课题背景：课题项目名称“含IL-10基因的rADV载体体外转染MSC对内毒素休克保护作用的动物实验研究”，目前已经结题，取得的研究成果包括：①实现了携带IL-10基因的腺病毒载体对骨髓基质细胞的体外成功转染，并可在体外高效表达IL-10。②体内实验达到了目的基因在宿主体内的稳定、高效表达，并呈现出类似炎症诱导及自适应的表达特征，实现了对肿瘤坏死因子α和IL-6水平的下调作用，提高了动物存活率。③本课题的初步探讨表明：利用含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒体外转染骨髓基质细胞后，回输实现对内毒素休克的保护作用在动物实验中具有可行性。

应用要点：腺病毒作为IL-10载体，以往研究多直接将其输入体内，导致转染效率受限制，且表达时间短；骨髓基质细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，所携外源性基因进入体内后可获得较长时间的高效、稳定表达。实验结合两者优点，应用细胞因子基因治疗技术先将外源性IL-10基因体外导入骨髓基质细胞，然后回输宿主，使宿主体内能持续分泌一定量的IL-10以下调肿瘤坏死因子α和IL-6的表达，从而起到对内毒素休克的保护作用。

术语解析：内毒素休克是指大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1，6，8和肿瘤坏死因子α、组胺、5羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质，这些物质作用于小血管造成其功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，患者产生休克。

深圳市宝安区人民医院，1烧伤科，2检验科，广东省深圳市 518101；
3中山大学附属第一医院烧伤科，广东省广州市 510080

李新强★，男，1974年生，广东省梅州市人，汉族，2005年中山大学附属第一医院毕业，硕士，副主任医师，主要从事烧伤、感染免疫方面的研究。baoan721@126.
com

深圳市科技和信息局科研基金(JH200505300509A）*；
深圳市宝安区科学技术局科研基金（2005104）*

摘要

目的：机体内前炎症递质肿瘤坏死因子α、白细胞介素6与抗炎症递质白细胞介素10之间的平衡出现严重紊乱，可导致内毒素休克及多脏器功能衰竭。实验拟进一步探讨含大鼠白细胞介素10基因重组复制缺陷型腺病毒体外转染骨髓基质细胞后，内毒素休克动物模型导入的白细胞介素10基因表达及其对机体肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平的调节。
方法：实验于2006-05/2007-10在中山大学附属第一医院外科实验室完成。①材料：清洁级SD雌鼠100只，选取10只用于骨髓基质细胞的分离培养，剩余90只随机数字表法分为细胞转染组、模型组、正常组，30只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒由中山大学附属第一医院烧伤外科朱家源教授惠赠。内毒素Escherichia coli 0111：B4为美国Sigma公司产品。②实验方法：将含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒复苏后，加入到贴壁生长达80％的第3代骨髓基质细胞中，将转染后细胞、未转染细胞按5×105/孔接种，采用ELISA法和RT-PCR法检测体外白细胞介素10的含量变化。细胞转染组与模型组大鼠均经左侧股静脉注射内毒素 5 mg/kg建立休克模型，10 min后细胞转染组在同侧股静脉注射转染后培养12 h的5×108 L-1骨髓基质细胞0.5 mL，模型组与正常组均注射未转染的5×108 L-1骨髓基质细胞0.5 mL，分别于0，3，6，12，24，36，48 h采用ELISA法检测体内各组大鼠外周血清白细胞介素10、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平，并记录以上各时相点大鼠存活数。细胞回输48 h后，组织病理学检测大鼠肝、肺、肾的变化。
结果：①体外白细胞介素10的表达：体外转染后的骨髓基质细胞培养上清中可检测到白细胞介素10的表达，表达高峰位于转染后36 h，于560 bp处显示凝胶电泳条带；未经转染的骨髓基质细胞不表达白细胞介素10。②体内白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达：与模型组比较，转染后3，6，12，24，36，48 h细胞转染组外周血清白细胞介素10水平均显著上升（t=15.51~30.98，P均 < 0.05），肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平均显著下降（t=14.78~36.75，P均 < 0.05；t=12.49~38.14，P均 < 0.05）。③大鼠存活情况：细胞回输后48 h，细胞转染组大鼠存活率为50％，明显高于模型组20％（χ2=5.93，P < 0.05）。④组织病理学观察：模型组肝细胞肿胀、空泡样变性、汇管区大量炎性细胞浸润，中央静脉内有血栓形成，可见点片状肝窦结构被破坏；肺呈间质性肺炎改变，较多单核和中性粒细胞浸润，小血管壁内充血，局部可见坏死小灶；肾间质充血，肾小球体积增大，近曲小管上皮细胞肿胀、玻璃样变。细胞转染组肝、肺、肾损伤均明显减轻。
结论：进行体外转染的骨髓基质细胞回输后，其所携带的白细胞介素10基因可实现体内外的高水平表达，对内毒素休克时肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平起到预期的下调作用，减轻了机体的炎症反应程度，并有效保护肝、肺、肾等主要脏器。
关键词：转染；基因治疗；细胞因子；内毒素休克；腺病毒；骨髓基质细胞

