成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测***☆○
宋 飞1，2，梅冠宇2，宋克东2，姜丽丽2，文鹏飞2，刘天庆2，马学虎2，崔占峰3○
Respiration rate of rat osteoblasts in varied in vitro culture methods
Song Fei1,2, Mei Guan-yu2, Song Ke-dong2, Jiang Li-li2, Wen Peng-fei2, Liu Tian-qing2, Ma Xue-hu2, Cui Zhan-feng3
Abstract

BACKGROUND: Tissue-engineered seed cells combined with microcapsule technique are widely used in cell therapy, gene therapy and drug controlled release to detect consumed oxygen and respiration rates of osteoblasts. This method can provide a related theoretical basis for osteoblast in vitro culture, amplification and three-dimensional construction of engineered bone tissues, as well as above-mentioned experiments.
OBJECTIVE: To compare consumed oxygen qualities and respiration rates of osteoblasts cultured in static direct culture and cyst culture in vitro.
DESIGN, TIME AND SETTING: The control experiment was performed at the Research and Development Center for Stem Cells and Tissue Engineering (i.e. National Key Laboratory of Fine Chemicals), Dalian University of Technology, Liaoning Province, China from March to September 2007.
MATERIALS: Ten 2-3 days SD rats of SPF grade and both genders were selected. Sodium polymannuronate solution was purchased from Tianjin Yuanhang, China.
METHODS: Cranial bone was sterilely obtained from each rat, sliced into 1 mm×1 mm blocks. Sections were digested with 2.5 g/L trypsin solution and 1 g/L typeⅡ collagenase, incubated in DMEM containing bovine calf serum of 0.1 volume fraction. When at the density of 109 L-1, cells were incubated in T-25 medium. At the second and third passages, cells were cultured directly in culture flasks or encapsulated cultured by calcium alginate microcapsules.
MAIN OUTCOME MEASURES: Adhesion, extension and distribution of osteoblasts in culture flasks or during encapsulated culture under an inverted phase contrast microscope; cell growth curve; biological function and respiration rates of osteoblasts in different culture fashions.
RESULTS: Primary culture of osteoblasts was adhered to the flask, showing spindle and polygonal. After encapsulated culture, osteoblasts were round and evenly distributed. Biological function of in vitro cultured osteoblasts was good. The outcomes of in vitro static direct culture and encapsulated culture were good. Respiration rates were 5.56×10-6 μmol/min and 1.25×10-7 μmol/min, respectively.
CONCLUSION: Consumed oxygen qualities and respiration rates of osteoblasts were higher in the in vitro direct culture compared with the encapsulated culture. Varied biological functions of osteoblasts in both cultures are good, which can provide significant instruction for further studies on seed cells in tissue engineering.

Song F, Mei GY, Song KD, Jiang LL, Wen PF, Liu TQ, Ma XH, Cui ZF. Respiration rate of rat osteoblasts in varied in vitro culture methods.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4606-4610(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4606(ps).pdf]

