课题背景：课题为国家自然科学基金项目部分研究内容，编号30672125。该基金项目主要解决了两个问题：一是成倍地提高了转染系统中目的基因骨形态发生蛋白2的表达水平，为将来的体内实验促进成骨发挥作用；二是用壳聚糖修饰载体空隙表面及用多糖生物膜做载体外包裹，提高了种子细胞与载体复合后的首次贴壁率，减少了种子细胞的损失，并获得了种子细胞在载体内的大量生长、繁殖，为将来植入体内提供保障。

应用要点：①以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1联合诱导兔骨髓间充质干细胞，结果其可定向分化为血管内皮细胞。②采用贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞，简单实用。③采用细胞形态学观察、NO含量测定、免疫组化染色、透射电镜观察4种方法鉴定内皮细胞，数据翔实，证据充分。

偏倚或不足：①采用透射电镜观察Weibel-Palade小体时，由于其呈棒状，切片时只有很少的Weibel-Palade小体能被切成典型的长条形（纵切面），大多数呈圆形或椭圆形（横断面），因此切片数一定要多，并需反复多视野观察。②实验未对诱导所得的血管内皮细胞进行生长活性鉴定和体内生存能力判断，这是下一步实验研究的重点。

辽宁医学院附属第一医院骨科，辽宁省锦州市 121000

陈 毅★，男，1982年生，浙江省金华市人，汉族，辽宁医学院在读硕士，主要从事骨组织工程方面的研究。
chenyi0427163@
163.com

摘要

背景：已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管，但获取内皮细胞时创伤较大，且来源极其有限。
目的：观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下，兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化。
设计、时间及地点：2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察。
材料：清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养。血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品。
方法：兔麻醉后抽取骨髓液，贴壁法+胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞，分为两组，诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10 μg/L血管内皮细胞生长因子、1 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2 μg/L胰岛素样生长因子1，诱导2周。对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液。
主要观察指标：对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况。
结果：诱导5 d后细胞呈集落样分布，形态趋于圆形；未诱导细胞均匀散在分布，呈长梭形和三角形。诱导14 d后，诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组（t=3.75，P < 0.05）。诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子，超微结构可见Weibel-Palade小体；对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达。
结论：兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后，可向血管内皮细胞方向分化。
关键词：骨髓间充质干细胞；血管内皮细胞；细胞因子

陈毅，刘丹平.三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4093-4096 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4093(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)21-04093-04

收稿日期: 2007-10-22
修回日期：2008-03-15
(07-50-10-5761/ZS·Q)

Differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells induced by in vitro combination of three kinds of cytokines

Abstract

BACKGROUND: It has been verified vascular endothelial cells can propagate and differentiate into vessel by planted in the tissue-engineered material in vivo, but it may cause severe trauma when obtain vascular endothelial cells, and it has limited sources.
OBJECTIVE: To investigate whether bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can differentiate into vascular endothelial cells by combined induction of vascular endothelial cell growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-like growth factor (IGF)-1 by experimental observation.
DESIGN, TIME AND SETTING: The control cell observation experiment was conducted at the Central Laboratory of First Affiliated Hospital, Liaoning Medical University from November 2006 to June 2007.
MATERIALS: An 8-week-old Japanese big ear rabbit was used to isolate BMSCs. VEGF, bFGF and IGF-1 were purchased from Peprotech Company.
METHODS: After anaesthesia, bone marrow was extracted from the rabbit. Enough BMSCs were harvested by adherence and trypsinization and randomized into two groups. BMSCs in the induction group were inoculated in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 10 μg/L VEGF, 1 μg/L bFGF and 2 μg/L IGF-1 for 2 weeks. BMSCs in the control group were inoculated in DMEM containing 10% FBS.
MAIN OUTCOME MEASURES: Morphological observation, nitric oxide (NO) content detected, immunohistochemistry staining of Ⅷ factor-related antigen and Weibel-Palade body under a electron microscope in BMSCs.
RESULTS: Five days after induction, BMSCs were distributed in cluster, showing round. Non-induced BMSCs were evenly distributed, showing spindle or triangle. Fourteen days after induction, NO content in supernatant was significantly higher in the induction group than in the control group (t=3.75, P < 0.05). Ⅷ factor and Weibel-Palade body were detected in the induction group, whereas Ⅷ factor-related antigen was negatively expressed in the control group.
CONCLUSION: VEGF, bFGF and IGF-1 can induce the differentiation of rabbit BMSCs into vascular endothelial cells in vitro.

