课题背景：干细胞的增殖和分化受多种因素的调控，目前研究已经揭示了调控干细胞命运的三大信号：Wnt，Notch和Shh。Wnt信号及其成员已被明确认为在胚胎发育中可指导细胞的命运，这一途径在许多成体组织如肝、肺、肠、乳腺、肌肉、造血系统中也被证明具有促进原始细胞增殖的作用，说明Wnt信号可能成为多种组织或多种干/祖细胞自我更新的条件，其自身适当的调节作用对于细胞正常生长和增殖都是很重要的。

应用要点：：实验应用氟尿嘧啶建立离体大鼠气管损伤模型，通过RT-PCR法首次研究了Wnt信号传导途径在气管干细胞增殖分化过程中的变化，证实其对于这一过程具有重要调控作用，有助于理解调节自我更新和谱系分化的分子机制，并为定向诱导分化提供重要依据。

偏倚或不足本实验初步揭示了Wnt信号途径与气管干细胞增殖分化机制的可能关系，但干细胞的增殖分化是一个相当复杂的过程，还有很多其他信号分子及因子共同参与调控，如Notch、TGF和BMP等。在这一过程中，Wnt信号分子与其他信号分子之间的顺序关系以及如何相互作用还不十分清楚，有待于进一步分析。

沈阳医学院，1病理学教研室，2解剖学教研室，辽宁省沈阳市 110034

吕威力☆，女，1974年生，辽宁省大连市人，汉族，2006年中国医科大学毕业，博士，副教授，主要从事干细胞与创伤修复方面的研究。
lwl740507@
sina.com

国家自然科学基金 (30170407)*

摘要
背景：实验前期项目已协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型，并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析。但在气管干细胞的增殖分化过程中，究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚。
目的：利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤，检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成。
材料：清洁级2周龄Wistar大鼠18只，用于制备离体气管环。氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产。
方法：将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组：损伤组将气管环置于含12.5 mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中，作用12 h后去除氟尿嘧啶，换成新鲜的HamsF-12液继续培养，分别于3，6，12，24，48 h取部分等量组织块。对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶，其余培养条件及取材时间同损伤组。
主要观察指标：RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化。
结果：氟尿嘧啶作用12 h后，光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞，呈钉状位于基底膜上，前期实验已证明其为气管干细胞。RT-PCR结果显示，对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达，β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达。损伤组经氟尿嘧啶作用后，可检测到Wnt-1 mRNA的表达，β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降；Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3，6，12 h达到高峰；24 h后三者mRNA表达水平均下调；至48 h Wnt-1 mRNA无表达，后三者mRNA少量表达。
结论：在整个气管上皮重建过程中，Wnt1、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律，提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控。
关键词：气管干细胞；Wnt-1；β-连环蛋白；T细胞因子；c-myc；增殖分化

吕威力，邢雪松.Wnt信号通路在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(00):4074-4078 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4074(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04074-05

收稿日期: 2008-03-26
修回日期：2008-04-25
(54200803230005/
ZS·Y)

Temporal-spatial changes of Wnt signaling pathway during the proliferation and differentiation of rat tracheal stem cells

