体外培养基中加入细胞生长因子诱导大鼠骨髓单个核细胞向内皮细胞的分化*★

陈文娜1，李大勇2 ，李曦明1，曲静1，马贤德1，孙宏伟1

课题背景：课题“疏肝活血法促血管生成治疗肢体缺血性疾病的实验研究”由国家自然科学基金项目资助（面上项目，青年科学基金项目）。大量研究表明,一类来源于骨髓、能增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,不仅参与胚胎发育过程中的血管发生,而且在出生后具有促进新生血管生成及损伤血管修复、改善内皮功能等作用。这一发现对治疗四肢缺血性疾病及血管再生将发挥重要作用。目前本课题组已通过对骨髓内皮祖细胞的体外诱导研究,初步证实了骨髓内皮细胞能在体外有效培养扩增和诱导分化,并保持血管内皮细胞的主要生物学特性,提供了用于组织工程血管和细胞移植研究的初步条件。

应用要点：文章在骨髓内皮细胞的培养过程中,充分利用其贴壁生长的特点,使纯化、扩增、诱导同步完成, 应用Ficoll 密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞, 同时通过血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导和预涂纤连蛋白促使细胞贴壁并向内皮细胞分化。不需要对细胞进行免疫学处理,也不需要使用流式细胞仪,在培养过程中进行纯化和诱导,对细胞的生理功能影响更小,为骨髓内皮细胞的功能研究创造了便利条件。

相关链接:体外因子的刺激能诱导骨髓内皮祖细胞增殖、分化、迁移和血管形成，在成年机体的血管新生中起关键作用。通过免疫磁珠、生物素-抗生物素亲和吸附、流式细胞术及单抗铺展贴壁等细胞分选术, 可广泛开展骨髓细胞的分离纯化。然而这些方法虽然能得到纯度高的细胞, 但操作复杂而且费用昂贵, 不适合外周血及骨髓内皮祖细胞的分离。因此，如何建立有效的内皮祖细胞体外培养体系，提高内皮祖细胞扩增数量，同时又可保持其低分化状态是目前研究中迫切需要解决的问题。

1辽宁中医药大学，辽宁省沈阳市 110032；2辽宁中医药大学附属第一医院，辽宁省沈阳市 110032

陈文娜★，女，1973年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2005年辽宁中医药大学毕业，硕士，讲师，主要从事中西医结合调节机体免疫功能方面的研究。cwn1992@sohu.
com

国家自然科学基金资助项目（30600843）：疏肝活血法促血管生成治疗肢体缺血性疾病的实验研究*

背景：内皮祖细胞在骨髓中的含量高于外周血，但也仅占骨髓单个核细胞的1%。因此，在一般实验室培养过程中也需要解决提高内皮祖细胞体外扩增数量并保持其低分化状态的问题。
目的：观察在含胎牛血清的M199培养基中加入血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导内皮祖细胞的定向分化能力。
设计、时间及地点：以细胞为观察对象的开放性实验，于2007-09/2008-02在辽宁中医药大学教学实验中心bsl-2级实验室完成。
材料：体质量（200±20）g的健康成年Wistar大鼠。
方法：无菌采集健康Wistar大鼠股骨骨髓，应用Ficoll 密度梯度离心的方法获得单个核细胞, 加入含胎牛血清+肝素+血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199实验培养液和不含诱导生长因子与肝素的M199培养液为对照组。
主要观察指标：诱导骨髓细胞向内皮样细胞生长过程中，应用表面抗原免疫细胞化学染色鉴定细胞，以Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光实验鉴定培养细胞向内皮细胞分化的程度。
结果：贴壁细胞培养诱导后具有内皮细胞的形态学特征，细胞呈上皮细胞样铺路石状贴壁生长，贴壁时间相对缓慢。加入M199实验培养液诱导后的第9天Ⅷ因子、CD31阳性表达的细胞分别为（55.1±7.2）%、（45.6±5.8）%，Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率为（78.2±5.4）%，提示为正在分化的内皮祖细胞。对照组相关抗原表达阴性，提示为分化早期的骨髓细胞。
结论：结果显示骨髓单个核细胞培养出可稳定扩增的内皮祖细胞，在体外特殊诱导环境下定向分化为内皮样细胞，且效果优于对照组。
关键词：骨髓单个核细胞；内皮祖细胞；分化

