课题背景：重庆市卫生局医学科技计划资助项目：基因修饰骨髓间充质干细胞创面移植预防增生性瘢痕的实验研究（06-165）。课题前期已成功采用AdEasy-1腺病毒载体系统，通过分子生物学方法构建了含人TGF-β3c2s2目的基因的重组腺病毒载体，获得高滴度的TGF-β3c2s2重组腺病毒。本文以重组腺病毒为载体，用TGF-β3c2s2基因修饰的骨髓间充质干细胞进行创面移植进一步研究其对增生性瘢痕的作用。

相关链接：随着医学材料、组织工程学和干细胞等方面研究的不断深入，加速创面的愈合有了多种新的策略，但创面愈合后胶原过度沉积、增生性瘢痕的形成仍是需要进一步解决的问题。寻求更为有效的能够促进创面愈合、减少病理性瘢痕形成的方法，一直是国内外科研及临床工作者努力的方向。基因治疗和细胞替代治疗是近年来医学领域乃至生命科学领域研究的热点和前沿。重组腺病毒载体是一种能高效转移并表达外源基因的载体系统，所携带的目的基因在宿主细胞内可获得短时大量表达，极适合于具有明确阶段性创伤的愈合和增生性瘢痕的治疗，骨髓间充质干细胞在体内外能有效表达各种治疗性目的基因，所以又被认为是一种基因治疗的靶细胞。在创伤愈合的研究中发现，骨髓间充质干细胞进行创面局部移植能促进创面的愈合。

创新要点：①尽管有较多的干细胞移植及基因转染作为促进创面修复的新方法的文献报道，但严重创伤和深度烧伤的创面愈合后仍然存在较严重的病理性瘢痕。本文采用基因转染骨髓间充质干细胞创面移植的方法，在促进创面修复同时提高减轻病理性瘢痕的基因治疗鲜见报道。②本文结果显示，骨髓间充质干细胞体内诱导分化及表达转化生长因子β３蛋白，对创面修复过程中转化生长因子β１和转化生长因子β3表达有着显著的影响，通过这种影响可能减轻创面修复后增生性瘢痕的形成，为创伤修复早期干预性防治增生性瘢痕的细胞移植和基因治疗提供理论与动物实验基础。

1重庆医科大学儿童医院整形外科，重庆市 400014；2重庆医科大学普外科，重庆市 400014；3 英国曼彻斯特大学心血管中心，Manchester M13 9NT UK；4 重庆医科大学儿科学院，重庆市 400014

邱 林☆，女，1968年生，重庆市人，汉族，2006年重庆医科大学毕业，博士，副教授，副主任医师，主要从事瘢痕预防、治疗的组织工程研究。
qiulin118@
gmail.com