摘要

背景：近年来组织工程种子细胞结合微胶囊技术在细胞治疗、基因治疗和药物控制释放等方面的应用越来越广泛，检测成骨细胞的耗氧量和耗氧速率，可为成骨细胞在不同培养模式中的体外培养、扩增和工程化骨组织的三维构建以及以上方面的实验提供相关的理论依据。
目的：实验拟对比成骨细胞在体外静态直接培养和包囊培养两种不同方式中的耗氧量和耗氧速率。
设计、时间及地点：对比观察，于2007-03/09在大连理工大学精细化工国家重点实验室干细胞与组织工程研发中心完成。
材料：出生二三天SD大鼠10只，SPF级，雌雄不拘；海藻酸钠溶液购自天津远航化学品有限公司。
方法：无菌条件下取大鼠颅骨，剔净后剪成1 mm×1 mm 碎组织块，经2.5 g/L 胰蛋白酶溶液和1 g/L Ⅱ型胶原酶溶液分别消化后，加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基，调节细胞浓度为109 L-1 后接种在T-25培养瓶内。取二三代细胞分别接种于培养瓶中直接静态培养和经海藻酸钙微胶囊包囊后培养。
主要观察指标：倒置相差显微镜下观察成骨细胞在静态培养瓶中和包囊培养过程中的黏附、伸展、分布情况，并测定细胞生长曲线。检测成骨细胞的生物学性能及不同体外培养方式中成骨细胞消耗氧的速率。
结果：①原代培养的成骨细胞为贴壁生长，形态多为梭形或多边形。经包囊培养后成骨细胞在海藻酸钙微胶珠中呈圆形，细胞分布均匀。②体外培养的成骨细胞各种生物学性能良好。③体外静态培养瓶与包囊培养效果良好，耗氧速率分别为5.56× 10-6 μmol/min 和1.25×10-7 μmol/min。
结论：体外静态直接培养的耗氧量和耗氧速率高于包囊培养法，体外静态培养与包囊培养的成骨细胞各种生物学性能都良好，适于作为组织工程的种子细胞进行下一步的实验。
关键词：骨组织工程；成骨细胞；耗氧速率；体外培养；包囊

宋飞，梅冠宇，宋克东，姜丽丽，文鹏飞，刘天庆，马学虎，崔占峰. 成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4606-4610 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4606(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：课题为国家自然科学基金 (30670525)、大连理工大学青年教师培养基金(893228)和大连市科学技术基金（2005E11SF068）资助项目。本实验使用体外静态直接培养和包囊培养两种模式分别进行SD大鼠成骨细胞的扩增，比较其在这两种培养环境中的耗氧量和耗氧速率。 同行评价：实验结果发现体外静态培养的耗氧量显著高于包囊培养法，体外静态培养与包囊培养的成骨细胞各种生物性能均良好，适于作为组织工程的种子细胞进行下一步的实验。文章对于组织工程细胞的基础研究具有一定的指导意义。 偏倚或不足：文章结果虽然检测了成骨细胞在不同体外培养模式中的耗氧速率，但不同种类的培养模式是否会对成骨细胞的一些正常的生物学性能产生不利影响，这还需要进一步的实验来验证。另外，还需要在今后的科研工作中继续进行相关的探索，诸如在骨组织工程的三维构建过程中如何翔实、快捷的在线监测种子细胞的耗氧速率和新陈代谢。

0 引言

由于目前传统的治疗方法如自体骨嫁接和异体骨移植等在治疗外伤、先天性骨缺损、骨肿瘤和其他骨科疾病上的局限性，使得组织工程学的方法有望成为一种修复患病或受损骨组织的新途径[1-4]。1995年Crane系统提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究现状和发展前景，引起了广大学者的关注[5]。骨组织工程的要素主要包括种子细胞、支架材料和体外三维的培养环境等，其中种子细胞的体外培养与规模化有效扩增是本领域相关研究的最基本问题。其中成骨细胞作为体内直接成骨的细胞，是骨组织工程中典型的种子细胞来源。其功能主要是合成分泌骨基质，并促成基质矿化形成骨组织。细胞内碱性磷酸酶含量较高，Ⅰ型分泌胶原、骨结合素、骨钙素、纤粘连蛋白及一系列生长因子。其取材来源于骨膜深面的生发层或松质骨，具有很强的成骨能力，与生物材料复合有继续生长分化及形成新骨的能力，在动物和临床实验中都已取得成功[6-9]。关于成骨细胞体外培养、扩增与基因修饰等相关研究一直是骨组织工程研究领域的热点[10-12]。经检索PubMed、ScienceDirect、中国期刊全文数据库和万方数据库等常用数据库，均未发现关于其体外培养过程中耗氧速率的相关报道。基于此，本文分别使用体外静态直接培养和包囊培养两种模式进行来源于SD大鼠颅盖骨成骨细胞的扩增，并分别检测和对比其在这两种培养环境中的耗氧量和耗氧速率，从而更好的为成骨细胞在不同培养模式中的体外培养、扩增以及其他更深层次的实验提供理论依据。

