课题背景：虽然粒细胞集落刺激因子将骨髓干细胞动员至外周血的机制尚未明确，但是采集的外周血干细胞可代替骨髓移植应用于非造血组织如骨骼肌、心肌及神经组织等的再生。假定将粒细胞集落刺激因子用于具有组织损伤的个体，动员其干细胞定植于损伤的组织中，通过组织可塑性原理分化为损伤的组织细胞，则可代替创伤性的自体干细胞移植修复损伤组织，促进组织再生。

偏倚或不足：实验应用小鼠开展探索粒细胞集落刺激因子动员干细胞的有效方法，但是需要深入研究粒细胞集落刺激因子动员的干细胞对于小鼠自身损伤组织的再生及修复的作用，拟在将来的研究中进一步明确。

相关链接：近年来关于自体干细胞移植治疗损伤坏死组织的研究正成为热点，如自体干细胞的局部移植促进心肌梗死的恢复、促进神经缺血性损伤的修复等。但是干细胞动员、干细胞分化为非造血组织的机制以及干细胞修复损伤组织的效果均在研究中。临床实践中，应用粒细胞集落刺激因子动员自体干细胞而代替创伤性自体干细胞移植手段促进损伤组织的再生及修复成为近年研究的热点。

大连医科大学附属第二医院血液风湿科，辽宁省大连市 116027

闫金松☆，男，1970年生，山东省莒南县人，汉族， 2007年上海交通大学上海血液学研究所毕业，博士，副教授，主要从事血液疾病发生及治疗的分子机制研究。
yanjs_sh@yahoo.
com

摘要
背景：外周血造血干细胞用于损伤组织的修复及再生需要快速有效的动员方法。常规的动员方案多采用重组人粒细胞-集落刺激因子或大剂量化疗联合重组人粒细胞-集落刺激因子,该方案耗时长、程序复杂。
目的：对常规的外周血造血干细胞动员方案进行改进，观察短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员KM小鼠外周血造血干细胞的效果。
设计、时间及地点：于2006-09/2007-03在大连医科大学附属第二医院血液科实验室开展的随机对照动物实验。
材料：雄性8周龄KM小鼠24只，以给药方式分为3组：常规给药组、短程高剂量给药组、生理盐水对照组。
方法：常规给药组，皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子，0.2 μg/次，2次/d，共6 d；短程高剂量给药组，前4 d注射等量生理盐水，后2 d皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子，2.5 μg/次，2次/d；生理盐水对照组，每日注射等量生理盐水,共6 d。
主要观察指标：各组小鼠外周血白细胞计数、粒-巨核细胞集落数。
结果：常规剂量组及短程大剂量组小鼠外周血白细胞迅速增高，对照组无明显变化。粒-巨核细胞集落培养7d后，常规剂量组和短程高剂量组的粒-巨核细胞集落计数较对照组显著升高达50倍以上(P < 0.01)，常规剂量组和短程高剂量组两组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
结论：短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员小鼠外周血造血干细胞，有着良好的可行性及有效性，是对小鼠外周血造血干细胞动员模型的成功改进
关键词：外周血造血干细胞；动员；粒细胞集落刺激因子；组织损伤；小鼠

闫金松，童金生，宋振岚.短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子对小鼠外周血造血干细胞的动员作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4089-4092 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4089(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04089-04

收稿日期: 2008-01-22
修回日期：2008-03-13
(08-50-1-589/GW·Y)

Mobilization of peripheral blood stem cells in mice with short-duration and high-dose recombinant human granulocyte colony-stimulating factor

Abstract

BACKGROUND: The prompt and efficient peripheral blood stem cell (PBSC) mobilization is necessary for repairing and regenerating injured tissues. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) or its combination with a large dose of chemotherapy is usually utilized for PBSC mobilization, but the regimen requires a long time and a complex procedure.
OBJECTIVE: To modify the common PBSC mobilization, and investigate mobilization effect of PBSC in KM mice with short-duration and high-dose rhG-CSF.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized controlled animal trial was carried out in the laboratory of Hematology, the Second Affiliated Hospital to Dalian Medical University from September 2006 to March 2007.
MATERIALS: Twenty-four KM male mice of 8 months old were divided into 3 groups according to the administration: conventional regimen group, short-duration and high-dose group, and saline control group.
METHODS: Mice in the conventional regimen group were injected subcutaneously with rhG-CSF (0.2 μg one time, twice a day for 6 days). Mice in the short-duration and high-dose group were injected with equal volume of normal saline at first 4 days, and then with rhG-CSF (2.5 μg one time, twice a day for 2 days). Mice in the saline control group were injected subcutaneously with equal volume of normal saline for 6 days.
MAIN OUTCOME MEASURES: Peripheral blood white blood cell (WBC) and colony-forming unit-granulocyte macrophage in KM mice were counted.
RESULTS: WBC in the peripheral blood of KM mice increased rapidly in conventional regimen group and short-duration and high-dose group. No obvious change of WBC was observed in the control group. The number of colony-forming unit-granulocyte macrophage in conventional regimen group and short-duration and high-dose group was significantly elevated over 50 folds than control group (P < 0.01), and there was no statistical significance between conventional regimen group and short-duration and high-dose group (P > 0.05).
CONCLUSION: There is a good efficacy and feasibility in PBSC mobilization of KM mice with short-duration and large-dose rhG-CSF, and it is a successful amelioration of PBSC mobilization of mice peripheral blood.

