江海良，夏 青，魏 振，黄 爽，贾 静
Culture of articular chondrocytes through transduction of adenovirus-human insulin like growth factor-I transgene in vitro

Jiang Hai-liang, Xia Qing, Wei Zhen, Huang Shuang, Jia Jing

Abstract
AIM: Insulin like growth factor-Ⅰis always regarded as one of the key growth factors in cartilage growth and stability. It can promote type Ⅱcollagen and proteoglycan production by chondrocyte. This study investigated the production of the substrate component of cartilage by transduction with adenovirus-human insulin like growth factor-I (Ad-hIGF-Ⅰ) transgene construct.
METHODS: The experiment was performed at the Laboratory of Orthopedics, Fourth Hospital of Dalian Medical University from January 2005 to April 2007. Chondrocytes were isolated from 3-week-old rabbit knee and femoral head and cultured. The first passage chondrocytes were assigned to transducted group and non-transducted group after they were transducted by Ad-hIGF-Ⅰ of 500 multiplicity of infection. The first, third, fifth and seventh passage chondrocytes transducted and non-transducted were assayed by inverted light microscopy to observe their biological characteristic changes. ELISA, alkaline hydrolysed sample assay and alician blue test were performed to identify the expression and biosynthesis of hydroxyproline, glycosaminoglycans (GAG) and IGF-Ⅰ protein.
RESULTS: The microscopic observation showed chondrocytes in the transducted group proliferated stably, and triangle, and spindle cells were predominant in the seventh passage, accompanied by few long-spindle and root cells. In addition, the cells were of clear appearance and large lucency. However, in the non-transducted group, long-spindle cells were observed in the fourth passage, and almost all cells exhibited long-spindle shape in the fifth passage. With culture time and passage prolonging, the concentration of IGF-Ⅰ, hydroxyproline and GAG in transducted chondrocytes culture medium was significantly higher than the same passage cells in non-transducted group (P < 0.05).
CONCLUSION: The results suggest that chondrocytes transducted with Ad-hIGF-I could produce endogenous IGF-Ⅰ and increase synthesis of type Ⅱ collagen and proteoglycan by chondrocyte.

Jiang HL, Xia Q, Wei Z, Huang S, Jia J. Culture of articular chondrocytes through transduction of adenovirus-human insulin like growth factor-I transgene in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4611-4614(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4611(ps).pdf]

摘要
目的：胰岛素样生长因子Ⅰ通常被认为是软骨生长和稳定中最关键的生长因子之一，可以促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖。应用携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒（Adenovirus-human insulin like growth factor-I transgene construct，Ad-hIGF-Ⅰ）体外转导培养关节软骨细胞，探讨其在体外促进软骨细胞外基质成分生成的能力。
方法：实验于2005-01/2007-04在大连医科大学附属四院骨科实验室完成。分离培养3周龄兔膝关节及股骨头软骨细胞，将受测细胞随机分为转导组与未转导组，以500感染复数的Ad-hIGF-I转导第1代软骨细胞，转导组中的第1，3，5，7代细胞分别为转导后48 h，3周，7周和9周的软骨细胞。采用样本碱水解法、阿利新蓝法和酶联免疫吸附方法检测转导组和未转导组的第1，3，5，7代细胞羟脯氨酸、糖胺多糖、胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度。
结果：①倒置显微镜观察，转导组兔关节软骨细胞生长增殖稳定，至第7代仍旧以三角形、梭形及纺锤形细胞为主，偶见长梭形和树根形细胞，且轮廓清晰，透亮度大，折光性强；而未转导组细胞培养至第4代时即已出现长梭形细胞，自第5代细胞形态几乎全部变成长梭形。②随着培养时间延长和传代次数增加，软骨细胞上清液中胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖浓度的逐渐降低，转导组软骨细胞均高于同代未转导组细胞（P < 0.05）。
结论：携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒体外转导的关节软骨细胞，可以稳定产生内源性的胰岛素样生长因子Ⅰ，并进而促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖。
关键词：胰岛素样生长因子Ⅰ；转导；细胞培养；软骨细胞；软骨组织工程

江海良，夏青，魏振，黄爽，贾静. 携带人胰岛素样生长因子I基因的重组腺病毒体外转导培养关节软骨细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4611-4614 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4611(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：大量研究表明，在培养环境中加入适当浓度的生长因子可以调节软骨细胞外基质的生物合成，影响细胞的生物学形态，但这些外源性因子往往半衰期较短，在体内不能长久发挥作用。如果通过基因转移技术，将外源基因导入软骨细胞并有效表达，则可以产生内源性生长因子，从而能对靶细胞产生持续的作用。 应用要点：胰岛素样生长因子I经常被认为是在软骨生长和变性中最关键的生长因子之一，是软骨内基质合成与降解的主要稳定性因素。实验显示了兔关节软骨细胞可被Ad-hIGF-Ⅰ有效转导并表达目的基因，进而较为稳定地产生内源性的胰岛素样生长因子I，调节关节软骨细胞的表型，抑制去分化，促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成。 偏倚或不足：①目前关于生长因子基因治疗软骨损伤的研究只是停留于动物实验阶段，与治疗疾病的临床应用还有很大距离。②未能从组织学结构和分子水平上观察，并不能确切地反映软骨细胞的细微变化。

