课题背景：课题属于国家自然科学基金项目(30600624)部分研究内容，目前已经完成重组腺相关病毒载体的包装及鉴定，并完成体外感染兔骨髓基质干细胞功能检测的初步应用试验。

应用要点：①以腺相关病毒作为血管内皮生长因子基因载体，具有无致病性、免疫原性低及宿主范围广、能够感染多种宿主细胞并长期表达等多种优点，克服了目前基因治疗中所采用的质粒脂质体载体转染率低、腺病毒等病毒载体对机体具有一定免疫原性、存在潜在感染危险等缺点。②重组载体同时携带标记基因绿色荧光蛋白，可以方便在病毒包装、纯化过程中监测包装效率及病毒感染效率，并利于后期重组病毒感染宿主细胞后的定位跟踪观察。

偏倚或不足：获得大量重组病毒需反复多次包装、纯化，不利于同期大规模开展，而多次进行包装所获得的病毒粗提液内病毒的含量及滴度可能存在不同，需要在后期进行统一调整。实验获得的携带人血管内皮生长因子基因的高滴度重组腺相关病毒总量仍有不足。重组病毒体外感染骨髓基质干细胞后功能测定还需要从更多角度补充完善。

1西安交通大学第二附属医院骨科，陕西省西安市 710004；2陕西省疾病预防控制中心病毒室，陕西省西安市 710054

黄向辉☆，男，1978年生，山西省运城市人，汉族，西安交通大学在读博士，主治医师，主要从事关节外科方面的研究。
drhxh@163.com

通讯作者：时志斌，博士，讲师，主治医师，西安交通大学第二附属医院骨科，陕西省西安市 710004 jackky9999@sohu.
com

国家自然科学基金（30600624）*

摘要

背景：目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性，且存在潜在感染危险，限制了临床的应用。
目的：拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒，以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞，体外检测病毒生物学活性及功能。
设计、时间和地点：开放性实验，于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。
材料：兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养，取自成年新西兰大白兔；人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带，产妇对本实验知情同意。
方法：从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段，构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP。将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞，通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP。应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞
主要观察指标：荧光显微镜下监测病毒包装效率，感染AAV-HT1080测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。检测重组病毒的感染效率。ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量，人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性。
结果：扩增产物经DNA 测序确定为hVEGF165 cDNA片段，重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确。病毒包装效率达95%以上，收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段，证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功。重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%，感染72 h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达（85.58±5.37）μg/L，分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构。
结论：成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP，该重组病毒

能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子，分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性，可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖。
关键词：骨髓基质干细胞；血管内皮生长因子；腺相关病毒；绿色荧光蛋白

黄向辉，时志斌，王坤正，党晓谦，杨佩，余鹏博.重组hVEGF165腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(21):4097-4101
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4097(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)21-04097-05

收稿日期: 2007-12-07
修回日期：2008-03-05
(07-50-12-6812/ZS·Q)

Construction of recombinant adeno-associated virus carrying human vascular endothelial growth factor 165 and in vitro infection of bone marrow mesenchymal stem cells