1 材料和方法

设计：对比观察。
时间及地点：实验于2007-03/09在大连理工大学精细化工国家重点实验室干细胞与组织工程研发中心完成。
材料：出生二三天SD大鼠10只，SPF级，雌雄不拘，由大连医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK(辽)2002-002）。

实验过程：
细胞培养：成骨细胞静态培养瓶培养：将SD大鼠拉颈处死后投入盛有体积分数为0.75乙醇的容器内消毒3~5 min，置于消毒培养皿内。取颅盖骨，经2.5 g/L 胰蛋白酶溶液和1 g/L Ⅱ型胶
原酶溶液分别消化后，加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基，调节细胞的密度为109 L-1 后接种在T25培养瓶内。将培养瓶置于37 ℃、体积分数为0.05 CO2的培养箱中培养[13]。细胞长满瓶壁后，传代2次，即可使用。
成骨细胞包囊培养：将待传代的成骨细胞先用PBS冲洗2次，然后加入2.5 g/L 胰蛋白酶消化5 min，待细胞边缘变圆将要脱离培养瓶底面时，加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基终止胰酶的作用，用滴管将其转移至离心管中，1 000 r/min 离心5 min，加入一定的培养基，通过血球计数板确定细胞悬液细胞总数，将定量上述细胞液与氯化钙溶液混合于烧杯中，将事先配置好的15 g/L 的海藻酸钠溶液装入针管中，均匀滴加，流速约40 mL/h，同时接通高压静电发生器，电压6 kV，通过针孔滴加的海藻酸钠溶液在高压静电场的作用下，滴入氯化钙凝胶浴中固化，形成海藻酸钙微胶珠[14]，置于 37 ℃、体积分数为0.05 CO2的培养箱中培养12 h，使细胞呈现良好的生长状态。
成骨细胞的生物学性能检测：
成骨细胞的特异性检测：碱性磷酸酶被公认为是成骨细胞特异性鉴定的指标之一[15-16]。对于体外培养的成骨细胞，可用钙钴法进行定性染色测定。其原理是碱性磷酸酶用β-甘油酸钠为底物，以Ca2+和Co2+捕获磷酸，再用硫化胺处理，形成硫化钴或硫化铅黑色终产物，沉淀在组织切片或培养的细胞盖片上该酶存在的部位。
成骨细胞的形态学检测：对成骨细胞的形态学检测通常包括：①活细胞的观察检测，即利用光学显微镜来直接观察活细胞的生活状态。②普通染色观察，通常是将细胞在玻片上做成涂片，再利用特定的染色剂加以染色后光学显微镜下观察。本实验使用苏木精-伊红染色来观察所培养成骨细胞的生物学形态。
苏木精-伊红染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法之一[17]，也是将细胞作为标本保存的主要方法。本文选取传代培养并经纯化的第3代成骨细胞进行染色。染色前用胰酶将贴在培养瓶底的成骨细胞消化，以1×108 L-1 的密度制成细胞悬液，然后放入已经放有方形盖玻片的培养皿中进行培养，使成骨细胞贴附在盖玻片上，之后取出待用。染色程序[13]大致如下：
使用体积分数为0.1的甲醛固定培养物30 min。蒸馏水洗1次后，入苏木精染液8 min 染细胞核。入0.5%盐酸，70%乙醇溶液45 s，脱去胞质的着色。此时细胞核呈紫红色。入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。此过程不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。入伊红溶液45 s。用梯度乙醇溶液脱水：70%，90%，95%乙醇各 45 s；100%（2次）各2 min。用二甲苯透明2次，各5 min。树胶封固。

主要观察指标：①成骨细胞在静态培养瓶中和包囊培养过程中的黏附、伸展、分布情况，并测定细胞生长曲线。②成骨细胞的生物学性能及不同体外培养方式中成骨细胞的耗氧量和耗氧速率。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、三作者，干预实施为全部作者，评估为第一作者。评估者经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用Origin 7.0软件完成统计处理，实验均重复3次，实验数据以x(_)±s表示，用t检验确定显著性水平。

