两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化*★

焦红亮1, 3，杨波1，关方霞2，李建斌3，杜英4，单泓3，胡祥5，胡炜1，马建1，满勇6 ，赵林娜3，段艳丽3

术语解析：移植物抗宿主反应是当受者处于免疫无能或免疫抑制状态时，移植物内含有较多成熟的供者T细胞，在受体内迁移、增殖，进而引起严重攻击和破坏宿主体内细胞和组织的免疫反应，即通过识别受者抗原而产生攻击受者的免疫应答。常见于骨髓移植、小肠移植及免疫器官移植。

应用要点: ①实验发现混合的两份不同人脐血间充质干细胞有互相促进增殖作用，这在国内外均少见报道。②实验仅使用一种诱导剂－碱性成纤维细胞生长因子，加入的诱导因子少，但脐血间充质干细胞仍然表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白3种标记物。

偏倚或不足：实验只是发现两份混合脐血间充质干细胞数量多、贴壁快。细胞增殖究竟是互相促进（一份脐血间充质干细胞分泌生长因子，与另一份脐血间充质干细胞上的受体结合，同时，另一份脐血间充质干细胞也分泌细胞生长因子，与第一份细胞表面的受体结合，形成生长因子-受体复合物后，受体所包含的酪氨酸激酶被活化）还是互相竞争（两种不同的脐血间充质干细胞共同竞争胚牛血清中的营养物质，胚牛血清中含有氨基酸、维生素、无机盐、生长因子等各种营养物质）仍然不清楚。

1郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052；2郑州大学生物医学工程学，河南省郑州市450052；3河南省血液中心，河南省郑州市 450014；4郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，河南省郑州市 450052；5深圳市北科生物科技有限公司，广东省深圳市 518000； 6郑州市第二人民医院，河南省郑州市 450000

焦红亮★，男，1978年生，河南省郑州市人，汉族，郑州大学在读硕士，主要从事脐血间充质干细胞基础方面的研究。
jhl787878@126.
com

通讯作者：杨波，硕士，教授，博士生导师，郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052
yangbo96@126.
com ,
yangbo@zzu.
edu.cn

背景：脐血间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞，但在临床中发现干细胞培养细胞增殖的数量不足。
目的：观察两份脐血间充质干细胞混合培养的生长情况，以及经碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化。
设计、时间及地点：于2007-01/10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成以细胞为对象的对照观察性实验。
材料：健康分娩产妇自愿捐献的脐血60~180 mL。
方法：应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液以密度梯度法获取脐血间充质干细胞，加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时，随机取培养的6份脐血间充质干细胞（半量）为A组，6份脐血间充质干细胞（半量）为B组, 将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组。 3组细胞密度均为1.0×104 L-1。
主要观察指标：以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量，免疫组织化学检测脐血间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。
结果：活细胞计数和MTT比色检测显示，将两份不同脐血间充质干细胞混合后，细胞贴壁比单份脐血间充质干细胞快（P < 0.05），增殖也非常快（P < 0.05）。3组细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导后均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白，并且巢蛋白阳性表达率无差别（P > 0.05）。
结论：混合脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用,应用碱性成纤维细胞生长因子诱导的脐血间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。
关键词：脐血；间充质干细胞;诱导；分化；混合培养

焦红亮，杨波，关方霞，李建斌，杜英，单泓，胡祥，胡炜，马建，满勇，赵林娜，段艳丽.两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4021-4025
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4021(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04021-05

Mixed culture and differentiation of two samples of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into neuron-like cells

BACKGROUND: Culture of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from animals or human peripheral blood may be influenced by many factors, such as isolation method and culture condition.
OBJECTIVE: To investigate the effect on the isolation, culture and proliferation of mouse peripheral blood MSCs mobilized with recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) after rat tail collagen (RTC) is added for in vitro culture.
DESIGN, TIME AND SETTING: An open trial was carried out at the Institute of Clinical Medicine in the Affiliated People’s Hospital of Yunyang Medical College between May 2005 and December 2007.
MATERIALS: Twenty Kunming mice were divided into RTC-coated group and uncoated control group (n=10).
METHODS: Mice were injected subcutaneously with rhG-CSF at a dose of 80 μg/kg per day, once daily for 5 days. The peripheral blood samples were obtained 6 hours after the final administration. The cells were anticoagulated by heparin, and then whole blood culture was used to isolate MSCs. Peripheral blood mononuclear cells were seeded into a 12-well plate at a concentration of 1×105 cells per well in DMEM containing 0.15 volume fraction of feral bovine serum, coated with RTC or without, respectively. Half medium was refreshed 48 hours later and then changed completely every 3 days. Cells were cultured for 10 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: ①Evaluation of the colony-forming units fibroblast (CFU-F) on the culture plate coated with RTC.②Flow cytometry detection of MSCs surface label in CFU-F.③Differentiation of CFU-F into adipocyte and osteocytes identified by oil red O staining and von Kossa’s staining.
RESULTS: After mobilization with rhG-CSF, the CFU-F frequency of peripheral blood was increased on the culture plate coated with RTC compared with that without coating (P < 0.05). Flow cytometry detection showed that MSCs were positive for CD90, CD105 and negative for CD34 and CD133. MSCs were found to differentiate into adipocyte and osteocyte.
CONCLUSION: The cultured MSCs are consistent with the acknowledged MSC characteristics, RTC can increase the adhesive property of culture plate and promote the isolation of MSCs.