重庆市卫生局医学科技计划资助项目（06-165）*

摘要

目的：外伤后病理性瘢痕的形成与创面的愈合过程有着密切的联系，创伤愈合时期引入细胞因子或生长因子及其他影响因素，调节创伤愈合机制，即可能改变细胞外基质结构，达到预防瘢痕形成的目的。实验拟观察TGF-β３c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞在创面修复与重塑过程中对转化生长因子β1和转化生长因子β3表达的影响。
方法：实验于2005-10/2007-03年在重庆医科大学附属儿童医院外科实验室、动物实验中心完成。①实验材料：四五周龄日本大耳白兔2只，体质量300~400 g，雌雄不限；健康成年日本大耳白兔20只，体质量1.7~2.5 kg，雌雄不限，均由重庆医科大学动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选取四五周龄日本大耳白兔分离培养骨髓间充质干细胞。选取健康成年日本大耳白兔20只，每只兔耳腹侧制作2个皮肤、软骨全层缺损创面共80个，创面以自身对照为前提随机分为4组，每组20个创面：实验组：加入Ad-TGF-β3c2s2转染的骨髓间充质干细胞；空白对照组：加入消毒的DMEM/F12（不含胎牛血清）；腺病毒组：加入Ad-TGF-β3c2s2腺病毒；骨髓间充质干细胞组：加入骨髓间充质干细胞。③实验评估：观察瘢痕形成情况，苏木精-伊红染色、免疫组织化学技术观察瘢痕组织的组织学形态和检测瘢痕组织中转化生长因子β1和转化生长因子β3表达和变化规律。
结果：①实验组在整个过程中无明显高出周围皮肤的瘢痕形成，其他组上皮化后，创面均逐渐形成不同程度的瘢痕，伤后 45 d 瘢痕增生程度达高峰，明显高出皮肤表面；持续至90 d左右。②实验组和腺病毒组结构较接近正常皮肤，比正常皮肤胶原排列致密，略厚；空白对照组、骨髓间充质干细胞组伤后45 d可见浅层组织结构排列紊乱，胶原纤维粗大呈交错网织状排列。③实验组伤后21，45，90 d转化生长因子β1表达明显低于其他组和正常皮肤（P < 0.01），其表达随时间逐渐下降，转化生长因子β3表达高于其他组和正常皮肤（P < 0.01），各组转化生长因子β3的表达随时间逐渐下降。
结论：TGF-β3c2s2基因转染的骨髓间充质干细胞移植于局部创面，对创面修复过程中转化生长因子β１和转化生长因子β3表达有显著影响，通过这种影响减轻创面修复后增生性瘢痕的形成。
关键词：骨髓间充质干细胞；基因转染；转化生长因子β

邱林，金先庆，Paul A Kingston，罗小辑，丁幸坡.TGF-β3 c2s2基因转染骨髓间充质干细胞对创面愈合中转化生长因子β表达的影响及意义[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4012-4016
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4016(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04012-05

收稿日期：2007-10-26
修回日期：2007-12-04
(07-50-11-6331/GW·Q)

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells with TGF-β3c2s2 gene on the expressions of transforming growth factor beta in wound healing

Abstract

AIM:Forming of pathological scar is associated with wound healing after trauma. Cytokine, growth factor or other influential factors can prevent scar forming by regulating wound healing and adjusting extracellular matrix. The study investigated effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) with TGF-β3c2s2 gene on the reparation and reconstruction of wound by detecting expressions of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and TGF-β3.
METHODS: Experiments were conducted in Surgical Laboratory and Center of Animal Experiment, Children's Hospital, Chongqing Medical University from October 2005 to March 2007. Two Japanese flap-eared rabbits aged 4-5 weeks (300-400 g) and twenty healthy adult Japanese flap-eared rabbits (1.7-2.5 kg), irrespective of gender, were provided by Center of Animal Experiment, Chongqing Medical University. Animal intervention was accorded with the animal ethical standards. BMSCs were collected from Japanese flap-eared rabbits aged 4-5 weeks. Eighty wounds were generated on the gastroside of the ear of 20 healthy adult Japanese flap-eared rabbits, and were randomized into four groups in every rabbit. Wounds in the experimental group were treated with Ad-TGF-β3c2s2-transfected BMSCs. Wounds in the blank control group were treated with sterile DMEM/F12 (without fetal bovine serum). Wounds in the adenovirus group were treated with Ad-TGF-β3c2s2. Wounds in the BMSCs group were treated with BMSCs. Forming of scar was observed. Histology of scar was observed by hematoxylin-eosin staining. Expressions of TGF-β1 and TGF-β3 were detected by immunohistochemical method.
RESULTS: There was no prominence scar formed in the experimental group during the whole procedure. The wound of each control group gradually formed the different degree scars after epithelization. The hyperplasty of scars reached peak on 45 days after wounding and lasted about 90 days. The structure of the scars of the experimental group and the adenovirus group were similar to normal skin, but more dense and thick than normal skin. Disorder structure and overlapping arrangement, enlargement collagen fibers were showed in the scars of the blank control group and the BMSCs group at day 45. Expression of TGF-β1 protein in experimental group was decreased than other groups and normal skin at days 21, 45 and 90 (P < 0.01), and reduced over time. But expression of TGF-β3 was increased than other groups and normal skin (P < 0.01) at days 21, 45 and 90, and reduced over time.
CONCLUSION: BMSCs with TGF-β3c2s2 gene transplantation into wound can inhibit the forming of hypertrophic scar by affecting expressions of TGF-β1 and TGF-β3.