李新强，王燮衡，郭燕妮，朱家源，文杏珠，胡检，陈武鹏，张显文．白细胞介素10基因体外转染大鼠骨髓基质细胞对内毒素休克的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4054-4059
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4054(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)21-04054-06

收稿日期：2007-11-07 修回日期：2008-01-27 (07-50-11-6121/ZS·Q)

Effect of bone marrow stromal cells in vitro transfected with interleukin-10 gene on endotoxin shock in rats

Abstract

AIM: It can cause endotoxin shock and multiple organ dysfunctions when the balance between anterior inflammation transmitter tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6 and anti-inflammation transmitter IL-10 has become serious disorder in the body. This study aimed to investigate the expression of IL-10 gene which is introduced into animal models of endotoxin shock by bone marrow stromal cells transfected in vitro with replication-deficient rat IL-10 recombinant adenovirus, and study the changes in TNF-α and IL-6 levels in the models.　
METHODS: The experiment was performed at the laboratory of Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from May 2006 to October 2007. Ten rats of 100 clean female Sprague Dawley rats were selected for the isolation and culture of bone marrow stromal cells, and the remainings were divided into a cell transfection group, a model group and a normal group by random digits table method, with 30 rats in each group. The disposal to animals during the experiment was accorded with animal ethical standards. Replication-deficient rat IL-10 recombinant adenovirus was provided by professor Zhu from Department of Burn of First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. Endotoxin Escherichia coli 0111: B4 (Sigma, USA) was used in the study. Replication-deficient rat IL-10 recombinant adenoviruses after recovery were added to the bone marrow stromal cells of the 3rd generation, which had been adhered to the flask more than eighty percent. The cells transfected and untransfected were all inoculated according to 5×105 per hole. The changes in IL-10 levels were detected by enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) methods. The rat models of shock were established in the cell transfection group and model group by injecting 5 mg/kg endotoxin into left femoral vein. Ten minutes later, rats in the cell transfection group were injected with 0.5 mL of bone marrow stromal cells (5×108 L-1) into the left femoral vein which had been ransfected and cultured for 12 hours. Rats in the model group and normal group were all injected with 0.5 mL of bone marrow stromal cells (5×108 L-1) into the left femoral vein which had not been transfected. The serum IL-10, TNF-a and IL-6 levels of rats in each group were measured by ELISA at 0, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 hours, and the survival rats at the same time point were recorded. After 48-hours reinfusion, histopathological changes in liver, lung and kidney of the rats were tested.
RESULTS: IL-10 expression could be checked in culture supernatant of bone marrow stromal cells transfected in vitro. The peak expression located at 36 hours after transfection. A band of 560 bp showed in agar gel electrophoresis. The bone marrow stromal cells, which had not been transfected, did not express IL-10. Compared to the model group, the serum IL-10 levels in the cell transfection group increased significantly at 3, 6, 12, 24, 36 and 48 hours after transfection（t =15.51-30.98，P < 0.05）. Serum TNF-α and IL-6 levels in the cell transfection group decreased significantly at the same time（t =14.78-36.75，P < 0.05； t=12.49-38.14，P < 0.05）. After 48-hours reinfusion, the survival rate in the cell transfection group was (50%) significantly higher than in the model group (20%) (χ2=5.93，P < 0.05) . The hepatocyte in the model group showed cell swelling and bubble-like degeneration, inflammatory cells infiltrated in portal area, thrombus formed in central vein, point and flake of liver sinus were destroyed. The lung showed interstitial pneumonia, and there were many monocytes and mononclear cells infiltration, hyperemia in wall of small vessels, and visible local small necrosis focus. Renal interstitium was hyperemic, the glomerular volume became bigger, and renal tubular epithelial cells showed swelling and glassy degeneration. The damages of liver, lung and kidney in the cell transfection group were not serious like those in the model group.
CONCLUSION: After reinfusing with bone marrow stromal cells, which had been transfected in vitro, IL-10 gene carried by bone marrow stromal cells can highly express IL-10 inside or outside the body, and play a decreasing effect on TNF-α and IL-6 levels, when the body is facing endotoxin shock. This lightens the severity of acute inflammatory response, and effectively protects main organs such as lever, lung and kidney.

