冯登超，贺光照，江 川，杨天荣，张恒术
Inhibiting effects of Artemisinin on hypertrophic scar in rabbit ears

Feng Deng-chao, He Guang-zhao, Jiang Chuan, Yang Tian-rong, Zhang Heng-shu
Abstract

AIM: Some studies have demonstrated that Artemisinin can inhibit the proliferation of many tumor cells, and Artemisinin has been proved to prevent and cure hypertrophic scar in clinical practice. But the mechanism is not detailed. This study is aimed to verify the inhibiting effect of Artemisinin on the hypertrophic scar in rabbit ears.
METHODS: This study was carried out in the Key Laboratory for Neurology of Chongqing City between September 2006 and March 2007. Sixteen New Zealand rabbits of either gender, weighing (2.5±0.3) kg, were taken as experimental animals and randomized into experimental group (n=12) and control group (n=4). Artesunate were supplied by Guangxi Guilin Pharmaceutical Company. The hypertrophic scar models in rabbit ears were reproduced. The scars of every four rabbits in the experimental group received Artesunate by local injection in different doses of 40, 80, 120 g/L on postoperative 6th day. The scars of rabbits in the control group were treated with 50 g/L NaHCO3 by local injection into wound basilar part and wound site. On postoperative 28th and 56th days, the hypertrophic index and the rate of scars were detected. Hematoxylin-eosin staining was applied to observe the morphological change of scars under light microscope.
RESULTS: Sixteen experimental rabbits were all involved in the final analysis. Compared with the control group, the hypertrophic index and the rate of scars in the Artesunate treated group were significantly reduced in a dosage-dependent manner (P < 0.05, 0.01). The proliferation of fibroblast was obviously inhibited and the contents of collagen fiber were decreased in the Artesunate treated group under light microscope on the postoperative 28th day. Hematoxylin-eosin staining results showed that, the dermises of the scars in the Artesunate treated group were thinner and contained few fibroblasts. Collagen fibers were well-arranged, and neither collagen node or collagen node was significant. Meanwhile, more fibroblasts were found in the control group, collagen fibers were swirls and collagen node was formed.
CONCLUSION: Artesunate can inhibit formation of hypertrophic scar and hyperplasy of scar tissue in rabbit ears.
Feng DC, He GZ, Jiang C, Yang TR, Zhang HS. Inhibiting effects of Artemisinin on hypertrophic scar in rabbit ears.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4601-4605(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4601(ps).pdf]

摘要

目的：许多研究报道青蒿素能抑制多种肿瘤细胞的增殖活性，临床证实青蒿素对增殖性瘢痕也有抑制作用，但是其机制不详。实验拟验证青蒿素对兔耳增生性瘢痕的影响。
方法：实验于2006-09/2007-03在重庆市神经病学重点实验室完成。①实验分组：新西兰大白兔16只，体质量（2.5±0.3）kg，兔耳健全，雌雄不拘，随机数字表法分为对照组（n =4）和青蒿琥酯组（n =12）；青蒿琥酯由广西桂林南药股份有限公司提供。②实验方法：建立兔耳增生性瘢痕动物模型，术后第6天，开始向创面基底部及创面灶内局部注射50 g/L NaHCO3；青蒿琥酯组各选4只兔分别注射浓度为40，80，120 g/L 的青蒿琥酯钠。③实验评估：术后28，56 d 测定瘢痕发生率及瘢痕增生指数的变化；苏木精-伊红染色后光镜下观察瘢痕的变化情况。
结果：纳入大白兔16只，均进入结果分析。①青蒿琥酯可以降低兔耳瘢痕发生率及瘢痕增生指数，与对照组相比，差异显著（P < 0.05，P < 0.01）；其抑制瘢痕增生效果与青蒿琥酯浓度呈剂量依赖性。②术后28 d 光镜下见青蒿琥酯能明显抑制成纤维细胞增殖及降低胶原纤维的含量。③苏木精-伊红染色显示，青蒿琥酯组：真皮层变薄，成纤维细胞数量较少，胶原纤维密度下降，胶原纤维排列规则，无胶原结节或者胶原结节不明显。而对照组真皮层较厚，成纤维细胞密集，胶原纤维旋涡状，形成胶原结节。
结论：青蒿琥酯可明显抑制兔耳创面增生性瘢痕的形成及瘢痕组织增生。
关键词：增生性瘢痕；青蒿素；动物模型；组织构建