Qiu L, Jin XQ, Paul A Kingston, Luo XJ, Ding XP.Effects of bone marrow mesenchymal stem cells with TGF-β3c2s2 gene on the expressions of transforming growth factor beta in wound healing.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4012-4116(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4012(ps).pdf]

0 引言

转化生长因子β是创伤愈合过程中重要的调控因子，其中一种亚型转化生长因子β1通过作用于靶细胞-成纤维细胞合成大量的I、III型胶原等多种细胞外基质促进创伤愈合，但当其表达过度时，引起I型胶原为主的细胞外基质过度沉积导致增生性瘢痕形成。而另一亚型转化生长因子β3通过与转化生长因子β1竞争TβRII拮抗转化生长因子β1作用，从而减轻伤口愈合后瘢痕、增加瘢痕的弹性。

1 材料和方法

设计：以动物为观察对象的随机及自身对照实验。
单位：重庆医科大学儿科研究所外科实验室、动物实验中心。
材料：实验于2005-10/2007-03在重庆医科大学儿科研究所外科实验室、动物实验中心完成。四五周龄日本大耳白兔2只，体质量300~400 g，雌雄不限；健康成年日本大耳白兔20只，体质量1.7~2.5 kg，雌雄不限，均由重庆医科大学动物实验中心提供（合格证[syxk(渝)20040001]）。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。鼠抗TGF-β1抗体、鼠抗TGF-β3抗体（购自武汉博士德公司）。通抗9000、DAB显色系统（购自北京中山生物技术有限公司）；SP免疫组织化学试剂盒（购自福州迈新生物技术有限公司）。
设计、实施、评估者：设计、实施由第一作者完成。实验评估由全部作者共同完成，作者均受过正规培训。
干预措施：
选取四五周龄日本大耳白兔分离培养骨髓间充质干细胞，并采用TGF-β3c2s2基因转染骨髓间充质干细胞[1]。
转染TGF-β3 c2s2基因的骨髓间充质干细胞悬液及Ad-TGF-β3 c2s2的制备：经培养第3代备用骨髓间充质干细胞融合程度达60%~80%时，细胞移植前 72 h，经Ad-TGF-β3 c2s2在150感染复数下转染，移植当天用0.25%胰酶室温下消化、离心，调整细胞浓度为1×108 L-1，同上方法备用。骨髓间充质干细胞悬液为第3代骨髓间充质干细胞，细胞浓度同时上。纯化、浓缩的Ad-TGF-β3 c2s2颗粒用DMEM/F12（不含胎牛血清）稀释为1× 108 pfu/mL。空白对照液为消毒的DMEM/F12（不含胎牛血清）。
实验动物模型制备和分组：将实验兔按 0.2 mL/kg剂量的速眠新，臀部肌肉注射麻醉后，在兔耳腹侧中央画出两个2 cm×2 cm大小的正方形(两正方形相距 1 cm），兔耳经消毒铺巾，沿标记线直视下轻轻切开耳软骨（兔耳软骨菲薄，防止切穿