Abstract

BACKGROUND: Presently, viral vector used in gene therapy has immunogenicity to the body and has a potential to infect, so it has limitation to be used in clinic.
OBJECTIVE: To construct the non-pathogenic recombinant adeno-associated virus (AAV) simultaneously carrying human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and green fluorescent protein (GFP) label, and assess its biological activity and function by infecting rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro.
DESIGN, TIME AND SETTING: An open experiment was performed at the Laboratory of Virus of Shanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention between March and November 2007.
MATERIALS: BMSCs were harvested from mature New Zealand rabbits after primary culture by the experimenter. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were harvested from infant umbilical cores of healthy parturients. Informed consents were obtained from parturients.
METHODS: Plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP was constructed by hVEGF165 segments amplified from plasmid pUC18-hVEGF165 carrying hVEGF165 gene. The recombinant expression plasmid pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP was co-transfected into AAV-293 cells with pAAV-Helper and pAAV-RC for recombinant AAV replication and package through homologous recombination. In vitro cultured rabbit BMSCs were infected with this recombinant virus.
MAIN OUTCOME MEASURES: The efficiency of AAV packaging was monitored under a fluorescent microscope and the virus titer was measured through infecting AAV-HT1080, and the recombinant virus was verified by polymerase chain reaction (PCR) of the exogenous interest gene. Through infecting rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro, the infection efficiency was detected. The expression of VEGF165 in BMSCs was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and its biological activity was assessed by angiopoiesis experiment of HUVECs in vitro.
RESULTS: The hVEGF165 gene was successfully amplified and recombinant pAAV-hVEGF165-IRES-GFP was verified by double digestion. The system provided a high packing ratio of more than 95% and the purified recombinant virus had a high titer of 5.5×1011 vp/mL. The recombinant virus was confirmed by exogenous human VEGF165 gene PCR. The rAAV-VEGF165-GFP could infect rabbit BMSCs at a ratio of 40%. With rAAV-VEGF165-GFP infection, the expression of VEGF165 in the conditional medium was detected by ELISA at a concentration of（85.58±5.37）μg/L 72 hours after infection. HUVECs became extended, deformed, pullulation, cross-linking and showing tube-shape affected by VEGF protein.
CONCLUSION: The non-pathogenic rAAV-hVEGF165-GFP simultaneously carrying hVEGF165 and GFP label is successfully constructed, with the ability of infecting rabbit BMSCs to efficiently express hVEGF165，and hVEGF165 expressed in BMSCs has a satisfying biological activity of stimulation of HUVECs proliferation.

Huang XH, Shi ZB, Wang KZ, Dang XQ, Yang P, Yu PB.Construction of recombinant adeno-associated virus carrying human vascular endothelial growth factor 165 and in vitro infection of bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(21):4097-4101(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-21/21k-4097(ps).pdf]

0 引言

血管内皮生长因子是最主要的血管生成因子之一，能特异性作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞分裂增殖，诱导血管形成。血管内皮生长因子与骨的形成和修复也有着非常密切的关系。近年来随着基因治疗的飞速发展,以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床，但目前基因治疗中所采用的质粒载体转染率低，腺病毒等病毒载体对机体具有一定免疫原性，存在潜在感染危险性，限制了临床应用。本实验利用无致病性的腺相关病毒作为hVEGF165基因载体，成功构建了携带绿色荧光蛋白标记的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP，并通过该重组病毒将hVEGF165基因转入兔骨髓基质干细胞，于体外对该重组病毒的生物学活性及功能进行检测。

1 材料和方法

设计：开放性实验。
单位：西安交通大学第二附属医院骨科，陕西省疾病预防控制中心病毒室。
材料：实验于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。①细胞、菌株及质粒：兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养，取自成年新西兰大白兔（购于西安交通大学实验动物中心）；人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带，由西安交通大学第二附属医院妇产科提供，产妇均签署知情同意书；病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司；E coli DH5α菌株由陕西省疾病预防控制中心保存；AAV helper-free system腺相关病毒包装系统购自Stratagene公司；重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建。②主要试剂：工具酶及DNA marker等相关试剂材料(TaKaRa公司）；PCR反应试剂PCR Master Mix（北京天为时代公司）；引物合成及测序由北京奥科生物公司完成；Human VEGF Elisa kit（Ray biotech公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者, 干预实施为全部作者, 评估为第二、三作者。均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-VEGF165-IRES-GFP的构建：按照PUBMED公布的人VEGF165基因（NM00376）设计上下游引物：F：5’- CCG AAT TCA TGA ACT TTC TGC TGT CTT G-3’，R：5’- GGC CTC GAG TCA CCG CCT CGG CTT GTC –3’，上游引入EcoR I酶切位点，下游引入XhoI酶切位点。以前期获得并经纯化的重组质粒pUC18- hVEGF165为模板，进行PCR扩增反应。使用EcoR I、XhoI双酶切后，将目的基因片段定向克隆入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-GFP的多克隆位点中。筛选重组阳性克隆，标记为pAAV-VEGF165-IRES-GFP。