0 引言

大量研究表明，在培养环境中加入适当浓度的生长因子可以调节软骨细胞外基质的生物合成，影响细胞的生物学形态，但这些外源性因子往往半衰期较短，在体内不能长久发挥作用[1-3]。如果通过基因转移技术，将外源基因导入软骨细胞并有效表达，则可以产生内源性生长因子，从而能对靶细胞产生持续的作用。
胰岛素样生长因子Ⅰ通常被认为是软骨生长和稳定中最关键的生长因子之一，可以促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，抑制转化[4-6]。本实验尝试利用人胰岛素样生长因子I基因转导体外单层培养的兔关节软骨细胞，探讨其在体外促进软骨细胞外基质成分生成的能力。

1 材料和方法

设计：对比观察。
单位：大连大学附属中山医院和山东枣庄矿业集团中心医院。
材料：实验于2005-01/2007-04在大连大学附属中山医院骨科实验室完成。
实验动物：清洁级健康新西兰兔6只，由大连医科大学实验动物中心提供，3周龄，雄性4只，雌性2只，体质量0.35~0.56 kg，平均0.41 kg。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
主要实验器材和实验试剂：SW-CJ-1F垂直净化工作台（上海阳光实验仪器有限公司）；二氧化碳培养箱(SANYO Electric Biomedical Co.,Ltd.)；XDS-1B型倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司）； Dulbecco's Modified Eagle Medium-high glucose（Gibco公司）；胎牛血清（杭州江滨生物技术有限公司）；Trypsin（Gibco公司）；Collagenase type Ⅱ（Sigma公司）；GAG测试盒（南京建成生物工程研究所）； DAB KIT(福州迈新生物技术开发有限公司)；Collagen Ⅱ Ab-2 Clone 2B1.5（Neo Markers Fremont, CA）；浓缩型SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）； Ad-hIGF-Ⅰ（北京本元正阳基因技术股份有限公司）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所）；DSL-10-2800 Active Non-Extraction IGF-Ⅰ ELISA (Diagnostic Systems Laboratories,Inc. UK)。
设计、实施、评估者：实验设计及评估为第一作者；资料收集为第一、二作者；实施为第一、二、三、四、五者。大连大学附属中山医院骨科人员协助资料收集和实验实施。
方法：
软骨细胞的分离与培养：取3周龄健康新西兰兔，经耳缘静脉空气栓塞处死，迅速无菌取出双侧膝关节及股骨头，以锐利刀片削取膝关节及股骨头软骨，剪成 1 mm×1 mm×1 mm大小，PBS漂洗后，用质量分数为0.25%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，然后用质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶磁力搅拌下振荡消化2 h，金属滤网过滤，残渣继续消化，再过滤，收集所有滤液，800 r/min离心5 min，去上清，加DMEM培养基，充分、轻柔吹打成细胞悬液，然后以1×109 L-1分装于25 cm2 培养瓶，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，首次换液于培养后第4天进行，且行半量换液，以后每两三天换液1次，待细胞达80%~90%融合时，以体积比为1∶1的0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA（质量分数）消化传代。
Ad-hIGF-I转导软骨细胞及实验分组：选用原代传代后的第1代软骨细胞，待细胞生长至80%~90%融合时，每25 cm2 细胞按照说明书加入5 mL病毒工作液(MOI=500，此系列剂量已经过预实验筛选；病毒滴度：2.6×1014v.p./L），继续培养，并逐日于倒置显微镜下观察细胞生长与形态。
受测软骨细胞随机分为两组，即转导组和未转导组。每组中包含来自每只兔的第1，3，5，7代软骨细胞，其中转导组中的第1，3，5，7代细胞分别为转导后48 h、3周、7周和9周的软骨细胞。
检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞内的稳定表达：收集细胞培养上清液，采用ELISA法，按照DSL-10-2800 Active Non-Extraction IGF-I ELISA说明书，用胰岛素样生长因子Ⅰ纯品制作标准曲线，测定转导组与未转导组各代细胞培养上清液中胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的浓度，对每组中来自6只兔的同代细胞培养上清液各3瓶（共18瓶）进行ELISA检测。取胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的平均值进行比较。
软骨细胞外基质生成能力的检测：
样本碱水解法检测羟脯氨酸合成：收集细胞培养上清液，对每组中来自6只兔的同代细胞培养上清液各3瓶(共18瓶)，按照羟脯氨酸测试盒说明书检测培养软骨细胞上清液中羟脯氨酸的浓度，来间接反映Ⅱ型胶原的生成。
阿利新蓝法检测糖胺多糖的合成：用糖胺多糖纯品制作标准曲线，对每组中来自6只兔的同代细胞培养上清液各3瓶（共18瓶），根据糖胺多糖测试盒说明书测定转导组与未转导组各代细胞上清液中糖胺多糖的浓度。
主要观察指标：①软骨细胞形态学观察。②胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白、羟脯氨酸及糖胺多糖浓度。
统计学分析：由本文作者以SPSS 11.5软件包进行统计学分析。结果以x(_)±s表示，浓度的比较采用t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验动物数量6只，进入结果分析数量6只，中途无脱落。
2.2 软骨细胞形态学观察 倒置显微镜观察，转导组兔关节软骨细胞生长增殖稳定，至第7代仍旧以三角形、梭形及纺锤形细胞为主，偶见长梭形和树根形细胞，且轮廓清晰，透亮度大，折光性强；而未转导组细胞培养至第4代时即已出现长梭形细胞，自第5代细胞形态几乎全部变成长梭形。见图1。