背面皮肤），完全切开四边的腹侧皮肤和软骨后，剥离整个创面的皮肤和软骨。创面以自身对照为前提随机分为4个组，每组共20个创面，分别是实验组（Ad-TGF-β3c2s2转染骨髓间充质干细胞组），空白对照组、腺病毒组、骨髓间充质干细胞组。分别在4组已止血的创面上，用加样枪滴加上相应的实验、对照液各200 μL（滴加的液体勿超过创面边沿），待滴加液体稍干后，分别用2 cm×2 cm的小张油纱直接覆盖创面，用弹力胶带固定。
观察指标：大体标本观察：各组从伤后第2天观察并记录创面愈合过程和瘢痕生长过程的色泽、质地、大小、增生退化情况。分别在21，45，90 d各组同时取材(每组3个创面），未取材实验动物继续观察至术后90 d。
组织形态学观察：在不同时间点取材的标本分别用10%中性甲醛固定24 h后，分别用70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水至透明，二甲苯（2次），浸蜡（3 h更换3次石蜡），石蜡包埋，连续切片，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色，光镜下观察45 d兔耳瘢痕组织学形态。
免疫组织化学染色观察：选用伤后第21，45，90天的4组和正常皮肤的石蜡切片，采用链霉素抗生物素（SP）法：瘢痕组织石蜡切片脱蜡至水，微波炉煮沸抗原修复，非免疫性动物血清封闭液37 ℃、10 min；分别滴加TGF-β1、TGF-β3一抗，室温2 h；生物素标记的二抗, 室温10 min；链亲和素-过氧化物酶溶液10~15 min；DAB显色，光学显微镜下观察；苏木精复染、脱水、透明、中性树胶封固。以PBS液代替一抗作阴性对照。检测转化生长因子β1和转化生长因子β3表达的分布情况和相对数量，计算方式为：组织切片转化生长因子β1、转化生长因子β3的免疫组织化学使用平均阳性细胞数所占的百分比表示。每张切片（镜下400倍）随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞中阳性表达的细胞数，算出其百分比，取平均数，用公式表示：阳性细胞数（%）=（阳性表达细胞数/所测细胞总数）×100%。
主要观察指标：①免疫组织化学染色TGF-β1和TGF-β3的相对定量分析。②大体标本和组织形态学观察。
统计学方法：统计学处理由重庆医科大学统计教研室完成。所获资料用SAS 9.0 统计软件作统计处理。所有数据以_x±s表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验动物在术后完全成活，但因分别在21，45，90 d各组同时取材（每组3个创面）后，影响瘢痕最终的观察，故取材动物终止使用，每组动物随机取材3例，至最后观察时间90 d也为3例。
2.2 各组瘢痕形成大体标本观察 除实验组外，其他3组上皮化后创面均逐渐形成不同程度的瘢痕增生块，其增生范围不超过原创缘，上皮化后20~25 d瘢痕增生程度达高峰，明显高出皮肤表面；实验组上皮化创面轻度收缩，硬度比周围正常皮肤略高，愈合创面不高出皮肤表面，其他3组增生硬块到60 d左右，部分开始变软，观察至90 d，大部分瘢痕仍然存在，较前明显变软、颜色接近周围正常皮肤。实验组在整个过程中无明显高出周围皮肤的瘢痕增生块形成。
2.3 各组苏木精-伊红组织形态学观察 正常皮肤可见浅层真皮疏松，排列较整齐。空白对照组和骨髓间充质干细胞组伤后45 d可见浅层组织结构排列紊乱，胶原纤维粗大，呈交错网织状排列或旋涡状，胶原有较多的成纤维细胞，表皮较厚；腺病毒组和实验组结构较接近正常皮肤，比正常皮肤的胶原排列致密，表皮较空白对照组和骨髓间充质干细胞组薄,但腺病毒组的瘢痕厚度明显厚于实验组。
2.4 各组免疫组织化学染色观察和定量分析 转化生长因子β1免疫组织化学染色：伤后45 d除实验组外，其他3组瘢痕切片中可见较多的转化生长因子β1阳性颗粒表达，阳性颗粒呈棕黄色，棕黄色阳性颗粒粗大，多数为位于成纤维细胞浆胞内，细胞间质内也有少量散在的阳性颗粒。阳性细胞主要分布在胶原结节内，表皮下也可见较多的阳性细胞，见图1。

实验组愈合创面后期（伤后90 d）转化生长因子β1的表达明显减少。正常皮肤组织切片的转化生长因子β1阳性染色细胞极少。转化生长因子β3免疫组织化学染色：伤后45 d除实验组外，其他3组瘢痕切片中转化生长因子β3阳性颗粒表达明显少于转化生长因子β1，阳性颗粒呈棕黄色，部位分布与转化生长因子β1相似，见图2~6。实验组愈合创面早期（伤后21 d）转化生长因子β3的表达明显增多，以后呈逐渐下降。正常皮肤组织切片的转化生长因子β3阳性染色细胞较少。