2 结果

2.1 成骨细胞的体外培养 显微镜下观察，并使用CCD摄像头及图像采集系统对所观察到的成骨细胞进行拍照，原代培养的成骨细胞为贴壁生长，形态多为梭形或多边形。培养5 d 后即可铺满瓶底，细胞胞体伸展，并伸出数量、长短、形态各异的突起，且显示出集落样生长趋势。集落中心细胞相互重叠而致细胞轮廓及间隙不清晰，随集落不断扩大，各集落间的外围细胞成杂乱网络相互交织连接，渐成致密网架型单层或复层细胞，见图2。

细胞包囊后接种在6孔板中，添加IMDM培养基培养2 d 和7 d 后，在倒置显微镜下观察，成骨细胞在微珠中呈圆形，细胞分布均匀，靠近壁面处有以细胞为起点向微珠内延伸的孔道，见图3。

2.2 成骨细胞检测
2.2.1 特异性检测 取传代后经纯化的第3代细胞，制片，行钙钴法后封固，在倒置光学显微镜下观察，结果见图4，染色鉴定后贴壁细胞的外缘基质被染成深灰色，大部分细胞表达强烈的碱性磷酸酶活性，表明贴壁细胞为成骨细胞。

2.2.2 形态学检测 体外培养的成骨细胞形态学检测结果见图5，静态培养的SD大鼠颅骨顶骨来源的成骨细胞形态良好，贴壁后完全伸展呈长梭形或多边形。细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。

2.2.3 体外矿化能力检测 成骨细胞体外矿化能力检测结果见图6，图7，静态培养的SD大鼠颅骨顶骨来源的成骨细胞具有良好的体外成骨能力，适宜作为骨组织工程的种子细胞。

2.3 成骨细胞的体外生长曲线 见图8。

图8为体外培养的成骨细胞经传代2次后，在培养过程中静态培养的生长曲线。从图中可以看出，细胞经过体外原代培养的适应期之后，经传代培养生长速度明显加快，至第2天就可以实现指数期生长与扩增，3 d 左右就可以完成一个生长周期，适于作为骨组织工程的种子细胞进行其他方面的研究。
2.4 不同培养方式的耗氧速率检测 通过血球计数板计数可知所得细胞悬液的浓度，从溶氧仪读取体外不同培养方式中成骨细胞的氧气消耗量，在测氧仪耗氧速率曲线上选取连续3段时间，每段时间间隔一定，这样根据公式1即可以得出耗氧速率，见表1。

V：耗氧速率；B：耗氧量终止值；A：耗氧量起始值；t：间隔时间；V：细胞体积；M：细胞数。

3 讨论

本实验采用英国Strathkelvin公司生产的生物溶氧仪检测体外两种不同培养模式下培养的成骨细胞的生物耗氧量和耗氧速率。体外静态直接使用培养瓶培养方式的耗氧速率约为5.56×10-6 μmol/min，包囊培养方式的耗氧速率约为1.25×10-7 μmol/min，两者呈显著性差异。这一组实验数据的获得，将有可能对成骨细胞在体外不同条件下的培养、扩增以及其他方面的研究提供非常有意义的依据。此外，实验结果还表明，直接培养的成骨细胞的耗氧速率远高于包囊之后的耗氧速率，其原因应该是细胞由于包囊所造成的传质障碍。但由于近年来组织工程种子细胞结合微胶囊技术的应用越来越广泛[18-20]，因此关于这方面研究的相关数据的采集也是非常重要的。包囊后，溶解在培养基中的氧气需要透过囊壁微孔道进入微囊内，囊壁具有一定厚度，而且孔径很细（见图3b）对传质构成一定阻力，阻碍氧气以及其他营养成分的进入，所以包囊培养方式下细胞的耗氧速率更低。同时，测量时间的长短也在一定程度上影响着测量结果，在线检测时间如果过长，用于测量的溶氧仪液体小室水温会很难保持在最初的37 ℃，使小室内的细胞悬液温度随之发生变化，这样会使细胞的生理活性随之发生变化，导致耗氧速率发生波动，所以测量时间不宜过长，在曲线稳定时读数即可，且应尽量保持液体小室的温度。但此种培养模式是否会对成骨细胞一些正常的生物学性能产生不利的影响，这还需要进一步的实验来验证。