冯登超，贺光照，江川，杨天荣，张恒术. 青蒿素对兔耳创面瘢痕增生的抑制效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4601-4605 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4601(ps).pdf]

课题背景：青蒿素最初主要用于治疗疟疾。1998年贺光照等首次将青蒿素用于增殖性瘢痕的治疗，随后又进行人瘢痕成纤维细胞体外培养，结果显示青蒿素可呈剂量和时间依赖性地抑制成纤维细胞增殖，并明显降低细胞外胶原量。本课题旨在通过建立兔耳瘢痕模型，动态观察青蒿素对兔耳创面瘢痕形成的影响，为瘢痕防治及药物临床应用提供实验和理论依据。 应用要点：本实验结果初步显示青蒿琥酯组抑制瘢痕增生效果与浓度呈正比，表明青蒿素对兔耳创面瘢痕的形成有明显抑制作用。青蒿琥酯为中药青蒿素的衍生物，其药性作用强，副作用小，进一步研究其药理活性，可望开发出高效、低毒、价廉的抗瘢痕新药，有望成为预防和治疗人皮肤增生性瘢痕的有效药物。 相关链接：目前增生性瘢痕的动物模型可以分为两大类，一是将人的增生性瘢痕组织移植于裸鼠；二是在兔耳上制作创面，然后让其出现瘢痕增生。前者移植后相当长的时间内可保持增生性瘢痕的特性，可以客观准确地观测某种或某些因素对增生性瘢痕的作用。后者可以对从创面愈合至瘢痕增生的全过程进行研究，而且研究的对象未脱离其发生发展的原环境。

0 引言

增生性瘢痕是皮肤创伤后组织过度修复引起的以胶原等大量细胞外基质产生和沉积为特征的皮肤纤维化疾病[1-2]，无论在功能上还是在外观上都给患者身心健康带来极大的危害。由于对增生性瘢痕的发病机制缺乏足够的认识，临床上亦未能找到有效的治疗方法。瘢痕发生的机制至今仍不甚明了，但已发现细胞凋亡参与了肉芽组织向瘢痕组织转化过程中多种细胞成分大量减少的动态过程[2]，当某些原因引起肉芽组织中成纤维细胞凋亡不足或中断，增殖相对过度，则导致创面发展成病理性瘢痕[2-3]。青蒿琥酯(Artesunate，Art)属青蒿素的水溶性衍生物，临床上主要用于疟疾的治疗。近年发现该药在抗瘢痕方面具有一定作用，体内外实验研究结果显示，青蒿琥酯对成纤维细胞有抑制生长和杀伤作用[4-6]。
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是现代医学的难题之一，研究上一直没有找到一种令人满意的动物模型。兔耳腹侧面皮肤全层缺损后产生瘢痕组织类似人皮肤增生性瘢痕[7]，这为瘢痕研究提供了一种很好的实验材料。本实验旨在通过建立兔耳增生性瘢痕模型，探讨青蒿素对兔耳创面瘢痕形成的影响，为瘢痕防治及药物临床应用提供实验和理论依据。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：重庆医科大学附属第一医院烧伤整形科。
材料：实验于2006-09/2007-03在重庆市神经病学重点实验室完成。新西兰大白兔16只，体质量（2.5±0.3）kg，兔耳健全，雌雄不拘，购自重庆医科大学动物实验中心（动物合格证号：SCXK(渝)20020001）。青蒿琥酯(纯度99.99%，广西桂林南药股份有限公司，国药准字：H10930195，批号：ZA061004) 。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一、三作者，评估为第二、四、五作者。均经过正规培训，采用单盲法评估。
方法：
动物模型的制备及干预分组：将动物分笼饲养1周。瘢痕模型的制作参照Morris等[7]和李荟元[8]方法建立兔耳增生性瘢痕模型，并加以改良，用30 g/L 戊巴比妥钠(30 mg/kg)作耳缘静脉麻醉，严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧沿长轴避开可见血管，作1 cm×1 cm大小创面，创面间隔1 cm 以上，去掉兔耳全层皮肤及软骨膜，创缘用烙铁烧灼，每只兔耳作6个相同创面（见图1），共192个创面，术后创面暴露，待创面自行愈合。术后第6天，待创面较干燥后，将兔随机数字表法分为对照组（n=4）和青蒿琥酯组（n=12），各组均用微量注射器从创面周围的正常皮肤进针向创面基底部及创面灶内局部注射50 g/L NaHCO3；青蒿琥酯组各选4只兔分别注射浓度为40，80，120 g/L 的青蒿琥酯钠。注射用量均为每处20 μL，每隔3天1次，共8次。