2.3 胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白、羟脯氨酸及糖胺多糖浓度检测结果 见表1。

3 讨论

软骨组织工程是当前组织工程研究的热点，亦被众多学者认为是一种对软骨修复可供选择的途径[7-9]。
Ad-hIGF-Ⅰ转导软骨细胞成功后，表现为细胞分泌胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白，通过ELISA检测培养软骨细胞上清液中胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的含量，可以间接反映胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞内的表达情况。ELISA检测结果显示，随培养时间延长和传代次数增加，未转导组软骨细胞自身合成胰岛素样生长因子Ⅰ的量逐渐减少，而转导组第1代细胞（转导后48 h）上清液中胰岛素样生长因子Ⅰ含量丰富，第3代（转导后3周）、第5代（转导后7周）和第7代（转导后9周）细胞的含量低于第1代细胞，差异有显着性意义（P < 0.05），但胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的含量在转导组软骨细胞上清液中高于同代未转导组细胞上清液中胰岛素样生长因子I蛋白的含量，差异有显着性意义（P < 0.05），并且表达时间至少在9周以上，说明目的基因在宿主细胞内获得了稳定表达。
Ad-IGF-Ⅰ体外转导培养关节软骨细胞后，至培养第7代，软骨细胞形态亦无明显变化，仍以小的多角形，以三角形、梭形及纺锤形细胞为主，而且软骨细胞分泌蛋白多糖的能力亦无明显减弱，转导组细胞至培养第7代Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色仍为阳性，表明基因转导的表达产物胰岛素样生长因子Ⅰ可以维持体外培养关节软骨细胞的表型，抑制去分化。
关节软骨功能的维持几乎完全依赖于软骨基质的结构完整及胶原纤维和蛋白多糖间的有机结合[10-12]。羟脯氨酸和氨基己糖多糖分别是软骨组织中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的主要组分，测定羟脯氨酸和氨基己糖多糖的浓度能够间接反映Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量[13-14]。羟脯氨酸及糖胺多糖检测结果显示，随培养时间延长和传代次数增加，未转导组软骨细胞上清液中羟脯氨酸和糖胺多糖的浓度逐渐减小，第5代和第7代细胞上清液中羟脯氨酸和糖胺多糖的浓度低于第1代细胞，差异有显着性意义（P < 0.05），而第1和第3代细胞上清液中羟脯氨酸和糖胺多糖的浓度差异无统计学意义（P > 0.05）。转导组第3代（转导后3周）、第5代（转导后7周）和第7代（转导后9周）软骨细胞上清液中羟脯氨酸和糖胺多糖浓度低于第1代细胞（转导后48 h），差异有显着性意义（P < 0.05），但二者浓度在转导组软骨细胞均高于同代未转导组细胞，差异有显着性意义（P < 0.05），同时也证实胰岛素样生长因子Ⅰ能够促进体外单层培养的关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而Ⅱ型胶原和蛋白多糖又是软骨细胞外基质的主要成分，自然也间接反映了胰岛素样生长因子Ⅰ有望能够促进软骨基质生成，从而实现损伤软骨的保护和修复。
基因治疗载体的选择主要从以下方面考虑：①转移目的基因所要表达时间的长短。②转移目的基因的大小。③靶细胞的分裂期。④靶细胞的类型。⑤载体是否引起机体的免疫反应。⑥是否具有毒副作用。⑦载体是否可以多次导入体内。⑧构建载体的难易程度。⑨载体转移系统的有效性和可行性。⑩载体的安全性和目的基因的可调节性。目前的认识水平所界定的理想载体是生物安全，治疗基因转染效率高，表达水平高、时间长，靶向性基因传递和智能化的调控，即基因可以时空性表达[15-16]。前两条最重要，似乎也是目前病毒与非病毒载体选择时的矛盾焦点。病毒载体以目的基因的较高表达、相对持续表达成为基因治疗大多方案选择的载体。腺病毒载体宿主范围广，对人的致病性低，在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因，能有效进行增殖，滴度高，与人类基因同源不整合到染色体，无插入致突变性，能同时表达多个基因，能在悬浮培养液中扩增等诸多优点[17-18]。
本实验显示了兔关节软骨细胞可被Ad-hIGF-Ⅰ有效转导并表达目的基因，进而较为稳定地产生内源性的胰岛素样生长因子Ⅰ，调节关节软骨细胞的表型，抑制去分化，并进而促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成。但Ad-hIGF-Ⅰ转导关节软骨细胞后的体内成软骨作用及安全性等还有待进一步研究。

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