血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响☆

多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化*★

王忠琼，李昌平，杜光红，钟晓琳，陈霞

课题背景：课题已获四川省教育厅2003年科研资助，正在积极申请国家自然科学基金的资助。前期已经成功的完成了骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定、诱导分化及诱导分化后的细胞特异性标志物的检测，现阶段处于动物实验过程，在肝纤维化大鼠模型的建立及骨髓间充质干细胞与诱导后细胞移植的基础上，正在进行移植后各项指标的检测及病理学标本检测，用以验证诱导后细胞对肝纤维化的治疗作用。

应用要点：目前分离骨髓间充质干细胞的方法主要有免疫磁珠法、流式细胞仪分离法、贴壁培养筛选法、密度梯度离心法，本实验采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合，可避免由于骨髓间充质干细胞的丢失造成的细胞难以增殖，提高骨髓间充质干细胞的培养成功率，此外还可缩短骨髓间充质干细胞原代培养的时间。

重要的概念：甲胎蛋白是由肝前体细胞分泌的一种胞浆蛋白，随着细胞逐渐成熟而消失，成熟肝细胞不表达。白蛋白是主要由成熟肝细胞分泌的一种胞浆蛋白，是反映肝细胞代谢活性的一个特异指标。在诱导过程中，甲胎蛋白表达逐渐降低与白蛋白表达逐渐增高能反映肝细胞由幼稚到成熟的过程。

1郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450052；2郑州大学生物医学工程学，河南省郑州市450052；3河南省血液中心，河南省郑州市 450014；4郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，河南省郑州市 450052；5深圳市北科生物科技有限公司，广东省深圳市 518000； 6郑州市第二人民医院，河南省郑州市 450000

王忠琼★，女，1975年生，四川省西昌市人，汉族，泸州医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事肝病方面的研究。
yqwzqyk@
163.com

通讯作者：李昌平，硕士，教授，泸州医学院附属医院消化内科，四川省泸州市 646000
1ichangpingl965@
sina.com

背景：肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的有效方法之一，却面临细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后无法保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制，寻找新的肝细胞来源尤为迫切。
目的：探讨肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子及抑瘤素M诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力。
设计、时间及地点：细胞对照观察，于2006-06/2007-03在泸州医学院附属医院实验室完成。
材料：清洁级雄性Wistar大鼠24只用于制备骨髓间充质干细胞。红细胞裂解液由泸州医学院附属医院传染免疫实验室配制。重组鼠肝细胞生长因子、抑瘤素M为美国R&D产品，酸性成纤维细胞生长因子由美国Peprotech生产。
方法：采用红细胞裂解+贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化后传代。传至第4代，以5×107 L-1接种，设立6组向肝细胞诱导分化：第1组作为对照，不加任何细胞因子；第2组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子；第3组加入肝细胞生长因子、抑瘤素M；第4组加入酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M；第5组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M；第6组于1~9 d加入肝细胞生长因子，9~18 d加入酸性成纤维细胞生长因子，9~21 d加入抑瘤素M。每组所加入的各种细胞因子终末浓度均为20 μg/L。
主要观察指标：采用溴甲酚绿法、化学发光法、RT-PCR法检测肝细胞特异性标志物白蛋白、甲胎蛋白的表达。采用谷氨酸脱氢酶法检测尿素含量。
结果：诱导0，7，14，21 d，未加入诱导因子的对照组及酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组无白蛋白、尿素表达，肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养基上清液中甲胎蛋白、白蛋白、尿素含量均显著高于其余因子组(P < 0.05)。
结论：酸性成纤维细胞生长因子与抑瘤素M共同作用无法诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，二者联合肝细胞生长因子可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。分时段加入此三种细胞因子，可能影响了细胞因子间的相互作用而导致分化率降低。
关键词：骨髓间充质干细胞；细胞因子；肝细胞

王忠琼，李昌平，杜光红，钟晓琳，陈霞.多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4035-4038 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4035(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04035-04

Several kinds of cytokines induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes

BACKGROUND: Hepatocellular transplantation is an effective method to treat terminal stage liver function failure. However, hepatocellular transplantation is limited by deficiency of cell source, in vitro proliferation, difficult to keep original feature after passage and immunologic rejection. It is urgent to search for a new hepatocyte source.
OBJECTIVE: To investigate the differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into hepatocytes induced by hepatocyte growth factor, acid fibroblast growth factor and oncostatin M.
DESIGN, TIME AND SETTING: The cell control experiment was performed at the Laboratory of Hospital Affiliated to Luzhou Medical College from June 2006 to March 2007.
MATERIALS: Twenty-four male Wistar rats of clean grade were selected to collect BMSCS. Red cell lysate was prepared by Laboratory of Infection Immunity of Hospital Affiliated to Luzhou Medical College. Hepatocyte growth factor and oncostatin M were purchased from R&D, USA. Acid fibroblast growth factor was bought from Peprotech, USA.
METHODS: Rat BMSCs were separated by splitting red cells with adherent culture, digested by trypsin and then passaged. At the fourth passage, cells at the density of 5×107 L-1 were incubated and divided into 6 groups. BMSCs in the group 1 were considered to controls, without any cytokines. BMSCs in the group 2 were incubated with hepatocyte growth factor and acid fibroblast growth factor. BMSCs in the group 3 were incubated with hepatocyte growth factor and oncostatin M. BMSCs in the group 4 were incubated with acid fibroblast growth factor and oncostatin M. BMSCs in the group 5 were incubated with hepatocyte growth factor, acid fibroblast growth factor and oncostatin M. BMSCs in the group 6 were incubated with hepatocyte growth factor from days 1 to 9, with acid fibroblast growth factor from days 9 to 18 and with oncostatin M from days 9 to 21. End level of various cytokines was 20 μg/L in each group.
MAIN OUTCOME MEASURES: Albumin and alpha fetoprotein were measured by bromocresol green method, chemi-luminescent technique and reverse transcription-polymerase chain reaction method. Urea levels were examined by glutamic acid dehydrogenase method.
RESULTS: At days 0, 7, 14 and 21, albumin and urea were negative expression in the control group and group 4. Alpha fetoprotein, albumin and urea were significantly higher in the group 5 than in other groups (P < 0.05).
CONCLUSION: Combination of acid fibroblast growth factor and oncostatin M cannot induce the differentiation of BMSCs into hepatocytes. Their combination with hepatocyte growth factor can successfully induce the differentiation of BMSCs into hepatocytes. Addition of three cytokines in different time can decrease differentiation ratio.

Wang ZQ, Li CP, Du GH, Zhong XL, Chen X.Several kinds of cytokines induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4035-4038(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4035(ps).pdf]

肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的最有效的方法之一，却受到细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后不能保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制而影响其临床应用[1-4]。因此，寻找新的肝细胞来源途径成为这一领域研究的热点。骨髓间充质干细胞在适宜的条件下能分化为成骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经元和肝细胞等，由于其自体来源且无免疫排斥及伦理道德问题等问题，因此可作为组织工程中理想的种子细胞。

设计：细胞对照观察。
时间及地点：于2006-06/2007-03在泸州医学院附属医院实验室完成。
材料：清洁级雄性Wistar大鼠24只（泸州医学院动物实验中心提供），3~4周龄，体质量80~100 g，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
主要试剂和仪器来源

方法：
骨髓间充质干细胞的分离培养及纯化：颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取四肢骨，用磷酸盐缓冲液反复冲洗骨髓腔，加入红细胞裂解液获得单个核细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM-LG，调节细胞密度为2×109 L-1，接种于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中进行培养，3 d后首次换液，以后每两三天换液1次，待细胞生长至瓶底80%~90%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2~1∶3传代后继续培养。培养过程中在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。用免疫荧光染色的方法进行鉴定。
骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化：取第4代骨髓间充质干细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，以5×107 L-1接种于预先用50 mg/L FN处理的6孔板中。分6组：第1组作为对照，不加任何细胞因子；第2组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子；第3组加入肝细胞生长因子、抑瘤素M；第4组加入酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M；第5组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M；第6组于1~9 d加入肝细胞生长因子，9~18 d加入酸性成纤维细胞生长因子，9~21d加入抑瘤素M。每组所加入的各种细胞因子终末浓度均为20 μg/L。
肝细胞特异性标志物检测：诱导第0，7，14，21天取各组细胞上清液，采用溴甲酚绿法检测白蛋白的表达，采用化学发光法检测甲胎蛋白的表达。
RNA的提取及RT-PCR检测：诱导第0，7，14，21天取各组细胞，提取RNA后采用RT-PCR法检测白蛋白、甲胎蛋白的表达量，引物由上海生工合成。取PCR反应液在琼脂糖凝胶上电泳成像。
肝细胞代谢功能检测：诱导后每3d收集各组培养细胞上清液，用谷氨酸脱氢酶法检测上清液中的尿素含量，观察其动态变化趋势，绘制尿素含量变化曲线。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞形态观察。②骨髓间充质干细胞的鉴定。③骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化情况。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一、三、四作者，评估为第一、五作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第一作者利用SPSS 13.0软件进行方差分析，以α=0.05为检验水准。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定第4代骨髓间充质干细胞加入一抗、二抗及荧光染料后，CD44、CD90染色均呈阳性，CD45染色呈阴性。
2.3 骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化情况
2.3.1 形态学变化诱导前骨髓间充质干细胞呈梭形或纺锤形，随着诱导时间延长，各因子组均出现异形细胞，且数量有增多趋势，诱导后细胞生长速度较诱导前变慢，细胞有聚集趋势，1∶2传代后约1~2周铺满瓶底(图2)。对照组始终未出现细胞形态及增殖速度的改变。