标本收集：术后28 d 用30 g/L 戊巴比妥钠1.0 mL/kg (30 mg/kg)作耳缘静脉麻醉，各组随机处死2只兔子，切取标本。余继续喂养，术后56 d，同样在麻醉条件下各组处死最后2只兔子，切取瘢痕组织标本，用体积分数为0.04的中性甲醛固定，石蜡包埋，然后进行苏木精-伊红染色光镜下检查。
伤口愈合和瘢痕演变观察：观察各组创面上皮化时间，术后28，56 d 观察并记录伤口愈合及瘢痕增生情况。瘢痕组织高度≥2 mm，硬度与兔耳软骨相似时即为增生性瘢痕[9]。测定瘢痕增生指数(Hypertrophic Index，HI)，显微镜下用测微尺测量相对增生厚度，设定瘢痕的高度（Scar height）为SH，正常皮肤高度（Dermis height）为DH，则HI=SH/DH。
主要观察指标：①各组实验兔创面愈合、上皮化时间及瘢痕增生情况。②青蒿琥酯组的瘢痕增生指数及瘢痕发生率。
统计学处理：由第一作者采用SPSS 12.0软件进行方差分析和q检验，实验数据以x(_)±s表示。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入大白兔16只（32只耳），均进入结果分析，无脱落。
2.2 各组创面瘢痕形成情况 愈合过程中上皮化时即能触到硬块，此硬块不断高于皮面，淡红色，增生范围不超过原创缘，大约26~28 d 增生达到最高峰。青蒿琥酯各浓度组兔耳瘢痕质地较对照组柔软、平整。虽然青蒿琥酯可以延迟兔耳创面的上皮化时间，但是与对照组相比，差异无显著性意义（P > 0.05），见表1。相反，青蒿琥酯具有抗瘢痕作用，可使瘢痕明显软化、变平，使瘢痕发生率大大降低，见表2。

2.3 术后不同时间兔耳瘢痕增生指数的变化 见表3。

2.4 组织切片观察
2.4.1 对照组 镜下显示术后28 d 瘢痕组织真皮层明显增厚，为周边正常真皮层厚度的三四倍，真皮主要是大量成纤维细胞增殖，胶原纤维多而致密粗大，排列紊乱，可见漩涡状结构和胶原结节，见图2，其间有少量炎性细胞，结构近似人的增生性瘢痕组织。

2.4.2 青蒿琥酯组 40 g/L 青蒿琥酯组：真皮层厚度约为正常真皮层厚度的2.5~3.0倍，成纤维细胞数量较少，胶原纤维致密下降，表层排列规则，呈水平向，内层排列方向似漩涡状，见图3。