Yan JS, Tong JS, Song ZL.Mobilization of peripheral blood stem cells in mice with short-duration and high-dose recombinant human granulocyte colony-stimulating factor.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4089-4092(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4089(ps).pdf]

0 引言

外周血造血干细胞移植是临床上常用的治疗某些血液系统疾患的重要手段之一，但仍有许多问题需要探索及研究[1]。目前外周血造血干细胞移植已拓展应用于损伤组织如梗死心肌、缺血坏死的神经组织、损伤的肾脏等多种组织的再生及修复，并成为基础研究及临床应用的热点[2-6]。外周血造血干细胞动员是指在一定的外部条件作用下，促使骨髓中的造血干细胞短时间内迁移至外周血的过程。
目前在基础研究及临床上外周血造血干细胞的动员大部分采用重组人类粒细胞-集落刺激因子(Recombinant human G-CSF,rhG-CSF) 或高剂量化疗联合rhG-CSF[7-9]。该动员方案动员的PBSC以CD34+为特征，需每日给药并连续监测外周血白细胞计数，外周血造血干细胞的升高时间长达5 d[10-12]。如果用于急性组织损伤的修复或者开展非创伤性的外周血造血干细胞促进组织的修复及再生，则需要探索更加快速有效的动员方案。本实验拟改进动员方案，观察KM小鼠应用短程高剂量rhG-CSF动员外周血造血干细胞的效果，为将来研究外周血造血干细胞对于损伤组织的修复及再生提供方法学，为深入开展损伤组织的再生及修复奠定理论基础[13]。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验，属于体内应用型的基础研究。
单位：大连医科大学附属第二医院血液风湿科。
材料：实验于2006-09/2007-03在连医科大学附属第二医院血液科实验室开展。KM小鼠喂养于大连医科大学试验动物中心（省级动物实验中心）。实验动物：8周龄雄性KM小鼠24只，体质量20~24 g，由大连医科大学试验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。主要药品、试剂和仪器：rhG-CSF、rhGM-CSF购自华北制药股份有限公司，RPMI 1640培养基、甲基纤维素粉、30％灭活马血清购自Gibco 公司，淋巴细胞分离液（1.077 g/L）购自上海华精生物高科技有限公司。试验应用96孔细胞培养板、超净工作台、低温离心机、倒置显微镜、CO2恒温培养箱等细胞培养操作设备。
设计、实施、评估者：该实验由第一作者设计及指导，由第二作者具体开展实验研究，由第一、三作者进行实验的总结及评估。
方法：
分组与给药方法：将24只KM小鼠随机平均分为3组。A组为常规给药组，皮下注射rhG-CSF，20μg/(kg· d)，0.2 μg/次，2次/d，共6 d；B组为短程高剂量给药组，前4 d注射等量生理盐水，后2 d皮下注射rhG-CSF， 250 μg/(kg·d)，2.5 μg/次，2次/d；C组为生理盐水对照组，每日注射等量生理盐水共6 d。
外周血白细胞计数：每天上午8点小鼠断尾采血 20μL，常规方法进行白细胞计数。
外周血单个核细胞制备及粒-巨核细胞集落半固体培养：实验第7天将小鼠用1％戊巴比妥0.3 mL腹腔注射麻醉，应用5 mL抗凝注射器，在无菌状态下剖胸直视下心脏采血，每只采血约0.8 mL。应用淋巴细胞分离液，按照常规操作方法制备外周血单个核细胞，PBS洗涤2次后计数并调整细胞密度为2×109 L-1备用。应用如下体系进行粒-巨核细胞集落培养：2.2%甲基纤维素0.4 mL(终浓度为0.92%)，30％灭活马血清0.25 mL，rhGM-CSF 0.04 mL (终浓度40 μg/L)，单个核细胞悬液0.1 mL(终浓度2×108 L-1)，RPMI 1640 0.16 mL，总体系0.95 mL。将上述体系充分混合后植入96孔细胞培养板中，每孔 0.25 mL, 平行3复孔。在37 ℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养7 d，倒置显微镜下观察。大于50个以上的细胞团为一个集落，计数每个培养孔中集落数，3复孔的集落数取均数。
主要观察指标：各组小鼠外周血白细胞计数及粒-巨核细胞集落数。
统计学方法：由第一作者应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，计量资料应用_x±s。3个实验组的白细胞计数及粒-巨核细胞集落数的比较采用q检验, P < 0.01为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 24只小鼠均进入结果分析，无脱落。
2.2 外周血白细胞计数 24只KM小鼠外周血未接受药物处理前，其外周血白细胞为（4.5~12.6）×1012 L-1， 常规给药组皮下注射rhG-CSF后，6 d内可见外周血白细胞逐渐增高，最高达25.3×1012 L-1，短程大剂量给药组给予高剂量rhG-CSF动员后，2 d内迅速上升至28.6×1012 L-1，而生理盐水对照组则无明显变化。
2.3 粒-巨核细胞集落培养计数 粒-巨核细胞集落培养第7天时，从细胞培养箱中取出96孔细胞培养板，应用倒置显微镜观察粒-巨核细胞集落培养生长情况并进行计数。结果发现96孔板中视野下可见细胞呈球形集落状分布，周围少量散在梭形贴壁细胞，七八天时细胞形态饱满，折光性强，10 d后逐渐退化。生理盐水对照组小鼠外周血粒-巨核细胞集落培养计数(0~4)个/2×105个单个核细胞，常规给药组和短程大剂量给药组rhG-CSF动员后，集落培养计数比对照组均增高了50倍以上。3组小鼠外周血造血干细胞动员后，其外周血白细胞计数及粒-巨核细胞集落培养计数情况见表1。3组小鼠用药6 d后外周血白细胞计数及外周血粒-巨核细胞集落培养计数，经q检验常规给药组、短程高剂量给药组，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，而常规给药组与短程高剂量给药组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

