课题背景：前期实验显示，肝叶大部切除小鼠血清诱导骨髓间充质干细胞可向肝细胞方向分化，但临床应用受到限制。射频消融技术治疗恰恰能起到类似肝切除的效果，并且肿瘤治疗坏死灶存在能刺激机体免疫力提高。课题在射频消融技术治疗基础上提出用射频消融兔肿瘤治疗血清做为诱导剂,运用干细胞技术将治疗中不利条件转为有利条件，并用自体治疗血清诱导骨髓间充质干细胞生成肝样细胞。

创新要点：文章以现代微创外科思维作为指导，运用干细胞组织工程技术和自体治疗血清，成功的使骨髓基质干细胞向肝细胞样细胞定向分化, 并具有一定的功能,避免了同种异体细胞移植免疫排斥反应及动物血清引起的疾病和免疫排斥反应，为诱导干细胞向肝细胞分化,肝损伤修复以及人工肝研究提供了一个新的思路，将外科微创治疗同组织工程结合这是本文的新颖和独到之处。

相关链接：已有研究结果表明,骨髓来源的干细胞具有向肝脏干细胞分化的潜能,肝脏干细胞具有朝肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。骨髓来源的干细胞还可以分化为血管内皮细胞，使干细胞存在内环境得到改善，有利于其生存及替代修复,但临床自体血清诱导分化实验刚刚起步，人们对在体外培养诱导骨髓间充质干细胞的条件掌握尚不成熟，尤其是无血清培养。

西安交通大学医学院第一医院， 1肝胆外科，2心脏内科，陕西省西安市 710061；3西安交通大学医学院第二医院骨科，陕西省西安市 710061

杨 屹☆，男，1972年生，陕西省户县人，汉族，西安交通大学在读博士,主治医师， 主要从事肝胆外科微创治疗及肝脏外科研究。
yangyi2002163@
163.com

通讯作者：王作仁，博士, 教授, 西安交通大学第一医院肝胆外科，陕西省西安市 710061
wangzuo-ren2008@
163.com

摘要

目的：鉴于目前对体外培养诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的条件掌握尚不成熟，尤其是无血清培养。实验拟将临床常用微创治疗同细胞移植结合，观察荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融兔肝肿瘤自体血清诱导下向肝样细胞的分化,寻求一种自体肝组织的修复方法。
方法:实验于2006-09/2007-09 在西安交通大学医学院中心实验室完成。实验室为教育部基因与环境研究重点实验室。①实验材料：健康新西兰大白兔,二三月龄，雌雄不限，体质量1.5~2.0 kg，由西安交通大学医学院动物试验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。荷瘤种兔包块由西安交通大学第一医院介入中心刘亚民教授馈赠。②实验方法：取荷瘤种兔瘤组织块，在兔在肝脏右叶做一直径为2~3 mm的隧道，将肿瘤组织块植入隧道底部制备肝肿瘤动物模型。射频消融治疗灭活荷瘤兔肝脏肿瘤及边缘1 cm正常肝脏组织,于72 h后取全血及骨髓。应用体外细胞培养技术自骨髓血中分离、纯化兔骨髓间充质干细胞后,取P2细胞在4种不同培养基培育：对照组：含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液；射频兔肝肿瘤治疗血清组：无血清低糖DMEM培养液加入射频兔肝肿瘤治疗血清；射频肝肿瘤治疗血清热灭活组：无血清低糖DMEM培养液加入射频肝肿瘤治疗灭活血清；生长因子组：含0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液加入肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子。③实验评估：倒置显微镜下观查细胞形态变化，流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法检测肝细胞标志物白蛋白及CK18表达，鉴定细胞性质及功能。
结果:①原代、传代培养及流式细胞仪结果显示, 射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子对兔骨髓间充质干细胞的诱导能明显促进细胞的增殖，S+G2+M期细胞百分数明显增高，2周后免疫荧光染色可见分化细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。②射频肝肿瘤治疗兔灭活血清及胎牛血清能使兔骨髓间充质干细胞生长，但不如射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、皮细胞生长因子促进细胞增殖明显（P < 0.01），传代培养2周，细胞形态未见明显变化，未见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达。
结论: 肿瘤射频消融兔血清可激活、诱导自体骨髓间充质干细胞增殖并向肝样细胞分化,使射频消融肿瘤治疗的同时行肝样细胞移植修复肝损伤成为可能。
关键词：射频消融；肝肿瘤；骨髓间充质干细胞；肝样细胞