Liu QH, Chen L, Cheng FJ, Tang JM, Wang JN, Gao QP.Effect of rat tail collagen on the isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse peripheral blood.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4017-4020(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4017(ps).pdf]

脐血间充质干细胞是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞。来源于脐血的单核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型[1]，破骨样细胞和间充质样细胞，间充质样细胞呈纤维样。脐血取材方便，来源广泛，这为治疗神经疾病提供了一种新的种子细胞来源，有很大的应用前景。但是，在临床上治疗一些疾病时发现单份脐血细胞数量不足[2-3]。本实验拟比较混合脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells ,MSCs）和单份脐血MSCs的扩增及定向分化为神经元样细胞，为弥补临床应用单份脐血MSCs数量不足提供更充分的理论依据。

设计：随机对照细胞观察实验。
单位：郑州大学第一附属医院神经外科，河南省血液中心成分室, 郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室。
材料：实验于2007-01/ 10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成。脐血采集：在严格无菌条件下，肝素抗凝,采集健康分娩产妇自愿捐献脐血（检测乙肝5项、HCV、HIV、梅毒阴性）60~180 mL，充分混匀，4 ℃冷藏，4 h内进行分离。实验经医院伦理委员会批准。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施及结果评估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
脐血间充质干细胞的原代分离和培养：将脐血收集在含有抗凝剂的200 mL采血袋，配平后用离心机离心，2 500 r/min，5 min。将上面的血浆收集在50 mL采血袋内，加入等量的生理盐水，充分混匀。缓慢加入预先加有比重为1.077 g/cm的淋巴细胞分离液。 1 900 r/min水平离心25 min后，弃去上面的液体，小心吸取中间的含有单个核细胞的白膜层。加入生理盐水，1 000 r/min,离心5 min后，洗涤2次，弃上清。所得单核细胞经椎虫蓝染色、光学显微镜下计数活细胞，以1.0× 106 L-1的密度接种于含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的培养箱内培养。培养72 h即倾去全部上清液体，以后每3 d全量换液1次，同时记录显微镜下培养细胞的形态变化。
细胞的培养，纯化及扩增：培养基采用体积比DME∶F12为1∶1的DMEM/F12加体积分数为0.10的胎牛血清(FBS),20 g/L bFGF，将细胞分装于75 mL培养瓶中，置于37 ℃，饱和湿度体积分数为0.05的CO2培养箱中培养48~72 h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每三四天全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时，用25 g/L的胰酶消化。消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩，变圆，即终止消化，加体积分数为0.20胎牛血清，加入生理盐水离心后，分为两份进行传代培养，并标记P1代。传代培养过程中每3 d全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，在重复上述操作，传代培养记为P2代，其余类推。
脐血间充质干细胞混合、分组及培养：取1份第3代的脐血MSCs，胰酶消化后，加入