陈文娜，李大勇，李曦明，曲静，马贤德，孙宏伟.体外培养基中加入细胞生长因子诱导大鼠骨髓单个核细胞向内皮细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4065-4068
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4065(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04065-04

In vitro differentiation of rat bone marrow monocytes into endothelial cells induced by adding cell growth factors in the medium

BACKGROUND: The endothelial progenitor cells (EPCs) in bone marrow are more excessive than those in peripheral blood monocytes, but EPCs only hold 1% of all the monocytes in bone marrow. So it is an urgent problem to amplify the quantity of EPCs in vitro and keep those cells in poorly differentiated status.
OBJECTIVE: To investigate the oriented differentiation capacity of EPCs by the addition of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in M199 medium containing fetal bovine serum (FBS).
DESIGN, TIME AND SETTING: From September 2007 to February 2008, an open trial subjected as cells was carried out in the Center of Teaching and Researching (bsl-2 laboratory) of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Shenyang, Liaoning, China).
MATERIALS: Healthy adult Wistar rats weighing (200±20) g were adopted.
METHODS: Femoral bone marrow of adult Wistar rats was gathered in germ free. Mononuclear cells in the middle layer were collected by Ficoll discontinuous gradient centrifugation, and the cells were suspended and cultured in M199 medium supplemented with VEGF and bFGF, while those in M199 without growth factor and heparin and were taken as control group.
MAIN OUTCOME MEASURES: During the induction of bone marrow monocytes into endothelioid cells, surface antigen cytochemical staining was applied to identify various cells. The differentiation degree of the cultured cells into endothelial cells was calculated by Dil-ac-LDL and FITC-UEA-1 double immunofluorescent staining.
RESULTS: After the culture and induction, the cells represented the morphology identical with the endothelial cells, they adhered gradually and grew in a shape of paving stone. At day 9 after the M199 was added, the expression rates of factor Ⅷ and CD31 were (55.1±7.2)% and (45.6±5.8)%, respectively. EPCs were characterized as adherent cells (78.2±5.4)% positive for Dil-ac-LDL and FITC-UEA-1, which showed the differentiation processes of EPCs were taking place. In the control group, the cells were negative for the related antigen, indicating the early differentiated bone marrow cells.
CONCLUSION: Rat bone marrow EPCs can be cultured and amplified from mononuclear cells, then are induced into endothelial cells successfully in vitro, and the outcome is better than the controlled cells in this study.

Chen WN, Li DY, Li XM, Qu J, Ma XD, Sun HW. In vitro differentiation of rat bone marrow monocytes into endothelial cells induced by adding cell growth factors in the medium.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4065-4068(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4065(ps).pdf]

1997年由Asahara等[1]首次分离并证实人类出生后的外周循环血液中,存在能分化成为血管内皮细胞的血管内皮祖细胞，也称为成血管细胞。在胚胎发育早期血管内皮祖细胞和造血干细胞由共同的前体细胞(hemangioblast造血/成血管细胞)分化而来。研究表明在成体中内皮祖细胞来自于骨髓[2-3]。在一定的体外因子刺激下，内皮细胞和造血干细胞的祖细胞能诱导、转化、扩增为各自的成熟细胞，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等一些生长因子能诱导内皮祖细胞增殖、分化、迁移和血管形成[4-5]，它在成年机体的血管新生中起关键作用。这一发现对治疗四肢缺血性疾病及血管再生将发挥重要作用。
本实验旨在通过建立一定的细胞培养体系，观察在一定条件下内皮祖细胞在体外培养时向内皮细胞的分化能力,为进一步临床应用奠定基础。

设计：以细胞为观察对象的开放性实验。
时间及地点：实验于2007-09/2008-02在辽宁中医药大学教学实验中心国家中医药管理局科研二级实验室完成。
材料：体质量（200±20）g的健康成年Wistar大鼠(普通级)，购自辽宁中医药大学实验动物中心。实验过程中对动物处置符合动物伦理血标准。