杨屹，霍建华，屈波，张明宇，王作仁.荷瘤兔骨髓间充质干细胞在射频消融自体血清诱导下向肝样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4039-4043 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4039(ps).pdf]

中图分类号: R735.7
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04039-05

收稿日期：2007- 11-13
修回日期：2007-12-20
(07-50-11-6243/GW·Y)

Differentiation of mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by autologous serum after radiofrequency ablation for liver tumor in rabbits

Abstract

AIM: It is an immature condition that induces mesenchymal stem cells (MSCs) cultured in vitro differentiate into hepatocyte-like cells, in particular by using serum-free culture. This study was designed to investigate the effect of rabbit serum after radiofrequency ablation (RFA) for the liver tumor on inducing MSCs differentiate into hepatocyte-like cells, and find an autologous cell source for liver injury reparation.
METHODS: The experiment was carried out in the Central Laboratory of Medical College, Xi'an Jiaotong University (Key Laboratory of Environment and Genes by the Ministry of Education) between September 2006 and September 2007. Healthy New Zealand white rabbits of either gender, 2-3 months old, and 1.5-2.0 kg weight, were offered by the animal testing center of Medical College, Xi'an Jiaotong University. All the experimental procedures were in accordance with the ethical standard. Tumor mass in rabbits was presented by Professor Liu Ya-min, the Intervention Center of the First Hospital of Xi'an Jiaotong University, as a gift. A piece of tumor was transplanted into a tunnel (2-3 mm diameter) at right liver to establish the model of liver tumor. The whole blood and bone marrow were collected from rabbits 72 hours after RFA was subjected to the tumor of liver and normal liver tissue within 1 cm margin. MSCs were isolated from rabbit bone marrow, cultured in vitro and purified. P2 cells were harvested and cultured in four different media (L-DMEM) respectively: control group: L-DMEM containing 0.1 volume fraction of fetal calf serum; serum after RFA group: serum-free L-DMEM containing rabbit autologous serum after RFA; serum after RFA with heat inactivation group: serum-free L-DMEM containing rabbit autologous serum after RFA with heat inactivation; growth factor group: L-DMEM containing 0.1 fetal calf serum with hepatocyte growth factor (HGF) and epidermal growth factor (EGF). Morphology of MSCs was observed under the inverted microscope. Flow cytometry was used to measure the cell cycle, proliferation and growth. The expression of hepatocyte marker albumin and CK18 was detected by using immunohistochemistry to identify the characters of differentiated cells.
RESULTS: The primary culture, passage and flow cytometry revealed that, rabbit autologous serum after RFA, HGF and EGF all had an obvious effect on facilitating the proliferation of MSCs by induction, and the cells at S+G2+M stage were remarkably increased. After induction for 2 weeks, the differentiated cells expressed albumin and CK18 by immunohistochemistry. Rabbit MSCs grew in the medium containing rabbit autologous serum with heat inactivation and fetal calf serum, which were still inferior to rabbit autologous serum after RFA, HGF and EGF (P < 0.01). Induced for 14 days, no changes were found in the morphology of cells, and no expression of CK18 and albumin could be seen.
CONCLUSION: MSCs can be activated and induced to differentiate into hepatocyte-like cells in the rabbit serum after RFA for the tumor of liver, providing a feasibility of applying hepatocyte-like cells transplantation for liver injury reparation.