体积分数为0.20的胎牛血清终止，加入生理盐水洗1遍后加入培养基，单核细胞经椎虫蓝染色、光学显微镜下计数活细胞后，把其分为等量的2份，其中一份以1.0× 104 L-1的密度接种到24孔培养板,标记为A组。取另1份第3代的脐血MSCs，把其分为等量的2份，其中一份以 1.0×104 L-1的密度接种到24孔培养板，标记为B组。然后将上述两份剩余的细胞等量混合，细胞浓度也调整为1.0×104 L-1接种到24孔培养板中，标记为C组，共分3组，每组6份细胞。培养72 h即倾去全部上清液体，以后每3 d全量换液1次，每孔加入1 mL含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基，20 g/L bFGF，培养到第 18天为止。
活细胞计数和绘制生长曲线：取培养第3代的3组脐血MSCs消化、离心，按1×104 /孔接种于24孔板，置37 ℃、含体积分数为0.05的CO2空气的培养箱内培养 18 d，每3 d取3个孔消化，经椎虫蓝染色、光学显微镜下计数活细胞数，求出其平均值。以平均数为结果绘制细胞生长曲线。
MTT比色法和绘制生长曲线：取培养第3代的3组脐血MSCs消化、离心，按2 000个/孔左右的密度接种于96孔板，培养18 d，每3 d行1次MTT实验。MTT方法：细胞培养后，每孔加如浓度为5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃培养箱继续培养4 h后终止。用吸管吸除上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡1 min，在490 nm波长下用自动酶标仪检测吸光度值，以结果绘制细胞生长曲线。
培养后人脐血MSCs的神经标志物（神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白）的表达，细胞免疫组织化学步骤如下：细胞固定：吸除培养液后以PBS冲洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min。消除内源性过氧化物酶：再次PBS冲洗3次，每次 5 min，3%H2O2 去离子水孵育5~10 min。血清封闭：滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10~15 min,倾去，不洗。一抗孵育：滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃孵育2.0~3.0 h或4 ℃过夜。PBS冲洗，3 min×3次。二抗孵育：滴加生物素化二抗工作液，室温或37 ℃孵育10~15 min。PBS冲洗，3 min×3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温或37孵育10~15 min。PBS冲洗，3 min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗。苏木精复染：加苏木精约5 min使细胞核显色。中性树胶封固后置于光镜下观察。
阳性细胞判定和计数：nestin阳性细胞的胞浆呈棕褐色或棕黄色，随机分别从单份脐血MSCs和混合脐血MSCs计数20个视野。
主要观察指标：3组细胞扩增数量及神经标志物神经胶质细胞标志物、NSE和nestin的表达。
统计学方法：统计处理由第一作者来完成。实验数据采用_x±s表示，并经国际通用统计学分析系统SPSS 10.0统计软件进行统计分析，使用前先行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布并方差齐的根据数据类型应用参数检验中的单因素方差分析或t检验，不符合正态分布的应用非参数检验中秩和检验，以α=0.05作为显著性水准。

2.1 人脐血间充质干细胞的原代培养刚分离的脐血MSCs呈小圆形，培养初期呈悬浮样，部分开始贴壁生长，出现小的胞浆突起，细胞呈圆形、卵圆形、纺锤性或逗号样；3 d左右细胞贴壁生长增多，弃去悬浮细胞，大多数贴壁细胞出现胞浆突起，可见一些细胞伸出胞突；12 d后，通过换液其中搀杂的红细胞基本已经清除完全，胞浆丰富，核大且核仁明显，细胞呈纤维样形态，贴壁的细胞呈圆形和长梭形，培养细胞生长可达60%~80%融合，有的可呈克隆团样生长，见图1，单份脐血两组细胞贴壁一般需要48 h左右，而混合脐血组混合脐血MSCs只需要2 h左右。
2.2 3组活细胞计数结果细胞计数显示单份脐血两组增殖曲线相似，但混合脐血组增殖曲线比单份脐血两组高，见图3。脐血培养的第3，9,18天活细胞计数结果经单因素方差分析显示3组差异有显著性意义，LDS检验结果显示：单份脐血两组差异无显著性意义，而混合脐血组和单份脐血二组差异均有显著性意义。见表1。
2.3 MTT比色检测结果 MTT比色法显示单份脐血两组增殖曲线相似，但混合脐血组增殖曲线比单份脐血两组高，见图3。培养的第3，9,18天MTT比色检测结果经单因素方差分析显示3组差异有显著性意义，LDS检验结果显示：单份脐血两组差异无显著性意义，而混合脐血组和单份脐血两组差异均有统计学意义。见表2。
2.4 免疫细胞化学观察人脐血MSCs神经标志物神经胶质细胞标志物、NSE和nestin的表达人脐血MSCs诱导前神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白均为阴性，人脐血MSCs经碱性成纤维细胞生长因子诱导10 d后，3组脐血MSCs均有神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白表达，见图4，阳性细胞的胞浆呈棕褐色或棕黄色。
2.5 经碱性成纤维细胞生长因子诱导后脐血MSCs的巢蛋白阳性细胞百分比数在每个视野下，单份和混合脐血MSCs的巢蛋白阳性细胞占总细胞数的百分比，经单因素方差分析显示3组差异没有显著性意义[A组：（52.64±6.59）%，B组：（52.95±6.28）%，C 组：（53.14± 5.32）%，P > 0.05]。