Abstract

BACKGROUND: In coordination with the relevant staff, tracheal stem cells have been modeled in vitro previously, in which the localization, isolation and characteristics of tracheal stem cells are also analyzed. However, it is still unclear that the effect of various genes involved in the proliferation and differentiation of tracheal stem cells, together with the procedure of differentiating into functioning cell.
OBJECTIVE: To develop an extracorporeal injury model of rat tracheal epithelium induced by fluorouracil (5-FU), and investigate the changes of spatio-temporal expression of Wnt signaling pathway members during the proliferation and differentiation of tracheal epithelial stem cells in the tracheal regeneration.
DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observation was carried out in the Central Laboratory of Shenyang Medical College (Shenyang, Liaoning, China) between June 2006 and June 2007.
MATERIALS: Eighteen Wistar rats, of clean grade and aged 2 weeks, were adopted to dissociate tracheal rings. 5-FU was purchased from Tianjin People’s Pharmaceutical Factory (China).
METHODS: Rat tracheal rings representing good cilia beat frequency were divided into two groups: the injury group were put into Hams F-12 culture medium with the concentration of 12.5 mg/L 5-FU. Twelve hours later, the culture dishes were exchanged to the fresh Hams F-12 culture medium without 5-FU, and then some of equivalent tissues were extracted respectively at hours 0, 3, 6, 9, 12, 24 and 48. We applied the same volume of Hams F-12 to take place of 5-FU as the control group. The other conditions were the same as the injury group.
MAIN OUTCOME MEASURES: Levels of Wnt-1, β-catenin, T cell factor-4 (Tcf-4) and c-myc mRNAs in the control and injury groups were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction.
RESULTS: After treatment with 5-FU for 12 hours, the tracheal epithelium shed and cells with naked nuclei were seen sparsely on the basement membrane under the light microscope, and they had been proved to be tracheal stem cells according to the previous studies. Results of reverse transcriptase polymerase chain reaction showed that, no detectable levels of Wnt-1 and Tcf-4 mRNAs were found in normal tracheal epithelium. Level of β-catenin and c-myc mRNAs was shown to be low. Immediately following the treatment of 5-FU, level of Wnt-1 mRNA increased, but level of β-catenin mRNA decreased slightly. Levels of Wnt-1, β-catenin and Tcf-4, together with c-myc mRNAs were elevated maximally at hours 3, 6 and 12 after the removal of 5-FU. At 24 hours, decreased levels of Wnt-1, β-catenin and Tcf-4, together with c-myc mRNAs were observed. There were no detectable levels of Wnt-1 mRNA was found, and levels of β-catenin, Tcf-4 and c-myc mRNAs were still observed.
CONCLUSION: During the regeneration procedure of tracheal epithelium, the levels of Wnt-1, β-catenin, Tcf-4 and c-myc mRNAs reveal the similar changes, which indicates that Wnt signaling pathway plays a role in the proliferation and differentiation of tracheal epithelial stem cells.

Lü WL, Xing XS.Temporal-spatial changes of Wnt signaling pathway during the proliferation and differentiation of rat tracheal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4074-4078(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4074(ps).pdf]