重组腺相关病毒包装制备：常规培养AAV-293细胞，包装24 h前接种于细胞培养皿。取重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper 各10 μg，使用磷酸钙法三质粒共转染AAV 293细胞进行重组病毒包装(rAAV-VEGF165-hrGFP包装组)。转染孵育6 h后，更换含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下继续培养72 h完成病毒包装。同时取空骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP与pAAV-RC、pHelper 三质粒共同转染AAV 293细胞，用来包装携带GFP标记基因的AAV空病毒（rAAV-GFP对照组）。并以10 μL TE替代骨架质粒，其余转染条件不变作为阴性对照（阴性对照组）。监测各组AAV 293细胞表型变化及细胞毒性反应，荧光显微镜下观察各组AAV 293细胞中绿色荧光蛋白表达量。转染72 h病毒包装完成后，按照氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提方法进行病毒的纯化与浓缩[1]。
重组腺相关病毒感染滴度测定：取纯化病毒液，梯度稀释后分别感染接种于24孔板内的AAV-HT1080细胞,同时设无病毒感染阴性对照孔。培养48 h后，荧光显微镜下观察各孔细胞绿色荧光蛋白表达量。计数各孔荧光细胞数量（n），重组AAV 感染滴度(vg/mL) = n ×该孔纯化病毒液稀释倍数。
重组病毒基因组外源DNA 鉴定：使用QIAamp DNA MINI KIT收集提取样品中的病毒DNA。取1 μL获得的病毒DNA基因组溶液作为模板，以hVEGF165上下游引物进行PCR 扩增反应（反应条件同前），扩增产物凝胶电泳分析鉴定hVEGF165外源目的基因的存在。
重组病毒对兔骨髓基质干细胞的感染效率及最佳感染复数测定：按照文献[2]报道的方法获得兔骨髓基质干细胞，以感染复数分别为1×102，5×102，1×103，5×103，1×104，5×104，1×105感染骨髓基质干细胞。监测骨髓基质干细胞表型变化及细胞毒性反应，感染72 h后荧光显微镜下观察标记基因绿色荧光蛋白表达量，确定最佳感染复数及感染效率。
骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子含量测定：用重组病毒rAAV-VEGF165-hrGFP以最佳感染复数感染第3代兔骨髓基质干细胞，分别于病毒感染后第24，48，72 h，取病毒感染组和无病毒感染对照组的细胞培养上清，按照Human VEGF Elisa kit说明书进行血管内皮生长因子含量测定，4个平行孔/孔，结果取其平均值。
骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子蛋白活性检测：按照文献[3]方法分离培养人脐静脉内皮细胞，按照5×104/孔密度接种于24孔板中的matrigel上。培养过夜后，试验组加入rAAV-hVEGF165-hrGFP感染兔骨髓基质干细胞72 h后收获的培养上清1 mL，对照组加入无病毒感染兔骨髓基质干细胞培养上清1 mL，37 ℃孵育24 h后观察两组管状血管的形成情况。
主要观察指标：①重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-VEGF165-IRES-GFP的鉴定。②重组腺相关病毒包装效率观察。③重组腺相关病毒感染滴度测定结果。④重组病毒DNA扩增外源目的基因鉴定结果。⑤重组病毒对兔骨髓基质干细胞的感染效率及最佳感染复数测定结果。⑥骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子含量测定。⑦骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子蛋白活性分析。
统计学方法：由第一、五作者采用SPSS 11.0软件进行统计处理，数据以_x±s表示，组间比较采用t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-VEGF165-IRES-GFP
的鉴定 成功从PUC18-VEGF165质粒扩增出hVEGF165基因片段，测序结果正确；重组质粒pAAV-VEGF165-IRES-
GFP经EcoR I、XhoI双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见600 bp处hVEGF165特异性条带，见图1。