Li XQ, Wang XH, Guo YN, Zhu JY, Wen XZ, Hu J, Chen WP, Zhang XW.Effect of bone marrow stromal cells in vitro transfected with interleukin-10 gene on endotoxin shock in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4054-4059 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4054(ps).pdf]

0 引言

临床上因严重感染致内毒素血症而发生全身性炎症反应综合征时，常难以有效控制，死亡率高达30%~70%[1-2]。研究表明：此时机体内前炎症递质肿瘤坏死因子α、白细胞介素6与抗炎症介质白细胞介素10之间的平衡出现严重紊乱是其主要原因，可导致内毒素休克（Endotoxin shock）及多脏器功能衰竭等失控性后果[3-4]。白细胞介素10主要由Th2细胞、活化的单核-巨噬细胞和上皮细胞产生，具有维持机体免疫反应稳定，抑制病原体引起对机体有害炎症反应的功能[5-6]。本实验利用He等[7]改进的载体系统AdEasy构建的含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒（Replication-deficient rat IL-10 recombinant adenovirus）体外转染骨髓基质细胞，回输内毒素休克动物模型，观察导入的白细胞介素10基因的表达及其对机体肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平的调节，探讨这一细胞因子基因治疗方法对内毒素休克动物模型的保护作用。

1 材料和方法

设计：随机对照细胞观察。
单位：深圳市宝安区人民医院烧伤科、检验科，中山大学附属第一医院烧伤科。
材料：实验于2006-05/2007-10在中山大学附属第一医院外科实验室完成。清洁级SD大鼠100只(购自中山大学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK（粤）2004-0011)，七八周龄，雌性，体质量200~250 g，选取10只用于骨髓基质细胞的分离培养，剩余90只随机数字表法分为细胞转染


