课题背景：目前课题组在间充质干细胞的分离、培养及定向诱导分化为神经干细胞等方面已取得一定成果，“无菌塑料袋分离单个核细胞的研究”（专利号200610033008.3）获河南省医药科技成果奖，现已具备完整的干细胞基础研究体系。

应用要点：①建立了应用四联袋结合无菌接口技术分离脐血干细胞的方法，效果满意，优于试管法。②脐血中加入适量羟乙基淀粉，改良了密度梯度离心法，使混入单个核细胞的红细胞明显减少。③脐血间质干细胞在没有传代培养情况下加入适当细胞因子进行诱导，仍然可得到神经元样细胞，缩短了脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化的时间，节约了成本，减少细胞培养费用。

偏倚或不足：①四联袋还需要进一步改进以提高实验的稳定性。②单个核细胞的接种密度及脐血干细胞诱导分化为神经元样细胞的其他影响因素，培养获得的贴壁细胞是否含有其他异质细胞成分，以及诱导分化的神经元样细胞何时适宜临床移植等问题均有待进一步分析。

1河南省红十字血液中心，河南省郑州市 450053；2郑州大学第一附属医院神经外科，河南省郑州市 450003；3深圳北科细胞工程研究所，广东省深圳市 510075

赵林娜，女，1972年生，河南省滑县人，汉族，1997年河南医科大学毕业，主治医师，主要从事成分血和脐血干细胞基础与临床应用方面的研究。
fjy920309@126.
com

通讯作者：李建斌，副教授，副主任医师，河南省红十字血液中心，河南省郑州市 450053 ljb8938@ 163.com

摘要

背景：研究证明脐血间质干细胞可向神经元样细胞分化，要同时保证脐血间质干细胞的扩增能力与分化潜能，其培养和诱导分化条件的优化显得尤为重要。
目的：分析筛选人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化过程的影响因素。
设计、时间及地点：随机对照实验，于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成。
材料：脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿，平均采血量95 mL。重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司；分离细胞所用的四联袋为山东威高集团公司产品。
方法：取采集6 h内的脐血，采用四联袋密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，以5×109 L-1接种于DMEM/F12培养基中。①细胞因子实验：单独细胞因子组加入20 μg/L B27、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子；细胞因子联合组在此基础上加入5 μg/L重组人表皮生长因子。②红细胞混入量实验：裂解组加入红细胞裂解液1 mL，裂解后红细胞混入量为(0.44±0.13)×108/份；少红细胞组红细胞混入量为（0.51±0.21）×108/份，多红细胞组红细胞混入量为（2.65±1.28）×108/份。③首次换液时间实验：分别于接种后48 h、7 d首次换液。④诱导分化：将碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子共诱导7 d的细胞爬片进行巢蛋白免疫组织化学染色。
主要观察指标：观察不同因素对脐血间质干细胞增殖分化的影响。检测诱导分化后神经干细胞巢蛋白的表达。
结果：培养7 d后，表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导促细胞增殖的效果优于单独应用碱性成纤维细胞生长因子（t=2.880，P < 0.05）；红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组（t=7.332~7.550，P < 0.05），即混入的红细胞总量不大于108/份对细胞增殖无影响；接种后7 d首次换液所获贴壁细胞数明显多于接种后48 h首次换液(P < 0.05)。两种细胞因子共诱导后，神经干细胞巢蛋白呈阳性表达。
结论：在脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中，细胞因子、红细胞混入量及首次换液时间都是重要的影响因素。
关键词：脐血间质干细胞；神经元样细胞；诱导分化；影响因素

赵林娜，李建斌，单泓，段艳丽，焦红亮，宁晓琳，马会娟，杨朋辉，龚桂玲.人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化的诱
导因素[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4049-4053
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4049(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04049-05

收稿日期: 2008-02-28
修回日期：2008-04-02
(54200802270006/ZS·Y)

Influential factors of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells differentiating into neuron-like cells
Abstract