免疫组织化学定量分析：见表1，2。

3 讨论

转化生长因子β在病理性瘢痕(增生性瘢痕、瘢痕疙瘩)的形成中扮演着相当重要的角色[2-3]。分为3个亚类，其中转化生长因子β1是创伤愈合过程中重要的调控因子[4-5]，组织损伤后，转化生长因子β1首先由血小板脱颗粒释放到伤口周围，通过与细胞外基质相结合，转化生长因子β1被活化，活化的转化生长因子β1具有单核细胞、中性粒细胞、成纤维细胞的强烈化学趋化作用，从而导致伤口处的炎症反应[6]，而这些细胞又可产生、分泌更多转化生长因子β1；转化生长因子β1作用于损伤组织的成纤维细胞，促使其合成大量的I、III型胶原蛋白、FN、弹性蛋白、整合素、蛋白多糖等多种细胞外基质成分，从而促进创伤的愈合[7-9]。当转化生长因子β1大量分泌、过度表达时，引起以I型胶原为主的细胞外基质过度沉积，导致增生性瘢痕和纤维化疾病的形成[10-14]。另一亚类转化生长因子β3通过与转化生长因子β1竞争转化生长因子βII型受体（TβRII），拮抗转化生长因子β1作用，使愈合创面中III型胶原比例增高，从而降低I/III型胶原比例[15]，Kingston等[16-18]在最近的研究中观察到，将人的转化生长因子β3和转化生长因子β1基因分别转染修饰平滑肌干细胞，然后将基因转染的平滑肌干细胞移植于冠状动脉搭桥术的血管吻合口中发现，转染转化生长因子β3基因组血管管腔收缩程度明显小于转染转化生长因子β1基因组，而血管的弹性却显著高于后者。表明转化生长因子β3具有减轻伤口瘢痕、增加瘢痕弹性的作用。
由于外伤后病理性瘢痕的形成与创面的愈合过程有着密切的联系，通过创伤愈合时期引入细胞因子或生长因子及其他影响因素，调节创伤愈合机制，即可能改变细胞外基质结构，达到预防瘢痕形成的目的。本实验结果显示，实验组转化生长因子β1的表达明显低于对照组，3个对照组之间无差异；但在瘢痕形成早期（伤后21 d），实验组转化生长因子β1的表达并不低于3个对照组，到瘢痕形成高峰期和后期则明显下降，腺病毒组下降幅度低于实验组。实验组转化生长因子β3的表达明显高于其它各组和正常皮肤，腺病毒组转化生长因子β3的表达低于实验组、高于其余2个对照组和正常皮肤，瘢痕形成早期，实验组转化生长因子β3的表达比正常皮肤高3倍以上。
以上结果初步分析，创伤后转化生长因子β1和转化生长因子β3通过自分泌和旁分泌的过程明显增高，以促进创伤的愈合，但由于转化生长因子β1的过度表达，因此创伤后形成增生性瘢痕，此结论与实验的大体标本观察和苏木精-伊红组织形态学检测完全相符。而实验组和腺病毒组通过转染的TGF-β3c2s2基因表达转化生长因子β3，与转化生长因子β1竞争受体，达到减轻、抑制瘢痕的目的；但组织形态学结果显示对照组B组抑制瘢痕的作用弱于实验组，其原因可能有2个：腺病毒移植创面后，加重创面的急性炎症反应，促使转化生长因子β1分泌增加；腺病毒直接与创面接触后，病毒本身启动免疫反应[19]，使机体产生抗病毒抗体，从而阻止了载体随后的治疗作用，因此使转化生长因子β3表达的量小于实验组。本实验发现，实验组的转化生长因子β1表达明显低于其余各对照组，其机制是否为过高表达的转化生长因子β3通过某种途径抑制转化生长因子β1、或抑制纤溶酶原活化因子抑制剂则需进一步探讨[20]。

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