带有EcoRI的hVEGF121片段PCR扩增引物(Sense: 5’- CCG CTC GAG ATG AAC TTT CTG CTG TC –3’，Antisense: 5’- TAT

GAA TTC CCG CCT CGGCTT GTC AC –3’)；查阅NHI Genebank获得GAPDH编码序列(No. NM_002046)，通过Primer Premier 5.0设计GAPDH引物（Sense: 5’ –TCC CAT CAC CAT CTT CCA G –3’，Antisense: 5’ –AGG AGT GGG TGT CGC TG –3’）作为内参照引物。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
设计、实施、评估者：实验设计为第三、四作者，资料收集与具体实施为第一、二作者，评估为第三作者，均受过专业训练，采用盲法评估。
方法：
pEGFP-N2-VEGF质粒的构建：构建目标是将去除终止密码TGA的hVEGF121编码片段插入pEGFP-N2的多克隆位点区中，以顺序表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的编码基因。选择将hVEGF121编码片段插入pEGFP-N2的多克隆位点区XhoI和EcoRI酶切位点之间。设计正义引物5’端带有XhoI酶切位点，反义引物5’端带有EcoRI酶切位点的hVEGF121片段PCR扩增引物，反义引物设计为不与终止密码TGA接合，使PCR产物不含终止密码。使用XhoI和EcoRI双酶切载体和PCR扩增后的目的片段，再通过DNA连接酶将切得片段进行连接，使hVEGF121片段定向插入pEGFP-N2的多克隆位点，构成pEGFP-N2-hVEGF121。
pEGFP-N2-hVEGF121质粒的鉴定：使用HincII酶切pEGFP-N2质粒，能将其切成883 bp和3 854 bp的两条片段；使用HincII酶切pEGFP-N2-VEGF121质粒，能将其切成883 bp和4 307 bp的两条片段，对比二者可鉴定目的片断是否成功插入载体他多克隆位点；使用hVEGF121普通引物对重组质粒行PCR鉴定；采用Sanger DNA测序法针对重组质粒上的hVEGF121编码片段进行双向测序。测序鉴定由北京Sunbiotech公司完成。
骨髓间充质干细胞的提取分离：于兔髂脊骨髓穿刺，抽取骨髓约5 mL，加入5 mL DMEM充分混匀。以 1 000 r/min离心8 min。留取沉淀，弃上清。加入含20% FBS的DMEM培养基约10 mL，轻轻吹打混匀，移入细胞培养瓶中。于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞孵育箱中静置培养48 h使其贴壁生长，胰蛋白酶消化传代。
骨髓间充质干细胞的鉴定：经传代贴壁法纯化后，细胞在倒置光学显微镜下观察，并制作苏木精-伊红染色细胞爬片观察细胞形态。骨髓间充质干细胞为梭型或多伪足型成纤维细胞样，贴壁生长[7]。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD34。其中CD29应为阳性，CD34应为阴性[8]。
pEGFP-N2-VEGF121质粒转染骨髓间充质干细胞及筛选：使用LipfectamineTM 2000转染试剂。转染前一二天，胰酶消化细胞，以2×105/孔接种于6孔板，加入常规培养基，待其生长汇合为孔底面积的90%，吸除旧培养液并轻微冲洗，分别向各孔加入2 mL含20%FBS但不含抗生素的DMEM培养基。将定量的质粒DNA（根据所测DNA浓度计算加样量）与Lipfectamine?2000阳离子脂质体混合物滴入。于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中孵育24 h。于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光后，改用含800 mg/L G418培养基培养，筛选2周。
缺氧环境下转hVEGF121/EGFP基因骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子表达：①缺氧模型的建立：模拟心肌梗死时心肌组织内的缺氧环境，建立体外模型。订制密闭容器，将需缺氧干预的细胞培养板置入，密闭并留入气/出气孔。用含95%N2和5%CO2的混合气体向容器内贯通充气，持续30 min，使容器内充满95% N2、5%CO2气体。密封入气/出气孔，将其移入37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中。如此培养一定时程是为相应时程的缺氧干预[2]。②实验分组：设立3组，分别为转染pEGFP-N2-hVEGF121质粒的骨髓间充质干细胞组、空白骨髓间充质干细胞组、转染空载pEGFP-N2质粒的骨髓间充质干细胞组。各组同时接受缺氧干预，分6，12，24 h三个时长。各组每次实验皆做复孔，实验重复3次。
血管内皮生长因子mRNA的表达RT-PCR检测：常规Trizol法提取总RNA。hVEGF121普通引物PCR反应条件：95 ℃ 5 min，30×（95℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min），72 ℃ 5 min，4 ℃浸泡。内参照GAPDH引物PCR反应条件：95 ℃ 5 min，30×（94 ℃ 40 s，52℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min），72 ℃ 5 min，4 ℃浸泡。以1.5%琼脂糖-TBE凝胶(0.5×TBE电泳缓冲液)电泳分离PCR 产物，参照DL-2000 Marker。
主要观察指标：①对本实验所构建的pEGFP-N2-hVEGF121质粒的酶切法、PCR法以及Sanger DNA测序法的鉴定结果。②对本实验提取分离的骨髓间充质干细胞形态及细胞表面标志物的鉴定结果。③转hVEGF121基因的骨髓间充质干细胞在不同时长缺氧后血管内皮生长因子的表达。
统计学方法：由第三作者采用SPSS 11.5软件进行统计处理，数据以_x±s表示，方差齐时应用方差分析，方差不齐时行秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义， P < 0.01为差异有极其显著性意义。

