鼠尾胶在小鼠外周血间充质干细胞分离培养中的作用***★

刘岐焕1，陈龙1，程范军1，唐俊明2，王家宁2，高清平3

课题背景：重庆市卫生局医学科技计划资助项目：基因修饰骨髓间充质干细胞创面移植预防增生性瘢痕的实验研究（06-165）。课题前期已成功采用AdEasy-1腺病毒载体系统，通过分子生物学方法构建了含人TGF-β3c2s2目的基因的重组腺病毒载体，获得高滴度的TGF-β3c2s2重组腺病毒。本文以重组腺病毒为载体，用TGF-β3c2s2基因修饰的骨髓间充质干细胞进行创面移植进一步研究其对增生性瘢痕的作用。

相关链接：随着医学材料、组织工程学和干细胞等方面研究的不断深入，加速创面的愈合有了多种新的策略，但创面愈合后胶原过度沉积、增生性瘢痕的形成仍是需要进一步解决的问题。寻求更为有效的能够促进创面愈合、减少病理性瘢痕形成的方法，一直是国内外科研及临床工作者努力的方向。基因治疗和细胞替代治疗是近年来医学领域乃至生命科学领域研究的热点和前沿。重组腺病毒载体是一种能高效转移并表达外源基因的载体系统，所携带的目的基因在宿主细胞内可获得短时大量表达，极适合于具有明确阶段性创伤的愈合和增生性瘢痕的治疗，骨髓间充质干细胞在体内外能有效表达各种治疗性目的基因，所以又被认为是一种基因治疗的靶细胞。在创伤愈合的研究中发现，骨髓间充质干细胞进行创面局部移植能促进创面的愈合。

创新要点：①尽管有较多的干细胞移植及基因转染作为促进创面修复的新方法的文献报道，但严重创伤和深度烧伤的创面愈合后仍然存在较严重的病理性瘢痕。本文采用基因转染骨髓间充质干细胞创面移植的方法，在促进创面修复同时提高减轻病理性瘢痕的基因治疗鲜见报道。②本文结果显示，骨髓间充质干细胞体内诱导分化及表达转化生长因子β３蛋白，对创面修复过程中转化生长因子β１和转化生长因子β3表达有着显著的影响，通过这种影响可能减轻创面修复后增生性瘢痕的形成，为创伤修复早期干预性防治增生性瘢痕的细胞移植和基因治疗提供理论与动物实验基础。

1郧阳医学院附属东风医院血液科，湖北省十堰市 442000；2郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所，湖北省十堰市 442000；3武汉大学人民医院血液科，湖北省武汉市 430060

刘岐焕?，女，1970年生，河南省滑县人，汉族，2006年武汉大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事干细胞移植治疗血液病方面的研究。
liuqihuan-392@
163.com