0 引言

干细胞研究的一项基本任务就是阐明其如何保持自我更新及在适当的时机能够正确的分化，近年来的研究表明Wnt信号及其成员已在胚胎发育中明确认为可指导细胞的命运[1-4]。已证明其在脑、四肢、乳腺、皮肤、心血管等发育中起重要作用[5-10]。这一途径在许多成体组织如肝、肺、肠、乳腺、肌肉、造血系统中也被证明具有促进原始细胞增殖的作用[11-18]，说明Wnt信号可能成为多种组织的多种干/祖细胞自我更新的条件，其适当的调节作用对于细胞正常的生长和增殖都是很重要的。然而这一途径在成年呼吸系统再生中的作用还不十分明确。
Wnt蛋白是一类分泌型糖蛋白家族，至少19个成员已被证明存在于从线虫到人类的多种生物中[19]。Wnt信号通过多种不同的通路调节细胞命运，迁移或黏 附[20]。在这一领域研究最好的通路称为Wnt经典信号途径，即Wnt/β-catenin途径。Wnt蛋白与细胞表面的卷曲蛋白家族受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5和LRP6）结合，抑制了糖原合成激酶3β的活性，致使β-连环蛋白去磷酸化而在胞浆累积，并转移至核，与TCF/LEF家族成员形成转录因子复合体，调控c-myc、cyclinD1等下游靶基因的转录[20-21]。本实验利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤，检测重建过程中Wnt信号途径成员的变化，包括Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子以及c-myc，初步观察其时空表达变化，探讨Wnt信号途径与气管干细胞增殖分化的关系。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成。
材料：清洁级2周龄Wistar大鼠18只，由中国医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(辽)2003-0016，体质量200 g，雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。氟脲嘧啶(天津人民制药厂）；DMEM/F12，胎牛血清(华美公司)；引物，RT-PCR试剂盒（Takala公司）；紫外分光度计（UV-310，PY E-UNIC/SPECTRONIC，UK）。
实验过程：
氟脲嘧啶诱发离体气管上皮损伤及分组：戊巴比妥40 mg/kg麻醉大鼠，无菌条件下取出气管，剪成2.0~3.0 mm宽的气管环，置HamsF-12液(含15%胎牛血清、100 u/L 青霉素、100 g/L链霉素)中培养，于倒置显微镜下观察纤毛摆动情况良好。气管环分两组：损伤组将气管环置于含12.5 mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下孵育，12 h后弃去培养液，换成新鲜的HamsF-12液继续培养，其后分别于3，6，12，24，48 h取部分等量组织块。对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶，其余培养条件及取材时间同损伤组。
苏木精-伊红染色：气管环冠状冰冻切片，片厚 10μm，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察。
RT-PCR检测：取氟尿嘧啶换液后0，3，6，12，24，48 h及正常的气管组织，解剖显微镜下机械剥离上皮，取 0.1 g气管上皮标本剪碎研磨，加入1 mL Trizol总RNA提取试剂，以5 mL注射器反复抽吸至乳状；加 200μL氯仿，快速摇振15 s，室温放置5 min；4 ℃ 13 000 r/min离心15 min；取上清加入500 μL异丙醇冰上沉淀1 h；4℃ 13 000 r/min离心15 min；弃上清，沉淀经体积分数为0.75的乙醇洗1次；4 ℃ 13 000 r/min离心15 min，弃上清；沉淀加50μL无Rnase水(DEPC处理)溶解RNA，4 ℃过夜，-20 ℃冰箱保存备用。总RNA经紫外分光度计测定A260和A280，比值为1.6~1.8。按TrizolTM试剂使用说明提取剥离的气管上皮总RNA，检测浓度、纯度和完整性。按反转录试剂盒使用说明操作，选用Oligo-dT做引物合成第一链cDNA，反转录条件：30 ℃ 10 min，40 ℃ 40 min，99 ℃ 5 min， 5 ℃ 5 min。PCR循环参数：Wnt1：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，30个循环后，72 ℃延伸7 min；β-连环蛋白：94 ℃预变性2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环后，72 ℃延伸7 min；T细胞因子：94 ℃预变性2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环后，72℃延伸7 min；c-myc：94 ℃预变性2 min，94℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环后，72 ℃延伸7 min； β-actin：94 ℃预变性2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环后，72 ℃延伸7 min。所用引物序列：Wnt-1：正义 5’- AGG TGA AAG GGC AAG GAA -3’，反义 5’- CTG GCA GAC AAG AGG AGT GA -3’（304 bp）；β-连环蛋白：正义5’-GCG CTC CCC TCA GAT GGT GTC-3’；反义5’-ACG ATG GCC GGC TTG TTG C-3’(500 bp)；T细胞因子：正义5’ GTT GTT CTT TGC GGG GAG G 3’，反义5’TGC TGC TCA GAC AGT GTC GC 3’416 bp）；c-myc：正义5’-AGG TGT GAT ATC CGG TAG A-3’，反义5’-GAG CGG CGG CAA GAA TGT -3’（477 bp）；β-actin ：正义 5’- CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3’，反义5’-CCT TCT AAG TGG TTG GAA CA-3’（587 bp）。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色Bio-Rad凝胶图像成像仪观察并记录结果，测灰度值。
主要观察指标：①氟尿嘧啶致离体气管上皮损伤情况及损伤重建过程的恢复。②离体气管上皮损伤重建过程中Wnt信号通路成员mRNA的表达变化。
设计、实施、评估者：实验设计、资料收集为第一作者，干预实施、评估为第二作者, 均经过系统培训，采用盲法评估。