Yang Y, Huo JH, Qu B, Zhang MY, Wang ZR.Differentiation of mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by autologous serum after radiofrequency ablation for liver tumor in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4039-4043(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4039(ps).pdf]

0 引言

射频消融技术是近年来肝脏外科的一大进步。对小肝癌治疗基本同手术效果，应用普遍。治疗范围已扩大到大肿瘤治疗,肝功能损害问题明显增多。肝损害可激活机体修复功能,产生、释放多种因子对骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)有诱导分化作用。利用射频消融技术治疗损伤激活骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化,治疗灶的组织框架及对机体持久刺激作用,有利于植入的干细胞趋化损伤区域，爬行替代。可使射频消融技术治疗范围扩大同时减少肝功能损害，为射频消融技术治疗同时进行肝损伤修复研究提供了新思路。

1 材料和方法

设计：以细胞为观察对象，随机对照实验。
单位：西安交通大学第一医院肝胆外科。
材料：实验于2006-09/2007-09 在西安交通大学医学院中心实验室完成。为教育部基因与环境研究重点实验室。试验动物:健康新西兰大白兔,二三月龄，雌雄不限，体质量1.5~2.0 kg，由西安交通大学医学院动物试验中心提供（合格证号：陕动证字08-005号），实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。L-DMEM液体培养基（Hyclone公司），分装，4 ℃保存各用。标准胎牛血清（Hyclone公司），分装，-20 ℃保存各用。胰蛋白酶:购自华美公司，配制为储备液，滤膜过滤除菌,分装，-20 ℃保存；倒置显微镜；荧光显微镜。CO2孵箱Heraeus(上海);超净工作台((SW-CJ-IFD型，苏净集团安泰空气技术有限公司)；流式细胞仪BECTON Dickinson (BD)；细胞荧光标记物购自博士德生物制剂公司；射频机及电极:RF 2000型射频机及10尖锚状电极。美国Radiotherapeutic公司生产。激光扫描共聚焦显微镜(Leica Tcs sp2,Germany)。
设计、实施、评估者：实验设计和主要实施者为第一作者，实施、评估者为第二、三作者，均接受过正规训练。
方法：
射频消融肿瘤治疗模型建立及治疗血清制备：荷瘤种兔包块（西安交通大学第一医院介入中心刘亚民教授馈赠）经病理活检证实为VX2肿瘤后。切取该包块生长旺盛的鱼肉样组织块，用生理盐水冲洗表面血迹，去除结缔组织，剪成大小相近(1 mm×1 mm×1 mm)的瘤组织块，置于RPMI-1640培养液中备用。实验动物术前12 h内禁食不禁饮。采用30 g/L戊巴比妥钠按 30 mg/kg体质量经兔耳缘静脉缓慢注入，麻醉生效后将实验兔仰卧，四肢固定，上腹部剃毛，按外科无菌操作程序消毒手术区皮肤，铺无菌巾，于剑突下约l cm处沿腹白线作一长约3 cm的正中切口，逐层入腹，暴露肝脏右中间叶前段，用示指与拇指轻柔固定肝脏，在距其下缘1.0~1.5 cm处用显微外科直血管钳沿肝包膜下向肝实质中央斜插约1 cm深，并撑开少许，做成一直径为2.0~ 3.0 mm的隧道，取备用的肿瘤组织块植入隧道底部，拔出血管钳，压迫止血，用棉球轻压隧道表