方法：
骨髓单个核细胞悬液制备:健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，体质量约200 g，颈椎脱臼法处死，浸泡于体积分数为0.75乙醇中10 min，在生物安全柜中于无菌状态下取其四肢长骨。用4℃、含肝素10 U/mL的M199培养液5 mL冲洗骨髓腔，尽量将骨髓细胞全部冲出，反复吹打以获得单细胞悬液。
Ficoll密度梯度离心：按等体积比将骨髓冲洗液缓慢加在淋巴细胞分离液（密度为1.083 g/mL）的上层，形成清晰的分界线，1 500 r/min，离心10 min，离心后细胞分为3层,小心吸取中间层的白色单个核细胞于无菌试管中，细胞团用5 mL灭菌磷酸缓冲液(PBS)重新悬浮，再低温离心2次×5 min，以洗除残余Ficoll液，加入Tris-NH4Cl红细胞裂解液5 mL，室温作用10 min，每隔 5 min轻轻振荡试管1次，以使红细胞充分裂解，随后以 1 000 r/min离心5 min，弃上清，用无菌PBS制成细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min，洗去残留的红细胞裂解液，弃上清，加入M199完全培养液（含VEGF50 μg/L，bFGF 10 μg/L，肝素10 U/mL，青、链霉素各100 U/mL，胎牛血清20%）。重悬细胞并计数，并用2%椎虫蓝溶液染色计算活细胞百分比。按1×109 L -1的细胞数转入纤维连接蛋白包被的10 cm×10 cm塑料培养皿中，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱内培养。以不含生长因子和肝素的M199培养液作对照培养。
骨髓细胞的纯化及诱导分化：培养72 h后，吸出未贴壁细胞弃去，重新加入M199完全培养液进行培养，每日在倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长状况，两三天半量换液1次。
细胞染色与鉴定：参照文后文献[6-7]，将培养1周的贴壁细胞消化后，取出部分细胞培养于无菌盖玻片上，24 h后磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，95%冷乙醇固定，漂洗后滴加第一抗体：兔抗鼠CD31多抗(1∶200,Santacruz公司)和兔抗鼠Ⅷ因子多抗(1∶100, Santacruz公司) ，阴性对照以PBS代替一抗，湿盒内4 ℃冰箱过夜。PBS振洗，加异硫氰酸标记的二抗50 μL (FITC IgG，武汉博士德)，湿盒内37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后立即荧光显微镜观察、摄片，由2名观察者独立对每块盖坡片上的染色阳性细胞进行记数，随机计数10个非重叠视野（×200），计数阳性细胞表达率。
Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光试验：参照文后文献[8]，将培养至第9天的贴壁细胞以0.25%胰蛋白酶消化，以PBS洗涤1次后，用不含细胞因子的M199培养液调整密度为5×108 L-1，加入激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿，每皿分别加入200μL细胞悬液，另设阴性对照（胃癌细胞GSC7901），上述细胞培养12 h后，弃去培养上清，贴壁细胞与Dil-ac-LDL(2.4μg/L)37 ℃孵育1 h，以不加Dil-ac-LDL的同批培养细胞作空白对照，以检测EPC对Dil-ac-LDL 的摄取。弃去上清，然后以2%的多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗后再加FITC-UEA-1(10mg/L)37 ℃避光孵育1 h, PBS 漂洗后在激光扫描共聚焦显微镜下观察, 显示红色荧光的为Dil-ac-LDL阳性细胞(激发波长543 nm)，显示绿色荧光的为FITC-UEA-1 阳性细胞(激发波长477 nm)，显示双荧光阳性(黄色)的细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。随机计数10个非重叠视野（×200），计算双阳性细胞比例。
设计、实施、评估者：实验设计人为本课题主持人李大勇博士，曾在中国医科大学分子生物实验室研修；实施及评估者为作者所在实验中心人员。