通讯作者：程范军，博士，教授，郧阳医学院附属东风医院血液科，湖北省十堰市 442000
chengfanjun001@
sina.com

湖北省自然科学基金（2005ABA0
81）*；湖北省教育厅（D20072400
4）*；湖北省科技攻关项目（2007AA301C14-1）*

背景：动物和人外周血中分离出的间充质干细胞生长繁殖受分离方法、培养条件等因素的影响。
目的：采用重组人粒细胞集落刺激因子动员小鼠外周血间充质干细胞,体外培养条件中加入鼠尾胶包被，观察其对细胞分离、培养、增殖的影响。
设计、时间及地点：开放性实验，于2005-05/2007-12在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。
材料：昆明小鼠20只随机分为鼠尾胶包被组和不包被对照组，每组10只。
方法：小鼠皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子80 μg /(kg·d)连续动员5 d，最后一次注射后6 h取外周血。肝素抗凝后，采用全血细胞分离培养，用含体积分数为0.15胎牛血清DMEM培养基，分别接种于包被和未包被鼠尾胶的12孔板，接种密度为1×105/孔，48 h后半量换液以后每3天换液1次，培养10 d。
主要观察指标：①鼠尾胶包被的培养板对形成成纤维样细胞集落的影响。②成纤维样细胞集落中的间充质干细胞表面标记流式检测结果。③成纤维样细胞集落成骨、成脂肪诱导后嗜银法和油红O法染色鉴定。
结果：①使用鼠尾胶包被的培养板可增加重组人粒细胞集落刺激因子动员后外周血成纤维样细胞集落出现的频率（Ｐ < 0.05）。②经流式细胞术鉴定形成成纤维样细胞集落的细胞不表达CD34、CD133,表达CD90、CD105。③成骨、成脂肪诱导后细胞嗜银法和油红O法染色鉴定均呈阳性。
结论：培养的细胞符合公认间充质干细胞的特征，鼠尾胶可增加培养皿的黏附性促进间充质干细胞分离。
关键词：间充质干细胞；集落形成单位测定；粒细胞集落刺激因子

刘岐焕，陈龙，程范军，唐俊明，王家宁，高清平.鼠尾胶在小鼠外周血间充质干细胞分离培养中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4017-4020 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4017(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04017-04

Effect of rat tail collagen on the isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse peripheral blood

BACKGROUND: Culture of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from animals or human peripheral blood may be influenced by many factors, such as isolation method and culture condition.
OBJECTIVE: To investigate the effect on the isolation, culture and proliferation of mouse peripheral blood MSCs mobilized with recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) after rat tail collagen (RTC) is added for in vitro culture.
DESIGN, TIME AND SETTING: An open trial was carried out at the Institute of Clinical Medicine in the Affiliated People’s Hospital of Yunyang Medical College between May 2005 and December 2007.
MATERIALS: Twenty Kunming mice were divided into RTC-coated group and uncoated control group (n=10).
METHODS: Mice were injected subcutaneously with rhG-CSF at a dose of 80 μg/kg per day, once daily for 5 days. The peripheral blood samples were obtained 6 hours after the final administration. The cells were anticoagulated by heparin, and then whole blood culture was used to isolate MSCs. Peripheral blood mononuclear cells were seeded into a 12-well plate at a concentration of 1×105 cells per well in DMEM containing 0.15 volume fraction of feral bovine serum, coated with RTC or without, respectively. Half medium was refreshed 48 hours later and then changed completely every 3 days. Cells were cultured for 10 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: ①Evaluation of the colony-forming units fibroblast (CFU-F) on the culture plate coated with RTC.②Flow cytometry detection of MSCs surface label in CFU-F.③Differentiation of CFU-F into adipocyte and osteocytes identified by oil red O staining and von Kossa’s staining.
RESULTS: After mobilization with rhG-CSF, the CFU-F frequency of peripheral blood was increased on the culture plate coated with RTC compared with that without coating (P < 0.05). Flow cytometry detection showed that MSCs were positive for CD90, CD105 and negative for CD34 and CD133. MSCs were found to differentiate into adipocyte and osteocyte.
CONCLUSION: The cultured MSCs are consistent with the acknowledged MSC characteristics, RTC can increase the adhesive property of culture plate and promote the isolation of MSCs.

Liu QH, Chen L, Cheng FJ, Tang JM, Wang JN, Gao QP.Effect of rat tail collagen on the isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse peripheral blood.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4017-4020(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4017(ps).pdf]

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞, 被普遍认为是组织工程极佳的种子细胞。从小鼠骨髓分离间充质干细胞已经有比较成熟的方法，而从血量极少的小鼠外周血中分离出一定数量的间充质干细胞仍然是个难题。研究发现在动物和人的外周血中分离出间充质干细胞受分离方法、培养条件等的影响[1-2]。本课题组在使用人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员时发现其能够促进骨髓间充质干细胞的增殖，经流式细胞仪检测外周血中间充质干细胞的含量也有增加，且有剂量时间效应[3-4]。本实验拟通过体外条件下获取rhG-CSF动员的小鼠间充质干细胞,探讨其体外培养和扩增的条件。