2.1 pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒的构建及鉴定
2.1.1 带有酶切位点的hVEGF121全长扩增引物PCR结果使用正义引物5’端带有XhoI酶切位点，反义引物5’端带有EcoRI的hVEGF121全长(不包括终止密码)扩增引物，针对pCD2-hVEGF121中的VEGF编码片段进行PCR扩增。PCR产物为5’端带有XhoI酶切位点，3’端带有EcoRI酶切位点的hVEGF121片段。进行凝胶电泳，紫外灯下对比Marker(DL2 000)示459 bp大小的条带，符合预期值，见图1。

2.1.2 pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒的酶切鉴定结果使用XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切构建的重组质粒，将酶切产物凝胶电泳，紫外灯下可见切下一小片段，对比DL2 000，符合预期值453 bp（hVEGF121编码片段大小），见图2a。使用HincII酶切构建的重组质粒，酶切产物凝胶电泳后紫外灯下可见一大一小两条条带，对比Marker和空载质粒酶切产物电泳条带，重组质粒的大片段(4 307 bp)大于空载质粒的大片段（3 854 bp），小片段均为883 bp，提示重组质粒已载有VEGF编码片段，见图2b。

2.1.3 pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒的PCR鉴定结果使用普通VEGF特异性部分扩增引物，对重组质粒中的VEGF基因片段进行PCR扩增，PCR产物凝胶电泳后在紫外灯下观察，见一明显条带，符合预计扩增长度317 bp，见图3。

2.1.4 DNA测序结果针对重组质粒hVEGF121编码序列的DNA双向测序结果完全符合hVEGF121序列图谱，至此确定pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒构建成功。
2.2 骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定结果全骨髓差数贴壁24 h后，培养瓶底出现贴壁细胞，见图4a。进一步生长后细胞成多伪足贴壁成纤维细胞样形态，见图4b。扩增培养后细胞成梭型旋涡状密集排列，见图4c。苏木精-伊红染色可显现明确的细胞形态，见图4d。流式细胞仪检测细胞表面标记物，CD29+、CD34-，符合骨髓间充质干细胞表面标记物特点，见图5。

2.3 转染骨髓间充质干细胞后绿色荧光蛋白的表达以pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染骨髓间充质干细胞（转染率40%左右），以空脂质体转染做空白对照，经G418筛选后，在倒置荧光显微镜下观察到明确的绿色荧光蛋白表达，见图6。

2.4 缺氧环境对转hVEGF121/EGFP基因骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达的影响在相同时长的缺氧培养下，转hVEGF121/EGFP基因骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子mRNA表达水平均高于转空载质粒骨髓间充质干细胞组、空白骨髓间充质干细胞对照组，差异有极其显著性意义（P < 0.01）。空白骨髓间充质干细胞对照组随缺氧时间的延长，其血管内皮生长因子mRNA表达水平逐步增强。转空载质粒骨髓间充质干细胞组和空白骨髓间充质干细胞对照组在相同的缺氧时间段，血管内皮生长因子mRNA表达水平相同，差异无显著性意义（P > 0.05）。具体数据见表1，电泳结果见图7。