组、模型组、正常组，30只/组，实验过程中对动物的含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型处置符合动物伦理学标准。腺病毒由中山大学附属第一医院烧伤外科朱家源教授惠赠，滴度5×1010pfu/mL，-80 ℃保存。内毒素Escherichia coli 0111：B4（美国Sigma公司）；两步法RT-PCR试剂盒（爱思进生物技术（杭州）有限公司），白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6 ELISA试剂盒（爱思进生物技术（杭州）有限公司）；大鼠白细胞介素10的上、下游引物均由上海申友生物技术有限公司合成。
设计、实施、评估者：设计为第一、四作者，实施与结果评估为全体作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
骨髓基质细胞的分离与传代培养：按文后参考文献文献[8]分离、传代培养SD大鼠骨髓基质细胞，传至3代时用于实验。
骨髓基质细胞基因体外转染：将含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒复苏后，加入到贴壁生长达80％的第3代骨髓基质细胞中（感染复数MOI＝50），轻轻混匀，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养2 h后，换用含20%胎牛血清的新鲜DMEM-LG培养液，按5×105/孔将转染后的骨髓基质细胞、未转染的骨髓基质细胞接种于96孔细胞培养板，各设立7组， 6孔/组，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养3d。分别于转染后0，6，12，24，36，48，72 h采用双抗体夹心法以ELISA试剂盒检测板孔上清的白细胞介素10含量变化，按说明书步骤操作，酶标仪测定A450。
转染后骨髓基质细胞体外白细胞介素10 mRNA表达RT-PCR法检测：①骨髓基质细胞总RNA提取：转染后体外培养12 h，吸除转染及未转染的骨髓基质细胞各孔培养液，加入1 mL Trizol试剂，充分混匀后，室温放置10 min，加入氯仿400 μL，振荡15 s，置室温3 min后，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上层液转入Eppendorf管，加入等量异丙醇混匀后室温放置10 min，4 ℃、 12 000 r/min离心10 min，70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥 10 min，加入DEPC处理过ddH2O，测A值，调整RNA浓度为1 g/L，-80 ℃保存备用。②RT-PCR反转录反应：取骨髓基质细胞总RNA 2 μL，加入2 μL 10×反转录缓冲液、4 μL 25 mmol/L MgCl2、2 μL 10 mmol/L dNTP、 1μL Olig dT-Adaptor Primer、40 U/μL RNA 酶抑制剂 0.5μL、200 U/μL M-MuLV反转录酶1μL，加水补足至20μL 体系。反转录反应条件：37 ℃ 10 min、42 ℃ 1 h、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。③聚合酶链式反应：取RT产物3 μL用于PCR 扩增白细胞介素10目的基因，PCR反应条件：2μL 10×反转录缓冲液、25 mmol/L MgCl2 1.5μL、5 U/μL Taq酶0.3μL。上游引物序列为5’-GGG GTA CCC CAT GCT TGG CTC AGC ACT G-3’，下游引物序列为5’- CCC　AAG　CTT　GGG　TCA　ATT　TTT　CAT　TTT　GAGT-3’， 上、下游引物各1μL，补足水至 20 μL。PCR反应参数：94 ℃ 3 min、54 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1 min/5个循环、94 ℃ 30 s、64 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1 min/30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物大小为561 bp。取5μL产物在1 %琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
内毒素休克模型的建立与细胞回输：细胞转染组与模型组大鼠均经左侧股静脉注射内毒素5 mg/kg建立休克模型，正常组仅注射等量生理盐水。造模10 min后，细胞转染组在同侧股静脉注射转染后培养12 h的5× 108 L-1骨髓基质细胞0.5 mL，模型组与正常组注射未转染的5×108 L-1骨髓基质细胞0.5 mL。
外周血清白细胞介素10、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平检测及存活情况：细胞回输后，分别于0，3，6，12，24，36，48 h经右股静脉抽血1 mL，并回注等量生理盐水，采用双抗体夹心法以ELISA试剂盒检测各组大鼠外周血清白细胞介素10、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平，按说明书步骤操作，酶标仪测定A450，并记录以上各时相点大鼠存活数。
组织病理学检测：处死细胞转染组和模型组细胞回输48 h后仍存活的大鼠，取肝、肺、肾标本，10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，常规苏木精-伊红染色，光镜观察。
主要观察指标：①转染后骨髓基质细胞体外白细胞介素10的表达。②细胞回输后不同时相点各组大鼠体内白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达。③大鼠存活情况。④组织病理学观察。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.0软件进行统计处理，计量资料以_x±s表示，行t检验分析；计数资料以频数记录，行χ2检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 各组30只大鼠均进入结果分析，中途无脱落。
2.2 转染后骨髓基质细胞体外白细胞介素10的表达 含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒转染骨髓基质细胞后0，6，12，24，36，48，72 h，白细胞介素10表达水平分别为0，（54.0±8.5），（153.4±26.4），（290.9±29.3），（467.2±40.0），（532.5±53.5），（568.4±56.8）ng/L；未转染的骨髓基质细胞不表达白细胞介素10。
2.3 转染后12 h骨髓基质细胞体外白细胞介素10 mRNA的转录表达 骨髓基质细胞经含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒转染后，于560 bp处显示条带；未转染的骨髓基质细胞未有显示。见图1。