设计：开放性实验。
时间及地点：实验于2005-05/2007-12在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。
材料：选取SPF级2个月龄昆明种小鼠20只，由郧阳医学院实验动物中心提供（动物质量合格证号：SCXK（鄂）2003/0005），雌雄不拘，体质量20 g。实验试剂与仪器：rhG-CSF为深圳新鹏生物工程有限公司生产（批号: 20040901）；高糖DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清（Hyclon）；12孔培养板（Orange sicientific）；重组猪胰岛素、地塞米松、维生素C、β磷酸甘油、5%苏丹Ⅳ染色液、5%硝酸银溶液、5%中性红染液及苏木精染液均为Sigma公司产品。流式细胞术试剂: 一抗为大鼠抗小鼠CD34、CD90、CD105、CD133 单克隆抗体,购自深圳晶美生物公司, 二抗为FITC标记的山羊抗大鼠IgG、PE标记的山羊抗大鼠IgG, 购自北京中杉生物公司；CO2培养箱(Binder公司)；倒置相差显微镜(NIKON TS-100，日本)；流式细胞仪（BECKMAN，美国）。鼠尾胶原(自制)。
方法：
鼠尾胶原的制备：取Wistar大鼠鼠尾，洗净，置体积分数为0.75的乙醇中浸泡30 min，无菌操作取下尾腱剪成0.5~1.0 cm的小段，浸入0.1 mol/L的醋酸中，制备成体积分数为0.1%的溶液，4 ℃下放置1个月。用无菌纱布过滤未溶解的部分，γ射线照射30 Gy分装， 4 ℃保存备用。
培养板处理：用吸管将鼠尾胶原均匀涂于12孔培养板孔内，过夜晾干后备用。临用前在超净台内紫外线照射40 min。
动物给药与取材：20只小鼠均给与皮下注射rhG-CSF 80μg/(kg·d)连续5 d，最后一次注射后6 h取材。用体积分数为0.1的水合氯醛麻醉,在无菌状态剖胸直视下用1 mL注射器由左心室采血直至不能抽出为止。
细胞培养：在无菌玻璃小瓶中将全血与含20 IU/mL肝素钠的体积分数为0.15的胎牛血清-
DMEM培养基充分混匀，调整有核细胞密度为 108 L-1,分别接种入鼠尾胶原包被和不包被的12孔培养板中，1 mL/孔，每只小鼠接种6孔，放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度环境中培养。48 h后半量换液。以后每3天换液1次，倒置显微镜连续观察10 d。瑞氏-吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数，计算成纤维细胞样集落出现的频率（阳性孔数/总接种孔数）。
成骨、成脂肪诱导：培养10 d后可见成纤

维细胞样集落出现，换液后加入成骨诱导液(15％FBS-DMEM含地塞米松4×10-6 g/L、β磷酸甘油1 g/L、维生素C 0.5 g/L)、成脂肪诱导液（15％FBS-DMEM含重组猪胰岛素0.01 g/L）。每72 h换液，诱导两周后出现脂滴和矿物结节后，分别行油红O染色和Von Kossa’s矿化结节染色法染色。
流式细胞术鉴定：对未染色的原代形成的成纤维细胞样集落用0.25%的胰蛋白酶消化、离心,沉淀重悬于PBS液中,每次取约2×106个细胞,分别加入抗小鼠CD34、CD133、CD90、CD105抗体,避光孵育20 min,用PBS冲洗后加入相应二抗,避光孵育15 min,用PBS冲洗,应用小鼠IgG1-FITC和小鼠IgG1-PE做为同型对照,用流式细胞仪检测抗原的表达情况并分析其所占比例。
主要观察指标：①鼠尾胶原包被对成纤维样集落形成的影响。②间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。③成纤维样集落中的间充质干细胞表面标记流式细胞术检测结果。
设计、实施、评估者：实验设计为第三、四作者，干预实施为第一、二作者，评估为第五、六作者，均受过系统培训，使用双盲法进行评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0软件进行统计处理，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验, P < 0.05为差异有统计学意义。