2.1 体外培养的内皮祖细胞形态学变化见图1。倒置显微镜下观察:刚分离时：单个核细胞呈淋巴细胞样小圆形细胞，混有少量纺锤状细胞。椎虫蓝染色显示活细胞占全部细胞的98%以上。种植24 h：部分细胞贴壁。第2 ，3天：细胞开始变大, 并出现明显贴壁增殖。贴壁细胞由小圆形变成大圆形，倒置显微镜下观察贴壁细胞透亮度增强，以后数天渐渐伸出伪足样突起，呈小杆状或梭形，继而呈纺锤形。第3，4天：贴壁细胞开始增殖，呈“集落”样生长，中间为圆形贴壁细胞，外周梭形细胞较多，与原始血岛相似，梭形细胞首尾相连，呈“毛细血管”样排列。第6天：呈现出内皮样细胞的形态特征。第9天：诱导培养后，获得贴壁生长的亚融合细胞层，形态为圆形、椭圆形和梭形的细胞约占90%。部分细胞一直呈小圆形，不能贴壁，换液时弃去。

2.2 骨髓内皮祖细胞表面抗原免疫细胞化学染色及Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光试验骨髓内皮祖细胞表面抗原免疫细胞化学染色：M199实验培养液条件下，骨髓内皮祖细胞诱导培养第9天，Ⅷ因子、CD31阳性表达的细胞分别为（55.1±7.2）%、（45.6±5.8）%，见图2。对照组相关抗原表达均为阴性，提示为分化早期的内皮细胞。

Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光试验：加入M199实验培养液诱导培养第9天，Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1 双荧光染色鉴定，激光共聚焦显微镜下观察, 贴壁细胞中Dil-ac-LDL 和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率为（78.2 ±5.4）%，提示为正在分化的内皮祖细胞，见图3。

从1997年首次从外周血中分离并证实内皮祖细胞后，目前认为成人外周血、脐血及骨髓中均存在内皮祖细胞[9]。内皮祖细胞在骨髓中的含量高于外周血，但也仅占骨髓单个核细胞的1%。因此，提高内皮祖细胞体外扩增数量并保持其低分化状态是迫切需要我们解决的问题。骨髓中含有丰富的成体干细胞，研究证实，这些细胞来源于骨髓，具有旺盛的增殖能力，能够直接分化为血管内皮细胞，在缺血等因素的刺激下，能够动员入血，在受损血管的修复和缺血组织的再血管化中扮演着重要的角色[10-12]。目前认为EPC可通过选用以下细胞标志来鉴定： vWF、CD31、Flk-1、Tie-2、CD133、CD144等[13]，一些实验室则通过血管内皮祖细胞培养后分化形成的成熟血管内皮细胞特征予以鉴定，包括铺路石样形态、管腔样结构形成、Ⅷ因子、乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)、荆豆凝集素(UEA21)、CD34 等[14]。有报道认为CD31、CD34、KDR及Ⅷ因子等，均表达于成熟内皮细胞，是内皮细胞的特异表面标志[15]。
本实验表明，在一定浓度的VEGF和bFGF及其他辅助生长因子作用条件下培养骨髓单个核细胞，一般9 d左右贴壁细胞可生长为单层。光镜观察表明，贴壁细胞培养诱导后具有内皮细胞形态学特征，细胞呈上皮细胞样铺路石状贴壁生长，贴壁时间相对缓慢。若细胞种植不均匀，或密度太低，则细胞透亮度低、生长差，逐渐凋亡，不能继续传代。有研究报道在细胞培养24 h时将贴壁细胞弃去，未贴壁细胞继续培养，可有效排除骨髓单个核细胞中成熟成纤维细胞及骨髓间充质干细胞等的干扰，可提高内皮祖细胞的纯度[16]。作者获得的EPC在传代后Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率达(78.2±5.4)%, 这与从其他动物的骨髓分离培养的内皮祖细胞纯度基本相似[17-18]。而抗Ⅷ因子、CD31的表达率低于双荧光染色, 可能与细胞分化程度较低有关[19]。在内皮祖细胞的体外诱导分化培养时，包被纤连蛋白的培养瓶、专用诱导培养基中的肝素、VEGF和bFGF、优质胎牛血清、pH值条件是否适宜等是成功的关键。采用该方案培养扩增骨髓内皮祖细胞效率高, 稳定性和重复性较好。
本实验从大鼠骨髓单个核细胞中诱导培养出能稳定扩增的内皮祖细胞，为进一步对缺血组织进行自体内皮祖细胞移植，促进局部血管新生和损伤血管内膜的再生修复，从而治疗缺血性疾病奠定了基础。

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