近年来干细胞移植治疗心肌梗死的研究逐渐兴起，在各类用于移植的细胞中，骨髓间充质干细胞倍受关注，其具备多向分化能力，可分化为心肌样细胞[9]。且此种细胞易于分离提取，具有高度的体外扩增潜能，组织相容性好，同种异体间移植不易引起排异反应，同时不涉及伦理问题[3]，被认为是目前最适合用于细胞移植治疗心肌梗死的细胞种类。绝大多数将骨髓间充质干细胞移植入缺血梗死心肌组织的研究发现，其可能通过多种途径改善心功能及心肌供血状况[10-13]，因此把骨髓间充质干细胞作为细胞载体向心肌梗死区投送治疗干预成为可能。
在众多的血管生成因子中，血管内皮细胞生长因子是目前研究最为深入的血管生成因子之一，很多实验已证实其能十分有效地诱导缺血心肌内侧支小血管生成，以恢复心肌血液灌流[14]。由于转录后mRNA的不同剪切方式，血管内皮细胞生长因子蛋白有多种异构体，其中血管内皮细胞生长因子121为可溶性，能分泌至细胞外发挥作用，且生物学作用最强[15]。
本实验构建的pEGFP-N2-hVEGF121质粒有其特殊性。由于载体质粒pEGFP-N2中增强型绿色荧光蛋白的编码序列在其多克隆位点的下游，在设计带有酶切位点的hVEGF121 PCR扩增引物时，将反义引物设计为不与人血管内皮细胞生长因子121编码序列的终止密码TGA接合，以求扩增出的hVEGF121 cDNA不含终止子，故将其插入pEGFP-N2的多克隆位点，能在表达人血管内皮细胞生长因子121之后，再顺5’~3’方向表达出下游的增强型绿色荧光蛋白。如此表达产物为hVEGF121/EGFP融合蛋白，而不是常见的目的序列片段和绿色荧光蛋白序列各自分开表达。故使用本实验构建的pEGFP-N2-hVEGF121质粒转染骨髓间充质干细胞后，在倒置荧光显微镜下显示绿色荧光，则间接证明了hVEGF121/EGFP融合蛋白的表达。在pEGFP-N2-hVEGF121质粒中，绿色荧光蛋白编码序列作为hVEGF121基因 3’端的报告基因，其表达能够实时报告hVEGF121的表达。通过对绿色荧光的观察，可以了解hVEGF121基因转录发生的时间、组织分布并评价其表达丰度。借助荧光显微镜等设备对表达增强型绿色荧光蛋白的活细胞进行非侵入性监测和分析。
需要注意的是，融合在hVEGF121蛋白上的EGFP蛋白极有可能对其生物学功能带来影响。因此hVEGF121/EGFP融合蛋白能否保留VEGF121的生物学功能，尤其是能否保留其成血管功能，是一个有待深入探讨的问题。此外，用于移植治疗的骨髓间充质干细胞要发挥其多向分化、整合修复以及旁分泌因子等治疗效应，就必须保持其细胞生物学特性。目前虽然已有许多将外源性基因导入骨髓间充质干细胞的实验[16-17]，但是关于导入的外源性基因对骨髓间充质干细胞特性有何影响，是否会影响其治疗功效或带来负面作用仍不明确。有研究报道，转染了EGFP基因的骨髓间充质干细胞在正常表达EGFP的情况下，其自身的多向分化潜能并未受到影响[18]。本实验将pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒转染入骨髓间充质干细胞以表达hVEGF121/EGFP融合蛋白，光镜下骨髓间充质干细胞的形态未见改变，但转染是否会影响其具体生物学特性，还有待深入研究。
只要hVEGF121/EGFP融合蛋白能够正常发挥出EGFP和VEGF121的生物学功能而又不对骨髓间充质干细胞特性产生负面影响，就可以将本实验制备的表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞移植入缺血梗死心肌组织，以获得协同治疗效应，即通过VEGF在缺血心肌组织内的成新生血管效应缓解心肌低灌流状态，在为受者心肌细胞提供血氧供应的同时，也能为植入的骨髓间充质干细胞营造血氧充足的生长环境，提高其存活增殖能力，从而更好地以各种形式发挥修复心肌组织的作用。同时，骨髓间充质干细胞本身对新生微血管的形成就有重要意义[1-3]。
任何用于移植治疗心肌梗死的细胞，在植入缺血梗死心肌组织时首先要面临的是缺氧压力。有观点认为，在心梗早期将细胞移植入心肌，植入细胞将无法耐受心肌组织内的缺氧压力，导致活力下降或死亡而无法发挥其治疗效应[19]。对于转染了外源基因的细胞，其代谢负担加重，更不易耐受缺氧压力，可能在植入心肌梗死区后很短时间内就面临死亡，根本无法发挥预期的治疗功效。目前未见针对以上情况进行探讨的实验报道。本实验使用体外模拟心肌缺氧的培养装置，对表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞及空白骨髓间充质干细胞进行不同时长的缺氧干预，以RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达量，以反映VEGF表达水平。本实验发现至少在短期(24 h)内，表达hVEGF121/EGFP融合蛋白的骨髓间充质干细胞能够在缺氧环境下保持比空白骨髓间充质干细胞高的VEGF表达水平，且在不同的缺氧时程下无明显差别。目前认为，在心肌梗死发生后12~24 h内，侧支微血管在梗死区周围形成并深入梗死区供血[20]，可以使梗死区部分尚未完全死亡的心肌细胞得以存活[21]。故此时间段可被视为建立心肌梗死区侧支微循环、恢复心肌供血供氧的关键时间段，期间如能及时给予治疗干预，将对抢救缺血心肌有重要意义。
致谢：感谢南昌大学第二附属医院分子医学实验中心全体老师对本实验的支持。

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