2.2 重组腺相关病毒包装效率观察 倒置显微镜下观察AAV-293细胞表型变化可见：rAAV-hVEGF165-GFP重组病毒包装组和rAAV-GFP空病毒对照组培养液颜色变黄，细胞聚集较多，部分细胞聚集漂浮于培养液中；阴性对照组变化不明显。倒置荧光显微镜观察重组腺相关病毒包装效率：rAAV-hVEGF165-GFP重组病毒包装组和AAV-GFP空病毒对照组三质粒共转染24 h后已有少量荧光细胞出现，随时间延长表达荧光细胞数增多，荧光逐渐增强；转染72 h后表达绿色荧光细胞数比例可达95%~100%，见图2；阴性对照组AAV 293细胞无绿色荧光表达。
2.3 重组腺相关病毒感染滴度测定结果 病毒感染AAV-HT1080细胞48 h后，各孔绿色荧光蛋白细胞表达量与病毒浓度呈正相关，感染效率最高达90%以上，见图3。采用荧光计数法计算重组AAV感染滴度为5.5× 1011 vg/mL。

2.4 重组病毒DNA扩增外源目的基因鉴定结果 重组病毒组可观察到约600 bp大小的目的条带，其大小与外源基因hVEGF165片段相符合；而空病毒对照组没有扩增出目的条带。说明外源目的基因hVEGF165片段已成功包装入腺相关病毒并融合于病毒基因组内，证实重组病毒rAAV-hVEGF165-GFP包装成功。
2.5 重组病毒对兔骨髓基质干细胞的感染效率及最佳感染复数测定结果 病毒感染72 h后可见骨髓基质干细胞内成功表达标记基因GFP，感染复数小于1×104/cell时，各孔绿色荧光蛋白细胞表达量与病毒用量呈正相关，但感染复数大于1×104/cell后继续加大病毒用量并不能明显提高感染效率。因此认为重组AAV病毒感染兔骨髓基质干细胞的最佳感染复数为1×104，此感染复数下重组病毒对兔骨髓基质干细胞的感染效率约为40%，见图4。
2.6 骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子含量测定 rAAV-VEGF165-GFP感染组可以检测到人血管内皮生长因子的高表达，对照组未检测到该因子表达。当感染复数为1×104时，病毒感染24、48、72 h后测定培养上清中血管内皮生长因子浓度分别为（44.18±5.12），（65.60±5.34），（85.58±5.37）μg/L，上清中血管内皮生长因子浓度随感染时间的增加而升高，在感染72 h后达高峰。

2.7 骨髓基质干细胞感染后血管内皮生长因子蛋白活性分析 重组病毒组培养24 h后人脐静脉内皮细胞形态发生显著改变，由悬浮培养状态下的圆球型开始变形，拉长，出芽，伸出管状突起，而对照组细胞形态改变不明显。计算5个不同低倍镜视野下平均管状血管的长度，两组差异显著（P < 0.01），表明重组rAAV-VEGF165-hrGFP感染骨髓基质干细胞后分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性。