2.4 细胞回输后不同时相点各组大鼠体内白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达水平 见表1~3。
2.5 细胞回输后不同时相点各组大鼠存活情况 细胞回输后48 h，细胞转染组大鼠存活率为50％，模型组为 20％，组间比较差异有显著性意义（χ2=5.93，P < 0.05），见表4。
2.6 组织病理学观察
2.6.1 肝组织病理学改变 细胞回输48 h后，模型组（图2a）肝细胞肿胀、空泡样变性、汇管区大量炎性细胞浸润，中央静脉内有血栓形成，可见点片状肝窦结构被破坏；细胞转染组（图2b）肝细胞肿胀、空泡样变性程度减轻，汇管区炎性细胞浸润少，未见明显肝窦结构破坏。
2.6.2 肺组织病理学改变 细胞回输48 h后，模型组（图3a）肺呈间质性肺炎改变，肺泡壁充血增厚，较多单核和中性粒细胞浸润，小血管壁内充血，肺泡腔少量渗出物，局部可见坏死小灶；细胞转染组（图3b）间质性肺炎改变轻，较少单核和中性粒细胞浸润，肺泡腔无渗出物，未见坏死小灶。
2.6.3 肾组织病理学改变 细胞回输48 h后，模型组（图4a）肾脏呈急性炎症改变，肾间质充血，肾小球体积增大，内皮细胞和系膜细胞增生及较多单核和中性粒细胞浸润，球囊变狭，近曲小管上皮细胞肿胀、玻璃样变，部分细胞脱落；细胞转染组（图4b）肾脏病变明显减轻，肾小球增大不明显，可见毛细血管袢，球囊无狭窄，近曲小管上皮细胞轻度肿胀。

3 讨论

内毒素休克和多脏器功能衰竭是全身性炎症反应综合征进展过程中的严重阶段[9]，往往预后不良，临床上至今仍未找到有效的防治手段。研究认为：肿瘤坏死因子α和白细胞介素6是全身性炎症反应综合征发生中细胞因子级联反应的启动及致死的效应细胞因子，同时肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平也被认为是反映患者严重程度的标志[10-12]；及时下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的水平，可对机体过度炎症反应时起到一定的保护作用[11-13]。白细胞介素10又名“细胞因子合成抑制因子（CSIF）”，广泛抑制多种促炎症介质的合成包括肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，在调节机体抗炎反应中起到关键作用[5,14-15]。目前已有将之应用于严重感染病例的报道，但其直接应用时存在半衰期过短，需要连续、大剂量用药，很难保持稳定的血药浓度以及副作用显著等缺点[5,15]。应用细胞因子基因治疗技术将白细胞介素10基因作为目的基因导入具有多向分化潜能和强大增殖能力的骨髓基质细胞[16-17]，回输后在宿主体内获得较长时间高效、稳定、呈炎症诱导和自适应的表达[6]，可望克服白细胞介素10直接应用的诸多缺点。
腺病毒是目前基因治疗研究中使用较为广泛，技术操作较为成熟的载体之一，具有感染细胞范围广、效率高、不受细胞周期限制的特点[18]。用于基因治疗的腺病毒一般都是缺失E1和E3区基因的复制缺陷性2型或5型重组病毒，在不表达E1功能的细胞中无法复制，避免了腺病毒对靶细胞及宿主机体的损害，安全性好，又能达到目的基因的高效转移[19-20]。基于这些突出优点，本实验选用了这一载体系统构建的含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒，应用RT-PCR的检测表明转染组转染后12 h的骨髓基质细胞可于体外转录表达白细胞介素10 mRNA，并可检测到培养上清中高水平的白细胞介素10，约于36 h达到表达高峰并持续至72 h之后，证实利用含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒能成功地将白细胞介素10基因导入骨髓基质细胞中并实现体外的表达。
体内48 h实验中：细胞转染组和模型组在LPS注射 3 h后外周血清白细胞介素10、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平迅速升高，和模型组相比，细胞转染组白细胞介素10水平上升幅度明显较大，体内白细胞介素10水平明显较高并且持续时间较长，但与模型组白细胞介素10水平变化趋势基本一致，而与体外培养情况比较则出现了表达高峰的前移（位于12 h）；细胞转染组肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平则明显较低，其上升幅度较模型组小，但下降明显迅速，细胞转染组48h的存活率 （50％）高于模型组（20％）；组织病理学观察也表明细胞转染组肝、肺、肾的急性损伤程度明显较模型组轻。实验结果说明：进行体外转染的骨髓基质细胞回输后，其所携带的白细胞介素10基因可实现体内的高水平表达，并呈现出炎症诱导及自适应的表达特征，对内毒素休克时肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平起到预期的下调作用，减轻了机体的炎症反应程度和有效保护肝、肺和肾等主要脏器，达到了对内毒素休克动物模型的保护作用，动物存活率明显提高。
本实验结果初步表明：利用含大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒体外转染骨髓基质细胞后，回输实现对内毒素休克的保护作用在动物实验中具有可行性。然而，其具体的量效关系，以及如何在临床上实现等问题还有待深入探讨。

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