面及入口处至彻底止血，沿植入肿瘤的肝叶表面向腹腔内加入10 mL蒸馏水以杀灭操作过程中可能脱入腹腔的癌细胞，依次缝合切口。术后给青霉素20 万U/只，二三周原位肝肿瘤动物模型即成模。
将兔背部脱毛,置电极板于背部脱毛区,氯胺酮 40 mg/kg、氯丙嗪12.5 mg/kg剂量耳缘静脉施以全身麻醉，无菌条件下开腹暴露肝脏,分别置电极针于肝叶中心,展开电极针控制其直径为20 mm,射频仪起始功率为3周,逐渐增加达30周，10~13 min组抗达100%时,功率自动降为0周停机,灭活肝组织总体积40%,连续缝合关腹,给于抗炎治疗。对比组及实验组分别于术前0 h，术后72 h经颈动脉插管取全血,室温静置1 h,离心提取血清,血清总量一半直接-20 ℃保存备用，另一半经56 ℃水浴灭活30 min后-20 ℃保存备用。
兔BMSCs的分离：取荷瘤新西兰大白兔，氯胺酮按40 mg/kg剂量，耳缘静脉麻醉；无菌操作下以12号骨髓穿刺针刺入兔胫骨骨髓腔，接10 mL注射器(内含 3 000 U/mL肝素0.2 mL)，抽取骨髓5 mL；加入盛有同体积比重1.073 g /mL的淋巴细胞分离液的试管中，以 1 500 r/min，离心20 min:用吸管吸取中间的乳白色有核细胞层，即可进行原代培养接种用。
兔骨BMSCs 的原代培养和传代培养：将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按1×106个细胞的密度接种于25 mL培养瓶内,进一步差速贴壁弃去未贴壁细胞后加入低糖DMEM全培养液(含0.1胎牛血清),于37 ℃,体积分数为0.05 CO2及饱和湿度条件下静止培养;于接种3 d后进行第1次换液,以后隔日换液。原代培养至贴壁细胞铺满整个培养瓶底部,用2.5 g/L胰酶液将贴壁细胞消化分离(37 ℃、3~5 min)。然后按1∶2 比例进行传代接种培养, 并记为P1；传代培养过程中隔日换液,直至贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养孔的底面。再重复以上操作,记为P2,余类推。　　　
射频肿瘤治疗血清对兔BMSCs的诱导作用：体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化:将P2骨髓间充质干细胞分4组,每组3孔，加入12孔细胞培养板内在不同条件下培养诱导。①对照组：含100 mL胎牛血清的低糖DMEM培养液。②射频肝肿瘤治疗血清组：无血清低糖DMEM培养液加入终浓度为300 mL/L射频肝损伤兔治疗血清。③ 射频肝肿瘤治疗血清热灭活组：无血清低糖DMEM培养液加入终浓度为 300 mL/L射频肝肿瘤治疗灭活血清。④生长因子组：含100 mL/L胎牛血清的DMEM 培养液加入肝细胞生长因子20 μg/L及表皮细胞生长因子20 μg/L，每3 d换液1次。细胞培养诱导2周后进行鉴定。细胞培养与诱导过程中,用倒置显微镜观察细胞形态并拍照,观察诱导后骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的情况。
流式细胞仪测定细胞周期：2周取以上各组细胞 2.5 g/L胰酶消化,悬液离心后弃去滤液，每个样本收集约1×106 BM SCs，加入PBS 1mL缓冲液洗涤2次，离心后弃去上清液，再加入PBS 0.5 mL充分吹散混匀。 将细胞悬液加入5 mL 700 mL/L乙醇中, 4 ℃固定过夜。离心半径8 cm,1 200 r/min离心10 min,弃乙醇, PBS洗2次后悬浮于0.5 ml PBS中,加入5 μL Annekin V和和碘化丙啶1 mL (PI终浓度为50 g/L)室温避光反应30 min,上流式细胞仪检测。Multcycie软件处理结果。
免疫荧光法检测肝细胞标志物：取各组分化后的细胞进行免疫荧光法染色检测肝细胞标志物CK18 和白蛋白。过程如下:用磷酸盐缓冲液(PBS)洗去培养液, 40 g/L多聚甲醛固定液固定15 min后洗涤,滴加5%山羊血清封闭液，室温20 min；分别加入鼠抗兔CK18 (1∶200) 或白蛋白(1∶100) 的单克隆抗体(博士德)作为一抗, 4 ℃过夜孵育,PBS 洗涤2 次,再加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶200) 作为检测白蛋白的二抗以及TRITC标记的羊抗鼠IgG(1∶100)作为检测CK18 的二抗(博士德), 孵育60 min,反复洗涤后,用激光扫描共电聚焦显微镜(Leica Tcs sp2,Germany) 观察并拍照。
主要观察指标：①光学显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生长情况。②射频治疗血清、胎牛血清及肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞增殖周期的影响。③肝样分化细胞特征蛋白CK18及白蛋白表达情况。
统计学方法：实验数据以_x±s表示，采用SPSS 11.0 统计分析软件包分析，进t检验，以P < 0.05 具统计学意义。统计学处理由第二作者完成。