3 讨论

血管内皮生长因子是一种可结合肝素的二聚体糖蛋白，是最主要的血管生成因子之一。它能作用于血管内皮细胞,促进内皮细胞分裂增殖及血管形成, 而且与骨的再生和血管化有着密切关系[4]。国外已有研究证明, 血管内皮生长因子不但能通过旁分泌作用刺激内皮细胞分泌成骨性物质,而且还能直接作用于成骨细胞和破骨细胞，在引导血管生成的同时可促进成骨、破骨细胞的分化，诱使成骨细胞发生趋化、增殖而促进新骨形 成[5-7]。MayrWohlfart等[8]在体外培养人成骨细胞时加入hVEGF165,其增殖能力提高70%,细胞趋化性迁移指数(CI)达到2。邹平洲等[9]在兔桡骨骨缺损模型中应用血管内皮生长因子后能加速移植异体骨的血管化和爬行替代, 促进骨缺损修复。同时，更多研究表明成骨细胞在各种生长因子刺激下也能合成血管内皮生长因子[10-13]。而抑制血管内皮生长因子则可阻碍骨形成蛋白2诱导的血管生成以及骨形成蛋白1诱导的原始成骨细胞分化和骨形成蛋白4诱导的骨形成，影响实验性小鼠股骨骨折愈合和皮质骨缺损的修复,减少兔桡骨骨折后血供而导致骨不 连[10,12,14-15]。总之，骨的形成和修复是受多种生长因子和激素调控的复杂生理活动，不同生长因子可能作用于骨形成的不同阶段并存在协同作用，而血管内皮生长因子很可能就是这些骨生长因子的中介因子，是血管生成与骨再生协同作用的物质基础[16]。
有研究表明激素性股骨头坏死模型中VEGF mRNA
表达量早期明显减少, 提示股骨头坏死后血管修复能力下降,血管内皮细胞的功能受到破坏影响[17]。因此采取有效手段促进坏死区血管再生和新骨形成是治疗股骨头缺血性坏死的关键。有学者通过局部应用血管内皮生长因子治疗兔股骨头坏死模型取得一定效果[18]，但是由于血管内皮生长因子蛋白制备复杂，体内注射半衰期短,缺氧条件下只有4~6 h，需重复给药，限制其临床应用；因此利用载体系统将hVEGF基因片断导入宿主细胞发挥治疗作用正逐渐得到深入研究，而选择安全有效的载体系统进行基因转移和正确表达则是这种方法的关键所在。腺相关病毒载体是目前基因治疗中一种具有多种优势的载体系统，腺相关病毒属微小病毒科，是一种复制缺陷型病毒，需要其他病毒的辅助才能够进行有效复制，它不含有任何已知人类疾病的相关序列，对人类无致病性，因此是目前安全性最好的病毒载体之一[19]；腺相关病毒免疫原性极低，能够感染各种宿主细胞，包括分裂期和静止期的多种细胞，且能定点整合到宿主细胞基因组中，因此能携带外源基因进入宿主细胞并长期表达[20]。本实验采用Stratagene AAV helper-free system三质粒共转染方法进行重组病毒包装, 病毒包装和复制所必须的rep和cap基因包含在辅助质粒中，在含有末端重复序列（ITR）的骨架质粒中没有任何rep和cap基因的同源区域，因此防止了因同源重组产生野生型AAV2的潜在危险性。同时，利用本系统包装rAAV2时不需要腺病毒辅助病毒的参与，使基因转移更加安全可靠。本实验采用磷酸钙法进行转染，具有操作简单、成本低、转染效率高的优点。重组病毒感染Stratagene公司经过优化的滴度检测细胞AAV-HT1080，排除了因各种细胞易感性不同而引起的差异，并排除了不含目的基因病毒空壳对结果的影响,使病毒滴度检测更加稳定可靠。载体中的标记基因GFP可以方便在病毒包装、纯化过程中监测包装效率及病毒感染效率，并利于后期重组病毒感染宿主细胞后的定位跟踪观察。
本实验成功包装出重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP及rAAV-GFP空病毒，收获的病毒液具有较高的病毒浓度及活性，可以进一步感染目的细胞进行体外、体内实验。应用重组病毒rAAV-hVEGF165-GFP感染兔骨髓基质干细胞的检测结果表明：重组病毒能够有效感染兔BMSC，且能够在骨髓基质干细胞内有效表达标记基因GFP及目的蛋白VEGF165；重组病毒感染兔骨髓基质干细胞后可以表达出具有生物活性的VEGF165蛋白，在体外血管形成试验中刺激HUVEC增殖和血管样结构形成。证实重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP能够作为将hVEGF165基因导入骨髓基质干细胞的有效载体，并能够表达出具有生物活性的VEGF165蛋白，为下一步利用腺相关病毒载体介导hVEGF165表达的组织工程研究提供了实验基础。

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