4 参考文献

1 O'Halloran DM,Pandit AS. Tissue-engineering approach to regenerating the intervertebral disc. Tissue Eng 2007;13(8):1927-1954
2 Wang L,Detamore MS.Tissue engineering the mandibular condyle. Tissue Eng 2007;13(8):1955-1971
3 Siddappa R,Fernandes H,Liu J,et al. The response of human mesenchymal stem cells to osteogenic signals and its impact on bone tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther 2007;2(3):209-220
4 Barrère F,van Blitterswijk CA,de Groot K. Bone regeneration:molecular and cellular interactions with calcium phosphate ceramics. Int J Nanomedicine 2006;1(3):317-332
5 Langer R. Tissue engineering. Science 1993;260(5110):529
6 Shor L,Guceri S,Wen X,et al. Fabrication of three-dimensional polycapro- lactone/hydroxyapatite tissue scaffolds and osteoblast-scaffold inter- actions in vitro. Biomaterials 2007;28(35):5291-5297
7 Vacanti CA,Vacanti JP. Tissue engineered morphojenesis of cartilage and bone by means of cells transplantation using synthetic biodegrade able polymer matrices. J Clin Plast Surg 1994;21(3):445-451
8 Goodman SB,Ma T,Chiu R,et al. Effects of orthopaedic wear particles on osteoprogenitor cells. Biomaterials 2006;27(36):6096-6101
9 Martin I,Miot S,Barbero A,et al. Osteochondral tissue engineering. J Biomech 2007;40(4):750-765
10 Song KD,Liu TQ,Cui ZF,et al. Zhongguo Shengwu Yixue Gongcheng Xuebao 2005;24(2):134-139
宋克东,刘天庆,崔占峰,等.成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增[J].中国生物医学工程学报,2005,24(2):134-139
11 Franceschi RT,Ge C,Xiao G,et al.Transcriptional regulation of osteoblasts. Ann N Y Acad Sci 2007;1116:196-207
12 Gamradt SC,Lieberman JR. Genetic modification of stem cells to enhance bone repair. Ann Biomed Eng 2004;32(1):136-147
13 Masella RS,Meister M. Current concepts in the biology of orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2006;129(4):458-468
14 Wang Y,Xie YB,Ma XJ. Progress of studies on chitosan alginate microcapsule. Progress in Biotechnology 1999;19(2):13-15
15 Hillsley MV,Frangos JA. Alkaline phosphatase in osteoblasts is down regulated by pulsatile fluid flow. Calcif Tissue Int 1997;60(1):48-53
16 Hatta M,Daitoku H,Matsuzaki H,et al. Regulation of alkaline phosphatase promoter activity by forkhead transcription factor FKHR. Int J Mol Med 2002;9(2):147-152
17 Song KD,Liu TQ,Li XQ,et al. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Jinzhan 2004;31(11):996-1005
宋克东,刘天庆,李香琴,等.新型旋转壁式生物反应器内三位组织工程骨的构建[J].生物化学与生物物理进展,2004,31(11):996-1005
18 Declercq HA,Gorski TL,Tielens SP,et al. Encapsulation of osteoblast seeded microcarriers into injectable,photopolymerizable three-dimensional scaffolds based on d,l-lactide and epsilon-caprolactone. Biomacromolecules 2005;6(3):1608-1614
19 Payne RG,Yaszemski MJ,Yasko AW,et al. Development of an injectable,in situ crosslinkable,degradable polymeric carrier for osteogenic cell populations. Part 1. Encapsulation of marrow stromal osteoblasts in surface crosslinked gelatin microparticles. Biomaterials 2002;23(22):4359-4371
20 Batorsky A,Liao J,Lund AW,et al. Encapsulation of adult human mesenchymal stem cells within collagen-agarose microenvironments. Biotechnol Bioeng 2005;92(4):492-500