2.1 成纤维样集落的形态学观察外周血单个核细胞接种后首次48 h换液，轻轻去除悬浮细胞，此时细胞搀杂了大量的造血细胞，贴壁细胞无法辨认，此后每3天换液一次，10 d后有成纤维样集落出现，每个集落大约50~200个细胞（图1a），细胞有梭形、多角形等细胞形态(图1b)。

2.2 分化潜能成脂肪诱导2周之后油红O染色后可见到成纤维样集落中(85±6) %的细胞胞浆呈红色(图2a)。成骨诱导2周之后成纤维样集落出现矿物结节,Von Kossa’s染色后观察到大多数的成纤维样集落中心位置出现钙结节(图2 b)。

2.3 流式细胞术鉴定细胞表型应用流式细胞仪检测成纤维样集落中的间充质干细胞表明, CD34-、CD133-、CD90+、CD105+, 分别各占3%、3.1%、68%和79% (图3),提示间充质干细胞有别于造血干细胞的非造血干细胞。

2.4 培养的效率全血细胞鼠尾胶原包被培养板较不包被小鼠有更多的成纤维细胞样集落出现，集落出现的频率分别为50%，16%，差异有统计学意义（Ｐ < 0.05）。

间充质干细胞最初由Friedenstein等[5]从骨髓中分离出，它在成人骨髓内含量极低, 用成纤维样细胞集落方法研究表明成人骨髓间充质干细胞的频率大约为1/104。受血源性间充质干细胞分离和培养条件的影响，文献报道[6-7]成人血源性间充质干细胞出现的频率约为0.025/106~0.8/106，小鼠约为0.93/106。
有研究认为分离方法是影响外周血间充质干细胞培养效率的主要因素。目前从外周血中分离间充质干细胞的方法大致有5种，克隆形成率从高到低的顺序依次是流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法、血细胞分离机法、密度梯度离心法和全血细胞分离法。对小鼠而言，外周血量不足1 mL，有限的血量不适合血细胞分离机法，可采用的分离方法有流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法、全血细胞法和密度梯度离心法。流式细胞仪分选法、免疫磁珠分选法能够特异性的分离所需的细胞群但需要特殊设备及高昂的费用，而且影响细胞活性，不适宜大规模使用。虽然密度梯度离心分离时去除了大量的红细胞，减少了红细胞沉积于培养板底部影响间充质干细胞贴壁的负面作用，但在反复离心的过程中，细胞的活力较差，获得的细胞太少，对小鼠骨髓分离是较好的方法，但对外周血并不是理想的方法。相反全血细胞法分离培养早期可能由于标本中的大量的造血细胞和形成的细胞碎片影响间充质干细胞贴壁,但通过换液可逐步将其移除，而且细胞的活性较好、操作简单，污染较少，不失为分离小鼠外周血间充质干细胞的较好方法。本实验即采用这种方法。
在整个实验过程中，要获得活性好、形态均一的外周血间充质干细胞，需要比骨髓更严格的条件，注意以下细节问题：①提高间充质干细胞贴壁能力。实验表明细胞与材料的黏附是细胞在材料表面迁移、分化和增殖的基础。间充质干细胞有贴壁于塑料器皿生长的特性，外周血中的间充质干细胞数量非常稀少，只有提高间充质干细胞贴壁能力，才能提高间充质干细胞的培养效率，目前常用的促贴壁物质有胶原蛋白（如IV型胶原、鼠尾胶原Ⅰ型、明胶）、纤连蛋白、层黏连蛋白、多聚赖氨酸等。本实验发现在培养板底部铺鼠尾胶原可明显提高成纤维样集落产率，近年来有学者采用微载体悬浮培养等三维培养体系[8-9],通过提高可贴壁的表面而提高培养效率。②首次换液时间：由于外周血中间充质干细胞的数量非常少，全血法标本中的造血细胞以及造成大量的细胞碎片影响间充质干细胞贴壁,因而首次换液时间应较全骨髓培养长，控制在48 h后，以免因换液太早导致一部分未贴壁的间充质干细胞丢失。③半量换液，充分发挥造血细胞对基质细胞的作用，保持细胞生长环境的稳定对维持间充质干细胞的生长有利。④应用合适浓度的血清和培养基。文献报道用于血源性间充质干细胞的胎牛血清的浓度有0.1~0.2不等,培养基有DMEM、DMEM-F12、 L-DMEM、RPMI1640、α-MEM等，以α-MEM、L-DMEM为佳。有研究证实，相对于DMEM培养基而言，α-MEM培养基中含有种类更为丰富的氨基酸、核苷酸、维生素，可能更适于间充质干细胞的生长[10]。但也有实验证实，不同的培养基培养对间充质干细胞的培养效率并无影响[2]。另外整个实验过程中严格无菌操作，标本既不能溶血，也不能凝血也是实验成功的关键。
目前组织工程中,细胞移植成为重要的一部分,其中间充质干细胞由于有多向分化能力,成为细胞移植的新来源。正如外周血造血干细胞移植已逐步替代骨髓移植一样，利用外周血间充质干细胞进行细胞和基因治疗也将是今后发展的方向。但应用外周血间充质干细胞尚存在许多问题：众所周知，外周血间充质干细胞的数量非常少，如何进行体外扩增以达到有效剂量？最佳的分离和体外培养的条件如何？最佳的动员间充质干细胞的细胞因子是什么？它与骨髓间充质干细胞在生物学特性方面有何差异?这些问题有待于进一步的研究。