3 讨论

虽然外周血造血干细胞移植已经成为治疗某些血液系统疾病的常用手段，但是关于外周血造血干细胞的许多问题仍然需要进一步探索[10]。造血干细胞的基础研究及临床应用始终是研究的热点，最近外周血造血干细胞移植用于治疗组织坏死及损伤取得了令人鼓舞的结果。应用外周血造血干细胞促进坏死组织的修复及再生并部分尝试用于临床实践中，如将干细胞应用于心肌梗死的辅助治疗中[14-15]。有学者应用小鼠开展干细胞修复缺血性神经坏死及肾脏组织坏死取得了良好的效 果[3,5,16]，因此开展外周血造血干细胞促进组织的修复及再生具有重要的价值。应用常规外周血造血干细胞动员技术及方法，干细胞动员的时间一般在应用G-CSF 5d后外周血造血干细胞明显升高[17]。对于急性组织损伤及坏死，需尽快动员外周血造血干细胞，故探索外周血造血干细胞动员技术，是研究干细胞促进坏死组织修复及再生的基础，尤其对于期望采用非创伤性的外周血造血干细胞修复坏死组织具有更大的意义。因此干细胞动员技术仍有研究与改进的空间及必要[4,12,18-22]。
在基础研究与临床应用中，常用的检测外周血造血干细胞的方法有：外周血单个核细胞计数、流式细胞术检测CD34+细胞、检测干细胞特异性蛋白或基因的分子生物学技术、小鼠脾结节形成试验、祖细胞集落培养形成实验等技术。而能够建立长期造血的细胞才是真正意义上的干细胞，故脾结节形成试验是最客观的方法，但只适用于啮齿类。而集落形成实验实质上检测的是包含有干细胞的混合祖细胞群，其集落数与干细胞具有良好的线性关系，能相对的反映外周血造血干细胞的数量及功能。由于小鼠干细胞标记为c-Kit+ Sca-1+ Lin-，流式细胞仪检测相对繁琐，故本实验采用粒-巨核细胞半固体集落培养观察其形成率，来反映小鼠的外周血造血干细胞动员情况。
迄今已经发现多聚阴离子化合物、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能够有效的动员骨髓和外周血造血干/祖细胞进入外周血[1-3]。通常rhG-CSF是最常用、有效且易获得的动员剂之一[4-6]，该技术方法成熟简便、可调控，故它是一个研究干细胞移行特征的良好模式。rhG-CSF可用于小鼠外周血造血干细胞的动员，用于小鼠的剂量范围在20~250 μg/ (kg·d)之间，其常规剂量多采用在20~ 50 μg/(kg·d)。本实验中拟比较常规剂量与高剂量之间外周血造血干细胞动员效果的区别，改进动员方案。
rhG-CSF在体内半衰期为4~8 h，故实验多采用1 d 2次的给药方法。本试验应用国产rhG-CSF，常规方案组予20 μg/（kg·d），分2次皮下注射，共6 d。第7天外周血白细胞上升情况及粒-巨核细胞集落培养计数情况与文献报道一致[12]。短程高剂量给药组250 μg/(kg·d)，共应用2 d，其外周血白细胞计数也同样迅速出现高峰，获得较多的粒-巨核细胞集落，与常规方案组比较无显著性差异，但其优势在于外周血干细胞的动员快速高效。同时短程高剂量G-CSF组的小鼠未出现明显的副反应及死亡等情况，提示耐受性良好。
因此应用短程高剂量rhG-CSF动员小鼠外周血造血干细胞，有着良好的可行性及有效性，是对小鼠外周血造血干细胞动员模型的改进。本实验结果为短程高剂量rhG-CSF动员小鼠外周血造血干细胞增加，可否代替创伤性的外周血造血干细胞移植治疗小鼠的组织损伤，促进损伤组织修复及再生是本课题深入研究的方向。

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