人们发现骨髓中除造血干细胞外还存在另一类干细胞，即间充质干细胞,脐血中也分离出间充质干细胞，脐血间充质干细胞有多向分化潜能[4-7]，尤其是可诱导分化为神经样细胞，表达神经干细胞特异性抗原标志巢蛋白及神经细胞特异性抗原标志，脐血作为外周血取材方便，来源广泛，因此脐血间充质干细胞的发现引起神经科学研究者极大的兴趣[8-10]。但是，在临床上治疗一些疾病时发现单份脐血细胞数量不足。
北京大学血研所于2000年对2例高危白血病患者进行了HLA配型不和的双份脐血移植[11]。2例患者血小板≥20×109 L-1的时间分别为移植后21 d和22 d，无严重慢性移植物抗宿主反应发生；国际尚无两份脐血移植后长期存活的报道，这一开创性工作至少提示在临床上同时移植两份脐血是可行的，不仅可获得稳定的造血重建、持久植入，弥补单份脐血细胞数量不足的缺点。作者发现把两份不同脐血MSCs混合后，细胞贴壁比单份脐血MSCs快的多，并且细胞增殖也非常快，通过细胞计数法和MTT法均证实了这一情况，单份脐血MSCs一般贴壁需要48 h左右，而混合脐血MSCs只需要2 h左右，混合的脐血MSCs贴壁后形成多个很大的细胞克隆团。有关这种机制，作者认为有两种可能：其一，一份脐血MSCs分泌生长因子，与另一份脐血MSCs上的受体结合，同时，另一份脐血MSCs也分泌细胞生长因子，与第一份细胞表面的受体结合，形成生长因子-受体复合物后，受体所包含的酪氨酸激酶被活化，使细胞内的相关蛋白直接被磷酸化[12]，这些被磷酸化的蛋白质，再活化核内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。细胞受体包括细胞膜上的受体和细胞内受体。其二，可能是两种不同的脐血MSCs共同竞争胚牛血清中的营养物质，胚牛血清中含有氨基酸、维生素、无机盐、生长因子等各种营养物质[13]。体外实验证实，脐血MSCs可分泌神经生长因子及转化生长因子[14]。在体内神经系统微环境中，可能更有利于移植的干细胞分泌神经营养因子。已有研究表明脐血间充质干细胞可通过旁分泌作用分泌细胞因子对周围组织发挥营养支持，这些神经营养因子对受损伤神经组织发挥营养支持，促进神经功能恢复。比较单份和混合脐血MSCs的巢蛋白阳性细胞占总细胞数的百分比，本实验发现巢蛋白的阳性表达率没有差别，说明混合培养的脐血MSCs和单份脐血MSCs一样，都是一些有活力的细胞，这在国内外以前均没有人报道，混合的脐血MSCs可以弥补了单份脐血细胞数不足的缺点，为临床治疗提供重要的理论依据。
脐血MSCs诱导分化为神经元样细胞，在国内外文献内有许多报道，诱导的方法也很多，例如侯玲玲等[15]采用抗氧化剂二甲基亚砜、丁羟苯甲醚逐步诱导脐血MSCs，5天后78%的细胞呈现典型的神经元样表型，免疫组化法检测发现MSC均有神经元特异性烯醇化酶和神经丝蛋白M（neurofilamentM, NF-M）表达，诱导后组织化学检测可见神经元特有结构--Niss体。秦洁等[16]采用表皮生长因子和bFGF诱导脐血MSCs，诱导第14天细胞呈现纤维状，多个临近细胞的突起连成网状，类似于神经元。Buzanska等[17]将采集的脐血单核细胞进行分选，剔除CD34和CD45阳性细胞后，所得细胞在含表皮生长因子培养基中培养6周，获得巢蛋白阳性并能每周自我增殖10倍的细胞集落。Jeong等[18]用bFGF预诱导后，再用二甲基亚砜、丁羟苯甲醚联合诱导脐血MSCs，细胞迅速向神经细胞快速分化，诱导后细胞呈现神经元样形状，免疫荧光检测显示神经前提细胞标志巢蛋白呈阳性，成熟神经细胞标志物神经胶质细胞标志物、微管相关蛋白2也呈阳性。Chen等[19]报道，不同浓度的bFGF能使间充质干细胞向不同的方向分化。例如低浓度时，细胞分裂增殖成神经元样克隆，而高浓度则倾向于神经胶质细胞样克隆，且随着bFGF浓度的增加产生胶质细胞样的克隆也增加。本文只用bFGF作为诱导剂，诱导前脐血MSCs不表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和nestin。加入bFGF诱导后，脐血MSCs均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和nestin。虽然表达的数量不完全相同，但均出现了阳性细胞[20]。本文加入的诱导因子最少，但脐血MSCs表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白三种标记物。

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