2 结果

2.1 氟尿嘧啶致离体气管上皮损伤情况及损伤重建过程的恢复 氟尿嘧啶作用12 h后，光镜下可见气管上皮细胞绝大部分脱落，暴露基底膜，仅剩余少数间隔分布的近于裸核的细胞，呈钉状位于基底膜上。前期实验已证明[1-4]，氟尿嘧啶作用12 h后基底膜上残留的裸核样细胞能排除Hoechst33342染料，PCNA染色阴性，Bcrp1/ABCG2基因表达阳性，为气管干细胞。
将氟尿嘧啶去除，换液培养后观察损伤气管上皮的恢复情况。6 h后气管基底膜上可见少量扁平样细胞，细胞浆有延伸趋势。24 h后基底膜上细胞数目增加，并逐渐分化呈立方状，连接成片。至48 h气管上皮出现假复层柱状上皮，并可见纤毛细胞。对照组培养过程中气管上皮细胞纤毛排列整齐，细胞无脱落。
2.2 离体气管上皮损伤重建过程中Wnt信号通路成员的表达变化 图1 RT-PCR结果显示，正常大鼠气管上皮未检测到Wnt-1 mRNA的表达；氟尿嘧啶作用后可见Wnt-1 mRNA轻度表达；去除氟尿嘧啶后3 h Wnt-1 mRNA表达显著增强并升至高峰，随后其表达水平随恢复时间的延长逐渐下降，24 h时表达明显减弱，至48 h未检测到Wnt-1 mRNA的表达。

正常大鼠气管上皮β-连环蛋白mRNA有轻度表达；氟尿嘧啶作用后β-连环蛋白mRNA表达出现一时性下降；β-连环蛋白mRNA在整个气管上皮重建过程中持续存在，去除氟尿嘧啶后3 h β-连环蛋白mRNA表达增强，高峰出现在6 h，之后其水平开始随恢复时间依次下降，至48 h只有轻度表达，并低于正常。
正常大鼠气管T细胞因子mRNA无任何表达；氟尿嘧啶造成气管损伤后0 h T细胞因子mRNA即开始表达，3 h后明显升高，6 h达峰值，之后其表达呈减弱趋势。
c-myc mRNA的表达在整个气管上皮重建过程中持续存在，去除氟尿嘧啶后3 h c-myc mRNA开始有少量表达，6 h表达增强，至12 h达高峰，24 h明显减弱；48 h检测不到其表达。c-myc mRNA出现高峰的时间迟于 β-连环蛋白mRNA和T细胞因子mRNA，表明离体气管上皮损伤重建过程中Wnt信号通路成员之间的时空调控顺序。