2 结果

2.1 BMSCs体外诱导过程的形态学观察 贴壁后的BMSCs在培养初期大多呈现内皮细胞样的梭形或纺锤形,贴壁较紧,可见克隆形成,1 周后可以观察到细胞象成纤维细胞样变长,成漩涡状生长，见图1a,2~ 3周细胞铺满培养板底。取出该细胞P2在0.1胎牛血清低糖DMEM 培养液的对照组及射频肝肿瘤治疗血清热灭活组细胞培养2 周仍保持BMSCs的梭形或纺锤形,贴壁较紧，见图1b。而用含射频肝肿瘤治疗血清组及生长因子组诱导2 周后,梭形或纺锤形细胞逐渐变成肝细胞样类圆形或多角形,核浆比减小,且贴壁能力减弱,换液时诱导孔中细胞减少，见图2 a，图2b。

2.2 流式细胞仪测定细胞周期 对照组BMSCs增殖，S+G2+M期细胞百分数为(23.64±3.1)%，G1/G2为1:2.13，凋亡细胞百分数为2.4%；射频肝肿瘤治疗血清热灭活组BMSCs增殖，S+G2+M期细胞百分数为(27.54±3.2)%，G1/G2为1∶2.03，凋亡细胞百分数为3.4%；射频肝肿瘤治疗血清组S+G2+M期细胞百分数为(44.16±3.7)%，G1/G2为1∶1.85，凋亡细胞百分数为8.71%；生长因子组细胞增殖明显，S+G2+M期细胞百分数为(35±4.3)%，G1/G2为1∶1.53，凋亡细胞百分数为2.27%。射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子对BMSCs的诱导能明显促进细胞的增殖，S+G2+M期细胞百分数明显增高；射频肝肿瘤治疗兔灭活血清及胎牛血清能使兔骨髓MSC生长，但不如射频肝肿瘤治疗兔血清及肝细胞生长因子、表皮生长因子促进细胞的增殖明显。射频肝肿瘤治疗血清组、生长因子组与对照组差异具有显著性意义（P < 0.01）。RFAI组、RFAI组差异具有显著性意义（P < 0.01）。进入S期细胞增多伴有细胞凋亡增加可能与细胞增殖平衡机制有关。
2.3 免疫荧光染色 射频肝肿瘤治疗血清组、生长因子组诱导兔BMSCs分化为肝细胞样类圆形、多角形细胞经免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察可见细胞胞浆中FITC标记的白蛋白表达绿色荧光，胞膜TRITC标记的CK18表达红色荧光，见图3。而未诱导的对照组细胞则呈阴性反应。