BACKGROUND: Studies have identified that, human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (HUCB-derived MSCs) may differentiate into neuron-like cells, and simultaneously requires to maintain the amplification ability and differentiating potency of HUCB-derived MSCs. It is extremely important to optimize the conditions of culture and differentiation.
OBJECTIVE: To analyze and screen the factors inducing HUCB-derived MSCs to differentiate into neuron-like cells in vitro.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control experiment was carried out in the Blood Components Application Institute of Red-cross Blood Center of Henan Province (Zhengzhou, Henan, China) from August 2006 to May 2007.
MATERIALS: Umbilical cord blood was from the term-delivery fetus in Zhengzhou Hospital of Maternal and Child Health (China), the average blood volume was 95 mL. Recombinant human epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) were purchased from Sigma Company (USA); Quadruple blood bag for the isolation was produced by Shandong Weigao Group (China).
METHODS: Umbilical cord blood samples were collected within 6 hours, and umbilical blood mononuclear cells were separated with quadruple bags by means of density gradient centrifugation. Cytokine trial: single cytokine group was added with 20 μg/L B27 and 10 μg/L bFGF; combined cytokine group was added with 20 μg/L B27, 10 μg/L bFGF and 5 μg/L recombinant human EGF.Erythrocyte interfusion trial: cell lysis group was added with 1 mL erythrocyte lysis liquid, and the quantity of lyzed erythrocyte was (0.44±0.13)×108, while the quantity of few erythrocyte group and many erythrocyte group was (0.51±0.21)×108 and (2.65±1.28)×108, respectively. First medium change trial: the first medium changing time was 48 hours and 7 days following the incubation. Induced differentiation: induced by bFGF and recombinant human EGF, cells were stained with nestin immunohistochemistry.
MAIN OUTCOME MEASURES: The influence of variant factors on the proliferation and differentiation of HUCB-derived MSCs; expression of nerve stem cells nestin after induce differentiation.
RESULTS: At day 7 of the culture, EGF and bFGF contributed to more perfect function than only bFGF in the process of HUCB-derived MSCs proliferating (t=2.880, P < 0.05); the quantity of adherent cells in cell lysis group and many erythrocyte group was obviously lower than that in the few erythrocyte group (t=7.332-7.550, P < 0.05), which indicated that the interfused erythrocytes with quantity of less than 108 had no obvious influence on the proliferation of stem cells. The first medium changing at seven days achieved remarkably more adherent cells compared with at 48 hours (t=3.680, P < 0.05). Induced by two cytokines, the MSCs expressed nestin.
CONCLUSION: Cytokines, quantity of interfusion erythrocytes and first medium changing time are the important factors in the process of HUCB-derived MSCs differentiating into neuron-like cells.

Zhao LN, Li JB, Shan H, Duan YL, Jiao HL, Ning XL, Ma HJ, Yang PH, Gong GL.Influential factors of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells differentiating into neuron-like cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4049-4053(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4049(ps).pdf]

0 引言

间质干细胞是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞、神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞[1]，是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。人脐血间质干细胞具有良好的多向分化潜能、活跃的增殖特性、以及促进造血[2]、体外较易分离培养等特性，日益引起国内外研究者的浓厚兴趣。
越来越多的实验证明人脐血间质干细胞可向神经细胞分化[3-8]，这使神经干细胞用于临床治疗神经系统损伤性疾病成为可能，如何获得大量的神经干细胞供临床应用成为干细胞研究的热点之一。人脐血间质干细胞的培养、增殖、诱导分化受诸多因素影响，本实验就不同细胞因子组合、红细胞混入量、首次换液时间对人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化的影响进行分析。