3 讨论

3.1 气管上皮重建过程中气管干细胞的增殖分化 氟尿嘧啶属抗嘧啶类代谢药，通过抑制DNA合成造成细胞周期内细胞的变性、坏死，对增殖细胞各期尤其是S期起作用，对G0期细胞不敏感[7]。本实验应用氟尿嘧啶这一特点处理离体大鼠气管上皮，苏木精-伊红染色光镜下可见气管上皮细胞绝大部分脱落，仅剩基底膜上残留的G0期细胞，呈钉状间隔分布，类似裸核细胞；去除氟尿嘧啶后，气管上皮逐渐经历扁平、立方上皮，直至恢复到假复层纤毛柱状上皮。亦即，损伤后修复的气管上皮是由残留的G0期细胞分裂、增殖，并向纤毛细胞、黏液细胞等分化而来的。能自我更新及多向分化正符合干细胞的特性。丁强等[1-4]先前的实验证明，此G0期细胞能排除Hoechst33342染料，PCNA染色阴性，Bcrp1/ABCG2基因表达阳性，从而证明其为气管干细胞。即氟尿嘧啶作用12 h后，基底膜上残留的裸核样细胞主要为气管干细胞。去除氟尿嘧啶6 h后，气管干细胞大量增殖，分化成扁平较长细胞，核大，深染；12 h后气管干细胞逐渐开始分化为立方上皮；24 h后气管上皮进一步变厚；48 h后出现假复层纤毛柱状上皮结构。但在气管上皮重建过程中，气管干细胞增殖分化的机制尚未明了。
3.2 Wnt-1在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的表达
Wnt家族是成体干细胞的外源性调控因子[8-10]，Wnt-1 通过激活经典的Wnt/β连环蛋白信号通路行使功 能[23-24]，参与细胞分化、极性建成、迁移和增殖等生物学过程。Wnt-1蛋白与跨膜受体卷曲蛋白结合，激活胞内散乱蛋白，防止胞内游离β连环蛋白降解并使其逐渐在胞质内积聚，进而被运输到核内，与LEF/TCF 家族成员等典型转录因子形成复合物，激活相关基因的转录系统[25]。最近研究表明，Wnt信号可刺激肠、皮肤、造血干细胞增生，抑制胚胎干细胞向不同谱系分化[14-16]。本实验中，Wnt-1在正常气管上皮中无表达，即此时信号通路处于“关闭”状态。气管损伤后恢复3 h，Wnt-1表达增加，此时气管干细胞大量增殖，之后随着修复的进行，Wnt-1表达逐渐减少，则气管干细胞进入分化阶段，很可能Wnt-1的下调是促使气管干细胞分化至最终气管上皮恢复原状的内在因素，表明Wnt-1在气管干细胞增殖分化中起重要调控作用。
3.3 Wnt信号通路的关键传递子β-连环蛋白在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的表达 β连环蛋白是Wnt信号通路中最为重要的信号分子[17-18]。当无Wnt信号时，β-连环蛋白与糖原合成激酶3β、APC形成复合物，启动泛素系统降解β-连环蛋白。当Wnt蛋白表达较高时，糖原合成激酶3β不能使APC磷酸化，β-连环蛋白不能降解，在细胞内大量累积并进入核内，启动靶基因的表达[19-20]。本实验对大鼠气管上皮重建中β-连环蛋白的表达变化进行基因水平的检测，对照气管损伤后的形态学研究表明，正常及氟尿嘧啶损伤后0 h，气管上皮β-连环蛋白表达微弱；去除氟尿嘧啶后随着修复的进行，损伤后3 h在气管上皮细胞的胞浆中观察到了β-连环蛋白的表达，6 h后其表达水平进一步增强并达高峰，之后随着时间的推移，至12 h后表达逐渐减弱。由此可以推测，胞浆中游离状态的β-连环蛋白表达的增加可能促进了气管干细胞的增殖，而气管干细胞开始分化后其表达也随之下降，从而提示β-连环蛋白在气管损伤后的组织重建过程中对气管干细胞的增殖分化发挥了一定的作用。
3.4 T细胞因子在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的表达 T细胞因子在Wnt信号通路起着分子开关作 用[22]，Wnt信号的最终效应是通过β-连环蛋白在核内与T细胞因子结合后激活靶基因的转录而实现的[10]。近来研究表明，T细胞因子家族成员在多种发育和分化过程中起关键的转录调节作用[14]。当缺乏Wnt信号时，T细胞因子与转录抑制因子结合，抑制靶基因的转录表达；Wnt信号激活后，大量β-连环蛋白在胞内累积，T细胞因子与β-连环蛋白结合，启动靶基因的表达[24]。本实验结果显示：正常气管T细胞因子mRNA无任何表达，氟尿嘧啶造成气管损伤后，在伤后0 h T细胞因子mRNA的表达较弱，0~3 h开始表达，3 h后明显增加，6 h后达峰值，之后其表达呈减弱趋势。