2.3.2 细胞生长曲线的测定各因子诱导组骨髓间充质干细胞传代培养潜伏期约为24~48 h，第3 天进入对数增殖期，第5~6天进入平台期。与对照组比较，各因子诱导组细胞生长增殖速度增快 (P < 0.05)。
2.3.3 肝细胞特异性标志物检测诱导0，7，14，21 d，肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养基上清液中甲胎蛋白、白蛋白含量均显著高于其余因子组(P < 0.05)，未加入诱导因子的对照组及酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组各时间点均未检测出白蛋白表达，见表1，2。

2.3.4 RT-PCR检测结果诱导7~14 d各因子组细胞均可见甲胎蛋白mRNA的表达，21 d时仅酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组呈阳性表达，其余各组均转为阴性。随诱导时间的延长，酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组甲胎蛋白mRNA的表达量逐渐升高，其余各因子组甲胎蛋白mRNA的表达量呈逐渐升高而后降低的过程，对照组甲胎蛋白mRNA始终呈阴性表达（图3）。

诱导0~21 d，对照组与酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组均未出现白蛋白mRNA的表达。其余各因子组诱导7 d前均无白蛋白mRNA的表达，14~21d出现白蛋白 mRNA的表达，且表达量逐渐升高（图4）。

2.3.5 肝细胞代谢功能检测与对照组比较，酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养上清液中尿素浓度无变化(P > 0.05)；而其余各因子诱导组尿素浓度随诱导时间延长而逐渐增高，肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组增长幅度尤为显著(P < 0.05)。

骨髓间充质干细胞体外分离培养后在一定的诱导条件下，具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等[5-8]多向分化的能力，近年来其向肝细胞的分化备受关注[9-10]，但其在体内含量很少，只占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.01%[11]，且缺乏特异性的鉴定方法。本实验采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离培养骨髓间充质干细胞，虽然此法分离得到的骨髓间充质干细胞纯度可能不及密度梯度离心法，但可能由于含有与骨髓间充质干细胞增殖有关的RS-1细胞，细胞增殖活力强[12]，能缩短原代培养的时间。在本实验中经过形态学观察和表面标志相结合法鉴定纯化的骨髓间充质干细胞，观察到分离纯化的细胞在形态上符合骨髓间充质干细胞的特点，同时第4代细胞CD44、CD90呈阳性反应，而CD45呈阴性，符合骨髓间充质干细胞的表现。
肝细胞生长因子是一种多效性细胞因子，最早是由Nakamura等于1984年从部分肝切除大鼠血清中分离得到，因最初被发现可刺激肝细胞合成DNA而得名，HGF不仅能促进细胞分裂、迁移，抑制细胞凋亡促进肝细胞增殖，还能促进干细胞的分化[13-14]。肝细胞生长因子与受体结合后可以引起受体的聚合和多个酪氨酸胞内段的磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基与胞内含SH2调控结合结构域的信号转导分子发生反应，可能激活MAPK、PI3-K等信号传递，影响细胞核内的转录机构，通过调控某些特定基因的转录和表达影响细胞增殖、分化[15-16]，改变细胞内游离钙离子水平，进而影响细胞游走、生长及表型变化。酸性成纤维细胞生长因子在生理和病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。它既可以作为一种有效的有丝分裂原，又可以作为一种播散因子，通过与特异性细胞表面受体相结合，启动受体的酪氨酸残基自身磷酸化引导细胞的增殖、分化等各种生物学效应。实验结果显示这三种细胞因子分别联合起来对细胞的增殖是有影响的，且在一定微环境下，它们联合使用均有向肝细胞分化的能力，在同一诱导时间点，联合使用肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M组的甲胎蛋白、白蛋白及尿素含量均高于其余因子组，表明三种因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力更强，其原因可能是三种因子的胞内信号转导途径虽然不完全相同，但在同时作用于骨髓间充质干细胞后，可能其信号转导出现了cross-talk，从而影响了分化细胞的某些生物学特性，增强了肝细胞生长因子促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的生物学效应。但酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组一直未检测出白蛋白及尿素，故认为缺少肝细胞生长因子时可能不能诱导干细胞转化为成熟的肝细胞。根据本实验结果，认为联合应用酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和抑瘤素M在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化方面有着很大的优势，分时段地使用细胞因子可能影响了细胞因子间的相互作用而使分化率降低。

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