1 材料和方法

设计：随机对照实验。
时间及地点：于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成实验。
材料：脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿脐带血，取标本前征得产妇及家属同意，产妇体健，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，胎儿无先天性异常，ADA-B抗凝，血量在65~160 mL，平均体积95 mL。试剂与仪器：人淋巴细胞分离液（密度1.077/cm3 ，天津灏洋公司)；DMEM/F12（Gibco)；B27（Sigma)；重组人表皮生长因子（Sigma)；重组人碱性成纤维细胞生长因子（Sigma)；鼠抗人巢蛋白（Sigma)；羊抗鼠IgG1-FITC二抗（Sigma)；自行设计四联袋（山东威高集团公司)；无菌接口机（日本泰尔茂公司)；KX-21型血细胞计数仪（日本东亚公司）；倒置显微镜（Olympus）。
方法：
单个核细胞的分离与培养：将采集6 h内的脐血用无菌接口机与一50 mL空袋相连，离心分出部分血浆致50 mL空袋内，剩余的红细胞悬液内加入6%羟乙基淀粉液10 mL充分混匀，再加入0.9%氯化钠液等倍稀释。淋巴细胞分离液倒入四联袋的主袋内，按2∶1的比例将稀释的脐血缓缓加入盛有淋巴细胞分离液的主袋内，4 ℃1 200 r/min离心 20 min，袋内液体自上而下分为5层，将上2/3的血浆血小板层流入一空袋，血浆血小板层的下1/3、白膜层及淋巴细胞分离液层的上1/3流入另一空袋内，此袋即为富单核细胞溶液。用0.9%的氯化钠液重复洗涤两次后以5×109 L-1接种于含DMEM/F12培养液的 75 mL培养瓶中，加入相应细胞因子，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养，培养7 d后倾去全部液体，以后根据细胞生长情况，每周全量换液一两次，细胞长到80%~90%融合传代。
不同细胞因子组合对细胞增殖分化的影响：将分离的单细胞悬液以5×109 L-1接种于DMEM/F12培养液中，共38份，分为两组：单独细胞因子组18份，加入 20 μg/L B27、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子；细胞因子联合组20份，加入20 μg/L B27、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 μg/L重组人表皮生长因子。培养7 d后倾去全部液体，同时进行细胞计数，记录倒置显微镜下细胞形态。以后根据细胞生长情况，每周全量换液一两次，待细胞长到80%~90%融合后传代培养。
红细胞混入量对细胞生长的影响：将分离制备单个核细胞悬液分为61份，裂解组20份，加入红细胞裂解液(蒸馏水)，控制裂解时间，裂解后0.9%氯化钠液洗涤 1次；少红细胞组25份，多红细胞组16份，均不加红细胞裂解液。用血细胞计数仪计数3组红细胞混入量、有核细胞数，再分别加入20 μg/L B27、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5 μg/L重组人表皮生长因子，以5× 109 L-1接种于含DMEM/F12培养液的75 mL培养瓶中。
首次换液时间对细胞生长的影响：单个核细胞接种于培养瓶后48 h、7 d首次换液，换下的液体置入新培养瓶中继续培养7 d，观察是否仍有贴壁细胞，比较首次换液时间对脐血间质干细胞增殖、分化的影响。
免疫组织化学检测：将10份经10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5 μg/L重组人表皮生长因子共诱导7 d的细胞爬片吸除培养液后，以磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次。 4%多聚甲醛固定30 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，3% H2O2，去离子水孵育10 min，滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育15 min，加鼠抗人Nestin，37 ℃孵育3 h，磷酸盐缓冲液冲洗3次。滴加生物素化二抗工作液， 37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，DAB显色剂显色，充分冲洗后加苏木精约 5 min使细胞核显色，中性树胶封固后置于光镜下观察，选择10个非重叠视野计数阳性细胞数（×200）；以仅加入20 μg/L B27作为未诱导对照组。
主要观察指标：①细胞因子对细胞增殖分化的影响。②红细胞混入量对细胞增殖分化的影响。③首次换液时间对细胞增殖分化的影响。④免疫组织化学检测结果。
设计、实施、评估者：设计、评估为第一、二作者，实施者为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：由第五作者采用SPSS10.0软件进行统计分析，实验数据均以_x±s表示,采用独立样本t检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 细胞因子对细胞增殖分化的影响 细胞因子联合组可明显促进贴壁细胞增殖(图１)。短时间即可形成大的细胞克隆，缩短原代培养时间，培养7 d后贴壁细胞数明显高于单独细胞因子组(P < 0.05)，见表1。

2.2 首次换液时间对细胞增殖分化的影响 接种后7 d首次换液的样本中尽管混杂较多的破骨样细胞，但经多次换液后破骨样细胞逐渐被去除，获得的贴壁细胞数明显多于接种后48 h首次换液（P < 0.05）。细胞培养至1周后，大多数细胞形态发生明显变化（图2）；2周后转变为类神经元形态，出现双极及复杂的多极细胞，突起末端出现一级和二级分支，类似于树突，部分神经元形成网状（图3）；长至3周时神经元样细胞在形态上并未发生明显改变（图4）。

2.3 免疫组织化学检测结果 经10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5 μg/L重组人表皮生长因子诱导7 d后，细胞巢蛋白阳性率为（51.87±4.56）%，巢蛋白表达位于神经干细胞的细胞质，免疫组织化学染色后呈棕黄色（图5）；未诱导对照组无巢蛋白阳性细胞出现。提示诱导7 d后的人脐血间质干细胞可以分化为神经干细胞。

2.4 红细胞混入量对细胞增殖分化的影响 红细胞过多往往影响细胞贴壁，增殖缓慢，但红细胞在不大于108/份的情况下，对干细胞增殖不产生明显影响。红细胞裂解液组细胞增殖缓慢，部分细胞不能形成大的细胞集落，原代培养时间较长。培养7 d后红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组(P < 0.05)，见表2。