3.5 靶基因c-myc在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的表达 第一个发现的β-连环蛋白/ T细胞因子复合物的靶基因是原癌基因c-myc[26]。c-myc属于即早期反应蛋白，是细胞周期相关基因和转录调控因子之一，是多种细胞因子生物活性作用的原发反应基因，与细胞的增殖及分化、肿瘤发生密切相关[27-28]。He等[29]的研究证明了c-myc表达调控是由T细胞因子来完成的。在Wnt信号下，β-连环蛋白在核内积聚并与T细胞因子结合成复合体，消除了T细胞因子CBP/Grouch的抑制作用，而起到了辅激活物的作用，启动c-myc的表达，促使了干细胞增殖。c-myc基因的表达可被APC抑制，被β-连环蛋白激活，这都是通过c-myc启动子与T细胞因子结合的位点进行的[6]。
本实验应用氟尿嘧啶造成气管损伤模型，检测气管创伤愈合中c-myc mRNA的表达情况，结果显示c-myc表达与上皮修复进程相关。在正常处于静息状态下的气管上皮中c-myc mRNA表达微弱，经氟尿嘧啶处理后静止组织被刺激生长，能迅速诱导c-myc mRNA的表达。在气管上皮不断增殖过程中，c-myc mRNA水平升高或保持高水平，至损伤恢复后6 h达高峰；此后，在增殖的气管上皮中其表达逐渐下降，但处于仍然能够被检测到的低水平稳定状态，此时上皮停止增殖，开始分化。因此本实验表明，c-myc基因参与气管上皮生长分化和抗损伤修复的调节，与气管干细胞早期增殖和分化间周转状态直接相关，其表达诱导气管干细胞增殖，而抑制其分化。
3.6 Wnt信号途径成员的时空表达变化与大鼠气管干细胞增殖分化机制的可能关系 在缺乏Wnt信号的情况下,例如正常气管黏膜上皮，其Wnt-1及T细胞因子无表达，细胞内仅有少量β-连环蛋白呈膜表达，c-myc信号通常为关闭状态。经氟尿嘧啶打击后，气管上皮进入增殖期的细胞坏死脱落，而仅剩G0期细胞，其中包括干细胞(其PCNA染色为阴性，Hoechst33342染色为阴性，ABCG2染色阳性[9-12])，此时由于只剩余极少量的细胞，所以β-连环蛋白mRNA水平出现一时性下降。当把经过氟尿嘧啶打击后的气管上皮移入正常培养基后，此时Wnt-1开始启动；3~6 h后 Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子mRNA表达均上调并达高峰，β-连环蛋白蛋白在胞浆内聚集，并由胞浆向核内移动,与TCF/LEF结合,激活转录，促进靶基因c-myc mRNA的表达[20-21]。这段时期气管上皮变为扁平，其胞浆试图覆盖基底膜,PCNA染色可见大量的阴性细胞(子代干细胞)及大量的阳性细胞增生(子代祖细胞)[22-24]。重建初期，β-连环蛋白的增加及向核内移动提示其对细胞增殖的促进作用,但这一作用被Wnt途径的负性调节以及β-连环蛋白的降解巧妙的调控着。在24 h后三者均明显下调，此时扁平上皮已变成立方上皮并出现向纤毛细胞、黏液细胞和基底细胞分化。而48 h后Wnt-1 mRNA无表达，此时β-连环蛋白少量表达并恢复到正常时的胞膜阳性，上皮已基本恢复到假复层纤毛柱状上皮，故推测β-连环蛋白可能通过反馈机制调节自身水平。在重建初期，为了启动基因表达和细胞增殖，β-连环蛋白水平升高，但其升高由其降解途径的激活所控制，因此不会无限升高而导致生长失控或癌变；待气管上皮细胞数目恢复到一定规模后，通过反馈机制作用于Wnt-1，Wnt-1 mRNA表达开始下降，β-连环蛋白mRNA水平随之下降，并且其蛋白开始由核内移出；在恢复正常后, Wnt-1 mRNA停止表达，β-连环蛋白恢复为膜表达。类似的报道有Monga等[18]阐明的在大鼠肝重建过程中β-连环蛋白水平的升高反馈性抑制了Wnt水平。另外，β-连环蛋白在未经氟尿嘧啶打击前及基本恢复正常的气管上皮始终存在，说明在正常情况下β-连环蛋白的自然水平可能为正常维持少量细胞增殖所必需。
必须指出，干细胞的增殖分化是一个相当复杂的过程，还有很多其他信号分子及因子共同参与调控，如Notch、TGF和BMP等[25-28]。在这一过程中，Wnt信号分子与其他信号分子之间的顺序关系以及如何相互作用还不十分清楚，有待于进一步研究。本实验初步揭示了Wnt信号途径与气管干细胞增殖分化机制的可能关系，丰富了干细胞生物学的研究成果。

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