1 Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol 2003;121(2):368-374
2 Kassis I, Zangi L, Rivkin R, et al.Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads. Bone Marrow Transplant 2006;37(10):967-976
3 Liu QH,Cheng FJ,,Chen L,et al.Wuhan Daxue Xuebao:Yixueban 2007;28(3):336-340
刘岐焕,程范军,陈龙.等.粒细胞集落刺激因子对小鼠骨髓间充质干细胞的作用[J].武汉大学学报：医学版,2007,28（3）：336－340
4 Liu QH, Cheng FJ,,Chen L,et al.Zhongguo Shiyan Xueyexue Zazhi 2007;15(4):790-794
刘岐焕,程范军，陈龙.等.rhG-CSF对小鼠骨髓间充质干细胞的动员作用[J].中国实验血液学杂志，2007,15(4):790-794
5 Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al.Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation 1968;6(2):230-247
6 Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S, et al.Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol 2001;153(5):1133-1140
7 Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, et al.Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res 2000;2(6):477-488
8 Wu QF,Wu ZZ,Dong B,et al.Zhongguo Shiyan Xueyexue Zazhi 2003;11(1):15-21
吴清法,吴祖泽,董波,等.微载体悬浮培养成人骨髓间充质干细胞[J].中国实验血液学杂志,2003，11(1):15-21
9 Fu WY,Lu YM,Qiao DF,et al.Weifang Yixueyuan Xuebao 2003;25(3):169-171
付文玉,路艳蒙,乔东访,等.运用组织工程学原理构建间充质干细胞的三维培养体系[J].潍坊医学院学报,2003,25(3):169-171
10 Hu JB,Jiang DD,Zhou Y,et al.Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi 2005;25(6):15-19
胡静波,蒋丹丹,周燕,等.影响骨髓间充质干细胞分离效率的若干因素的研究[J].中国生物工程杂志,2005,25(6):15-19