80 g/L 青蒿琥酯组：真皮层厚度约为正常真皮层厚度的2.5倍，成纤维细胞数量减少，核较小，胶原纤维致密下降明显，多层水平向排列，见图4。

120 g/L 青蒿琥酯组：真皮层厚度约为正常真皮层厚度的2.0倍，成纤维细胞数量明显减少，核较小，胶原纤维束间有较大的空隙，排列比较规则，呈水平方向，见图5。

3 讨论

增生性瘢痕是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象，其本质是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积，其中胶原等细胞外基质主要是由成纤维细胞合成和分泌[10]。病理性瘢痕成纤维细胞的生物学行为一直是国内外学者研究的重点[11]。严重创伤、烧伤及外科手术后常常遗留增生性瘢痕，瘢痕对人而言，轻则影响外观、影响机体的正常功能，重则躯体外形改变、容貌毁坏[12]。由于增生性瘢痕的发生机制目前仍未阐明[12]，至今还缺乏具有临床指导意义的应用基础理论和令人满意有效的防治方法。目前治疗方法主要有手术切除、类固醇激素、抗代谢药、免疫抑制剂、放射疗法和硅胶膜等[13]，均未达到控制瘢痕生长防治复发的目的。因术后易复发或严重的全身性副作用而限制了临床应用，因此从祖国中医中药中筛选出疗效确切、副作用小的抗瘢痕纤维化的有效药物，具有重要的临床意义。
目前有关药物防治瘢痕增生的研究已经取得了一定成绩，但尚无动物本身产生的瘢痕模型，这已经成为更深入研究瘢痕发生、发展及其转归的重大缺憾。1997年Morris等[7]发现在兔耳急性及慢性创面上有明显的真皮过度增生，可以产生类似人类增生性瘢痕组织样的增生性包块。从1998年起解放军第四军医大学西京医院整形外科李荟元教授等开始了在兔耳建立瘢痕动物模型的研究，证实了兔耳创面可以产生与人类增生性瘢痕结构、性状近似的增生组织块，利用此模型可以对瘢痕进行动态、连续的观察和研究[13]。
青蒿素是中国药学工作者于1971年从植物黄花蒿Artemisia annua L.叶中提取分离得到的一个具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，最初主要用于治疗疟疾。1998年徐德忻等[14]研究发现青蒿素对实验性矽肺有明显的治疗作用，矽肺的发生是由于成纤维细胞增生，胶原合成增多导致肺内胶原沉积所致，提示青蒿素具有抗纤维化作用。1998年贺光照等[15]首次将青蒿素用于增殖性瘢痕的治疗，通过局部应用青蒿素霜剂对50例增殖性瘢痕进行疗效观察，发现其具有抗瘢痕作用，治疗1~3个月后瘢痕红、痒痛症状减轻或消失，瘢痕质地变软、变平，有效率88%。随后又进行人瘢痕成纤维细胞体外培养，观察并分析了其对增殖性瘢痕成纤维细胞的增殖活力及胶原合成功能的影响，结果表明，青蒿素可呈剂量和时间依赖性地抑制成纤维细胞增殖，并明显降低细胞外胶原量[4]。孔恒等[16]研究发现青蒿琥酯能诱导体外培养的瘢痕成纤维细胞凋亡。李伟等[5]用青蒿琥酯作局部瘢痕内注射，观察其对兔耳增生性瘢痕形成的影响，结果发现，青蒿琥酯组兔耳瘢痕组织中胶原含量较对照组明显减少。
近年来的研究发现青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用以外，对人类多种肿瘤细胞在体外有杀伤作用或抑制作用[17-22]，可以诱导肿瘤细胞的凋亡[20，23-24]。临床上，深Ⅱ度烧伤愈合后常出现瘢痕过度增生，增生性瘢痕在愈后一定时间内生长失控，与肿瘤有一定的相似性[25]。最近孔恒等[6]等将不同浓度青蒿琥酯（30，60，120 mg/L）作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞发现，青蒿琥酯组在60~240 mg/L 浓度范围内抑制成纤维细胞生长且呈剂量及时间依赖性，细胞出现凋亡征象；在30~120 mg/L 作用成纤维细胞24 h 可引起细胞内钙离子浓度持续增加。认为青蒿琥酯通过作用于成纤维细胞周期诱导细胞凋亡，细胞内钙离子浓度升高可能是其诱导成纤维细胞凋亡的机制之一。
本实验在兔耳创面尚未上皮化时，通过早期应用青蒿琥酯对兔耳创面瘢痕防治的实验发现，尽管在伤口尚未上皮化时局部注射青蒿琥酯可延迟创面愈合，但与对照组比较，差异无显著性（P > 0.05）；青蒿琥酯各浓度组真皮层厚度及成纤维细胞数目较对照组明显减少；胶原纤维致密下降，排列较规则；瘢痕发生率降低；且治疗组瘢痕增生指数明显低于对照组（P < 0.05，P < 0.01）。
本实验结果初步显示，青蒿琥酯组抑制瘢痕增生效果与浓度呈正比，浓度最高者(120 g/L)效果最显著，表明青蒿素对兔耳创面瘢痕的形成有明显抑制作用。推测其机制可能是青蒿素通过以下途径抑制瘢痕的增生：①直接抑制成纤维细胞的生长增殖或诱导其凋亡而抑制瘢痕成纤维细胞增殖，从而减少胶原的合成和分泌。②增加胶原酶产生、增强胶原酶活性，促使已形成的胶原纤维降解和纤维重吸收。青蒿素作为相对安全的治疗疟疾的药物，口服没有明显毒性反应，体内抗肿瘤实验中也没有明显不良反应。青蒿琥酯为中药青蒿素的衍生物，其药性作用强，副作用小，进一步研究其药理活性，可望开发出高效、低毒、价廉的抗瘢痕新药，有望成为预防和治疗人皮肤增生性瘢痕的有效药物。

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