Chen Y, Liu DP.Differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells induced by in vitro combination of three kinds of cytokines.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4093-4096(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4093(ps).pdf]

0 引言

组织工程与基因工程并称为21世纪生命科学两大热点，组织工程骨具有巨大的临床需要及应用前景，但是在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，使修复归于失败。大量研究证实坏死的主要原因在于未能很好解决组织工程骨的血管化问题[1]。近年研究[2-4]证实血管内皮细胞种植于材料上在体内可增殖分化形成血管，促进组织工程骨血管化，但是内皮细胞的获取创伤较大，来源(静脉或动脉血管)极其有限，因而远不能满足临床需要。实验以血管内皮细胞生长因子[5-7]、碱性成纤维细胞生长因子[8]、胰岛素样生长因子1[9]联合诱导兔骨髓间充质干细胞，使其定向分化出血管内皮细胞，解决血管内皮细胞来源问题。

1 材料和方法

设计：细胞对照观察。
单位：辽宁医学院附属第一医院骨科。
材料：实验于2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成。①动物：清洁级8周龄日本大耳白兔1只（由辽宁医学院实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（辽）2003-0007），雌雄不拘，体质量1 kg，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要材料、试剂与仪器：DMEM（Gibco）；血管内皮细胞生长因子（Peprotech）；碱性成纤维细胞生长因子（Peprotech）；胰岛素样生长因子1(Peprotech)；NO检测试剂盒（南京建成）；兔抗-Ⅷ因子相关抗原（博士德）；免疫组化染色试剂盒（博士德）；多聚赖氨酸(博士德)；胎牛血清（华美）；胰酶、D-Hank’s液、PBS、CO2细胞培养箱、超净工作台、光学显微镜、荧光倒置显微镜及照相系统、水浴箱、烘干箱、低速离心机、高速离心机、酶标仪、透射电镜。
设计、实施、评估者：设计与评估为第一、二作者，实施为第一作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
兔骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化和扩增培养：16号骨髓穿刺针接10 mL注射器，注射器内含稀释的2 500 U/mL肝素钠约0.5 mL，从大耳白兔胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液3.0~4.0 mL，分装入两只盛有4 mL 10%胎牛血清DMEM培养液的培养瓶内，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养5 d后首次换液，更换培养液时将未贴壁的细胞全部弃掉。继续培养，每3 d换液1次。原代细胞培养12~14 d长满单层后，用2.5 g/L胰酶在37 ℃下消化1 min，待大部分细胞收缩变圆后，小心吸去胰酶，滴加含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，轻轻吹打使细胞充分悬浮，传代，获得足够数量的骨髓间充质干细胞。
骨髓间充质干细胞体外诱导分化：设立两组，各10瓶细胞，且细胞密度、活性、传代数相同。诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10 μg/L血管内皮细胞生长因子、1 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2 μg/L胰岛素样生长因子1，每3 d换液1次，诱导2周。对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，每 3 d换液1次，培养2周。
诱导后细胞鉴定：
细胞形态学变化：诱导后每天用倒置显微镜观察诱导组和对照组细胞的形态学变化。
NO含量测定：诱导2周后，取细胞培养上清液，采用NO检测试剂盒测定两组分泌的NO含量。
Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测：将诱导后的细胞消化，吹打，离心。取一个24孔板，每孔置入一张干净无菌的小盖玻片，用多聚赖氨酸修饰表面，1~12孔按1×104 /孔接种诱导组细胞，13~24孔按同样密度接种对照组细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养3 d，待细胞爬满盖玻片行免疫组化染色，检测Ⅷ因子相关抗原的表达。
透射电镜检测Weibel-Palade（W-P）小体：将两组剩余细胞分别置入离心管中，1 500 r/min离心15 min，弃上清液，取沉淀的细胞行透射电镜观测。
主要观察指标：①诱导后细胞形态学变化。②NO含量测定。③Ⅷ因子相关抗原的表达。④Weibel-Palade小体检测。
统计学方法：由第一作者采用SPSS(v12.0)软件包进行统计处理，数据均以_x±s表示,组间比较行t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 诱导后细胞形态学变化 倒置显微镜下观察可见，诱导5 d后骨髓间充质干细胞呈集落样分布，细胞形态趋于圆形（图1a）；未诱导的对照组骨髓间充质干细胞均匀散在分布，细胞形态为长梭形和三角形（图1b）。