3 讨论

神经干细胞在中枢神经疾病的治疗作用已不仅限于一些动物模型，神经干细胞治疗人中枢神经损伤性疾病在临床以取得了可喜的成就。脐血作为间质干细胞的来源之一，与骨髓相比含量更为丰富，易于采集与保存，来源充足，细胞更原始、扩增能力更强、免疫原性更 弱[9-10]，传播病原微生物率更低，且不存在伦理问题等优点。但在间质干细胞培养、扩增、分化过程中，既要保证细胞的扩增能力，又要保证细胞的分化潜能，间质干细胞培养、诱导分化条件的优化显得十分重要。本实验利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法对人脐血间质干细胞进行分离、培养，诱导分化，对几种影响因素进行比较分析。
3.1 生长因子在人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化中的作用 成纤维细胞生长因子作为丝裂原，可促进细胞分裂增殖，酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子是少突胶质细胞、施万细胞和星形胶质细胞的有丝分裂原，也可促进各种神经组织前体细胞的增殖和分化。碱性成纤维细胞生长因子在神经干细胞的增殖、分化方面起着非常重要的调节作用[11]，其添加浓度和效应密切相关[12]，碱性成纤维细胞生长因子浓度在10.0~20.0 μg/L时，细胞增殖旺盛，随着碱性成纤维细胞生长因子增加，细胞增殖速度反而下降[13]。表皮生长因子在干细胞向神经细胞分化时可促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活，在体外实验中低剂量可诱导细胞生长甚至具有丝裂原样作用[14]。不同浓度碱性成纤维细胞生长因子可以使神经前体细胞增殖或分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞，而表皮生长因子在神经前体细胞后发育阶段促进增殖和分化功能[15]。
本实验中，与单纯碱性成纤维细胞生长因子对照组比较，表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合组其细胞增殖加快，贴壁细胞率提高，40%的样本获得神经元样细胞，明显高于对照组（26%）。在表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子联合诱导下，细胞增殖快，而且贴壁细胞多，原代培养时间短于对照组；培养24 h内间质干细胞即由小圆细胞变为椭圆，48 h后胞体变大，向两极伸出突起（6 d），2周左右出现双极，复杂的多极细胞，突起末端出现一级和二级分支，类似于树突，部分神经元形成网状，进一步证明人脐血间质干细胞在体外适当的培养条件下可以分化为神经元样细胞[16]。大部分样本诱导10 d形态发生明显改变，2周后细胞增殖变慢，部分样本培养2周后胞体边缘折光减弱，也有部分样本可传至3代，总的来说脐血中间充质干细胞特性个体差异较大。本研究的创新点是四联袋分离的人脐血间质干细胞接种于培养瓶同时加入细胞因子进行诱导、分化，而以往文献报导大多先对人脐血间质干细胞培养、扩增，传代后再进行诱导分化[4，16]；这说明人脐血间质干细胞在没有培养扩增的情况下加入适当的细胞因子进行诱导，仍然可得到神经元样细胞，缩短其向类神经元诱导分化时间，节约成本，减少细胞培养费用。
3.2 红细胞对人脐血间质干细胞诱导分化为神经元样细胞过程的影响 在分离、纯化单个核细胞的过程中受诸多因素影响，如脐血样本的差异、离心参数选择、操作技术等，有时会混入较多红细胞，如果红细胞混入过多，有核细胞收率一般也不理想，倒置显微镜下观察贴壁细胞少，被大量红细胞覆盖，即使换液后细胞也增殖缓慢。在红细胞不大于108/份的情况下，对干细胞增殖不产生明显影响，首次换液后，红细胞可被去除。
本实验中，红细胞裂解液组虽然可部分去除红细胞，但操作过程不宜控制，加入过多或裂解时间过长，都会造成部分单个核细胞的细胞膜损伤，细胞增殖缓慢，大部分细胞不能形成大的细胞集落，原代培养时间较长；但在红细胞混入过多可能会影响干细胞增殖的情况下，可以少量应用红细胞裂解液（不大于1 mL)，并快速吹打，快速终止裂解。
3.3 首次换液时间的选择 脐血中的间质干细胞含量很低，不同脐血个体差异较大，有的样本在培养过程细胞成悬浮状；有的样本虽有少部分细胞贴壁，可能因为细胞间不能形成“细胞社会”，细胞增殖缓慢或停止生长。并非每份样本都能获得间质干细胞，这与文献报道基本一致[17-19]。首次换液时间是影响原代培养的一个关键因素，换液过早会浪费细胞，过晚既浪费时间又会使杂质细胞贴壁，细胞难以纯化。
本实验中，单个核细胞培养7 d后，换下的液体置入新培养瓶中继续培养，不再有贴壁细胞出现，因此选择首次换液时间为7 d，可以获得更多的贴壁细胞；虽然样本中可能混杂较多的破骨样细胞，但经多次换液后（换液不可过于频繁，培养基的酸性环境有助于消除破骨样细胞[20]）破骨样细胞逐渐被去除。所以首次换液时间以7 d为宜，可以获得更多贴壁细胞。
本实验为人脐血间质干细胞的进一步应用提供实用的分离培养方法。在诱导分化为神经元样细胞过程中，培养诱导多长时间最适合临床移植，还有待进一步研究。

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