3 讨论

射频消融技术可以使肿瘤组织凝固坏死,对小肝癌治疗基本同手术效果[1]，与其他间质治疗如经皮乙醇注射及经皮醋酸注射治疗相比有更好疗效[2],比单纯化疗显著提高患者生活质量[3],临床应用日趋普遍。技术改进[4]、多次治疗使治疗范围扩大到大肿瘤治疗，肝功能损害问题逐渐增多[2, 4]。肝损伤会产各种因子释放诱导骨髓间充质干细胞分化。骨髓间充质干细胞有自我复制和高度增殖的能力,又有多向分化的潜能,利用BMSCs的可获得性、可扩增性及可多向分化性[5],可将BMSCs应用于细胞替代及组织器官再造等治疗方法[6]，其取材容易便于自体移植, 安全性高,为肝脏疾病的细胞移植治疗提供了可利用的细胞库。
已有研究结果表明,骨髓来源的干细胞具有向肝脏干细胞分化的潜能[7],肝脏干细胞具有朝肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力[8]；骨髓来源的干细胞还可以分化为血管内皮细胞，使干细胞存在内环境得到改善，有利于其生存及替代修复。更重要的是,采用患者自身的的骨髓间充质干细胞可以避免组织器官移植后的免疫排斥反应[9]。应用自体治疗血清可避免动物血清引起的变型Creutzfeldt-Jakob disease及牛血清蛋白引起的移植后免疫排斥反应[9-10]。应用成人自体血清或脐血则能很好解决这些问题[9,11-12]。
目前, 国内外学者多采用同肝细胞共培养或肝细胞生长因子为主的多个细胞因子组合来进行诱导分化获取肝样细胞[10,13-16]，肝细胞获取困难并需要较高浓度肝细胞生长因子(20 μg/g)及表皮生长因子(20 μg/ g)，临床自体血清诱导分化实验亦刚刚起步[17-18]，且人们对在体外培养诱导骨髓间充质干细胞的条件掌握尚不成熟，尤其是无血清培养。将临床常用微创治疗同细胞移植结合，可提高疗效并尽可能减少或预防并发症，降低患者痛苦，为后继治疗创造好的条件(如化疗)是一种理想治疗。肝叶大部切除小鼠血清诱导骨髓间充质干细胞可向肝细胞方向分化[19]，给了作者很好的提示，但临床应用受到限制，而射频消融技术治疗恰恰能起到类似肝切处效果，并且肿瘤治疗坏死灶存在能刺激机体免疫力提高[20]。因此本实验在射频消融技术治疗基础上首先提出用射频消融技术兔肿瘤治疗血清做为诱导剂,诱导中发现，单独用300 mL/L兔血清培养液培养骨髓间充质干细胞,细胞形态发生了变化,即细胞贴壁伸出的长触角回缩,有多边形、类圆形变化趋势,细胞贴壁能力减弱[21]。射频肝肿瘤治疗血清热灭活组(RFAI组)、对照组(FCS)骨髓间充质干细胞能保持原有形态增殖，不能向肝样细胞分化。加入肝细胞生长因子和表皮生长因子诱导后,细胞呈肝细胞样圆形、多角形[22]。经流式细胞仪测定细胞周期表明细胞分裂增生较前活跃，射频消融治疗血清组较生长因子组明显。肝细胞表达CK8、CK18等,而白蛋白是公认的肝细胞特异性分泌产物。为进一步鉴定诱导细胞功能,作者用肝细胞标志物CK18 和白蛋白抗体进行免疫光染色。诱导后的细胞CK18 和白蛋白抗体反应阳性,提示其具有肝细胞特性。这表明射频消融血清诱导体系可以使骨髓间充质干细胞向肝细胞样方向分化且具有一定功能。射频消融在机体荷瘤状态激发骨髓间充质干细胞增生、分化机制需进一步研究。
以上结果说明：应用射频消融血清或肝细胞生长因子的培养体系均能有效诱导骨髓干细胞向肝前体细胞分化，由于射频消融治疗血清中成份复杂，含有众多因子及机体应激修复时产生的多种物质(HGF、FGF-4、EGF等)，保留与体内相似的内环境,真实反映机体在射频消融技术治疗时变化，射频消融血清较肝细胞生长因子的培养体系能更有效诱导骨髓干细胞向肝前体细胞分化。外科微创治疗与干细胞组织工程结合，使射频消融技术治疗同时进行肝损伤预防、修复成为可能。为临床肝病患者应用自体MSCs和自体血清诱导肝前体细胞的思路提供切实可行的实验依据。

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