2.2 NO含量测定 诱导14 d后，诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组，差异有显著性意义[（93.05±5.43），（73.76±4.72）μmol/L；t=3.75，P < 0.05]。
2.3 Ⅷ因子相关抗原的表达 免疫组化检测结果显示，诱导组胞浆内可见染成褐色的颗粒，为Ⅷ因子相关抗原，说明诱导后细胞分泌Ⅷ因子，具有血管内皮细胞功能（图2a）。对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达(图2b)。

2.4 Weibel-Palade小体检测 Weibel-Palade小体是血管内皮细胞中一种有包膜的杆状细胞器，内为与长轴一致的平行管状结构，一般认为Weibel-Palade小体具有储存von willebrandt因子的作用。透射电镜下，诱导组胞浆内可见Weibel-Palade小体（图3）。

3 讨论

血管的发生和生长是生殖、胚胎发育、器官形成、伤口愈合和组织再生过程中的重要环节,根据形成的方式不同分为血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)[10-11]。
血管发生主要发生于胚胎期，通过内皮前体细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化成内皮细胞，在中胚层内形成血管丛进而再形成原始的血管，Drake 等[12]将血管发生过程分为5个连续的步骤：①内皮前体细胞分化出内皮细胞。②内皮细胞相互聚集形成血管原基。③内皮细胞极化形成早期的血管腔。④进而形成新生的血管网。⑤血管周细胞和血管平滑肌细胞聚集在基底膜外形成成熟的血管。
血管生成是指邻近的毛细血管通过出芽的方式长出新血管的过程, 包括血管扩张、基底膜降解、内皮细胞迁移和增生、毛细血管的管样结构形成、新生血管的基底膜形成,血管周细胞和血管平滑肌细胞聚集在基底膜外形成成熟的血管。
组织工程骨血管再生也需经历血管发生和血管生成的过程，血管内皮细胞直接参与血管发生过程后4个连续步骤生成新生血管，同时分泌多种生长因子，通过自分泌和旁分泌作用而加速正常组织毛细血管长入，加速血管生成过程。由于血管内皮细胞是血管生成过程中的最重要的调节细胞，所有的成血管因素皆围绕它发挥作用[13]。
血管内皮细胞和组织工程骨复合植入体内需要大量培养、扩增血管内皮细胞，但内皮细胞培养耗时费力，其规模扩增相当困难，并且内皮细胞的获取创伤较大，来源(静脉或动脉血管)极其有限，因而远不能满足临床需要。
骨髓间充质干细胞中含有大量的多能干细胞,具有间质细胞的特性,能分化成多种细胞类型,不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，而且部分细胞在VEGF作用下可定向分化为血管内皮细胞[14-17]。由于骨髓间充质干细胞获取方便，而且具有强大的增殖潜能体外扩增也比较容易,可以满足自体组织工程骨构建的需要，而且避免了免疫排斥问题，所以是一种组织工程骨细胞移植的优良供体[18-20]。
本实验用血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1联合诱导兔骨髓间充质干细胞，观察其分化方向。结果表明，兔骨髓间充质干细胞经3种细胞因子联合诱导后能定向向血管内皮细胞方向分化，从而为血管内皮细胞提供了新的来源，为骨髓间充质干细胞在复杂器官组织工程血管化中的应用提供了理论与技术上的支持。但诱导所得的血管内皮细胞在动物体内存活、扩增、成血管作用尚待进一步研究。

4 参考文献

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