苗 军1，刘春蓉2，黄鸿超1，夏 群1，石可松1
Construction of bicistronic green fluorescent protein-labeled pSELECT-GFPzeo-human bone morphogenetic protein 2 eukaryotic expression vector
Miao Jun1, Liu Chun-rong2, Huang Hong-chao1, Xia Qun1, Shi Ke-song1
Abstract
AIM: Bone morphogenetic protein-2 (BMP2) is presently one of widely used and actively BMP. This study aimed to construct green fluorescent protein (GFP)-labeled pSELECT-GFP zeo-hBMP2 eukaryotic expression vector. This result can provide basis for further research of hBMP2 highly effective expression and gene therapy.
METHODS: Experiments were performed at the Key Laboratory of Hormone and Development of Ministry of Public Health of Tianjin Medical University from March 2006 to March 2007. pcDNA3.1/CT-hBMP2 plasmid containing complete human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene segment were presented by Doctor Li. Bicistronic eukaryotic expression vector pSELECT-GFPzeo-MCS (Invivogen, USA), Zeo (Invivogen, USA), and pTA2?-T Easy (Dingguo Biotechnology Co., Ltd.) were used in this study. The encoding fragment of hBMP2 gene was obtained from a recombinant plasmid pcDNA3.1/CT-hBMP2 by using polymerase chain reaction (PCR). hBMP2 gene was inserted into pTA2-T-easy clone vector and pSELECT-GFPzeo-MCS eukaryotic expression vector, and then transferred into competence DH5α cells. After screening, pSELECT-GFPzeo-hBMP2 containing GFP was obtained and identified by sequence analysis.
RESULTS: A 1 216 bp fragment was obtained by PCR, the same as expectant fragment. The hBMP2 fragment in pTA2-T-easy cloning vector and recombined pSELECT-GFPzeo-hBMP2 eukaryotic expression vector was identified by restriction mapping and sequence analysis. The results were identical with that of reported hBMP2 sequence (Genebank NM-001200).
CONCLUSION: The pSELECT-GFPzeo-hBMP2 eukaryotic expression vector was constructed successfully.

Miao J, Liu CR, Huang HC, Xia Q, Shi KS. Construction of bicistronic green fluorescent protein-labeled pSELECT-GFPzeo-human bone morphogenetic protein 2 eukaryotic expression vector.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4615-4618(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4615(ps).pdf]

摘要
目的：骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体，为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础。
方法：实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成。①实验材料：含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠；双顺反子真核表达载体 pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司)，Zeo（Invivogen公司）；pTA2?-T Easy（鼎国生物技术有限公司）。②实验过程及评估：以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板，结合已设计好的特异性引物，采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段，将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接，转化入感受态DH5α细胞中，通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2，并进行测序鉴定。
结果：①聚合酶链反应获得长度约1 216 bp的目的片段，与预期片段相符。②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接，筛选及序列分析后，证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配。
结论：成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体。
关键词：骨形态发生蛋白质类；基因表达；绿色荧光蛋白质类；组织构建

苗军，刘春蓉，黄鸿超，夏群，石可松. 含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2表达载体的构建[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4615-4618 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4615(ps).pdf]

>>本文导读<<

课题背景：至今已有40多种骨形态发生蛋白被成功地分离。对骨形态发生蛋白的研究已经涉及到胚胎学、发育学、基因学以及进化学等多种学科。骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组骨形态发生蛋白2，并成功地诱导出新骨。 应用要点：载体是实现骨形态发生蛋白2在骨修复局部持续稳定有效表达的关键，实验选择了含增强型绿色荧光蛋白的双基因、双顺反子真核表达载体承载骨形态发生蛋白2基因。一方面该载体为双顺反子真核表达载体，具有很强的复制力，足以保证目的基因稳定表达，另一方面翻译出来的绿色荧光蛋白和目的蛋白各具独立空间结构和生理活性，互不干扰。实验所构建载体不仅能够在真核细胞中实现稳定分泌骨形态发生蛋白2的目的，还可以利用绿色荧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位。 同行评价：文章为纯技术性实验，是骨形态发生蛋白应用的初始前端技术性工作，载体构建方法有所改进，实验方法严谨，合理，结果可信。

0 引言

骨形态发生蛋白是由Urist[1]在1965年对脱钙骨基质的成骨研究中发现的，骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，可促进新骨形成[2-3]。目前已发现有40余种骨形态发生蛋白存在，其中骨形态发生蛋白2被认为是活性最强的诱导成骨因子[4]。但骨形态发生蛋白2在组织中含量甚微，因而利用基因工程生产重组骨形态发生蛋白2成为必须。本实验选择了含增强型绿色荧光蛋白的双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS，该载体具有绿色荧光标记，可实现骨形态发生蛋白2在体内外表达的示踪定位，同时，该载体为双顺反子表达系统，该系统可以实现骨形态发生蛋白2在动物细胞中的高效稳定表达[5]。本实验将为下一步实现组织工程化间充质干细胞的动物实验应用打下基础。

1 材料和方法

设计：开放性实验。
单位：天津市天津医院。
材料：实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成。含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠。双顺反子真核表达载体 pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司)，Zeo（Invivogen公司）。pTA2?-T Easy（鼎国生物技术有限公司），感受态DH5α、Pfu DNA聚合酶、Taq聚合酶、DNA Marker DL2000、质粒小提试剂盒、T4 DNA连接酶、质粒大提试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒（天津润泰生物技术有限公司），1 Kb DNA Marker、DNA片段快速回收试剂盒（大连宝生物技术有限公司），限制性内切酶BamHⅠ 和NheⅠ、T4 DNA连接酶（晶美生物工程有限公司），聚合酶链反应上下游引物合成及测序（北京奥科生物技术有限责任公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
构建pTA2-hBMP2克隆载体：从含pcDNA3.1/CT-hBMP2 的DH5α菌株中挑取一环，接种到氨苄青霉素Amp(+)的固体LB培养板中，37 ℃ 培养过夜后，挑取单一菌落接种到氨苄青霉素Amp(+)的液体LB中，250 r/min, 37 ℃ 水浴振荡过夜。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据pSELECT-GFPzeo-MCS 载体多克隆位点的限制性内切酶特点选择两个位点，在目的基因上游和下游引物中各设计一个酶切位点分别为BamHI和NheI酶切位点。引物设计原则：选择BamHI酶切位点（GGA TCC）和NheI酶切位点（GCT AGC），并且引入KOZAK序列(ACAATGG)和2个终止密码子（TCACTA），引物序列设计如下：上游引物 5’- ACG GGA TCC ACA ATG GTG GCC GGG ACC CG -3’；下游引物5’- ATA GGC TAG CTC ACT AGC GAC ACC CAC AAC -3’。以pcDNA3.1/CT-hBMP2重组质粒为模板，聚合酶链反应扩增出人骨形态发生蛋白2目的片段，聚合酶链反应扩增体系为：质粒4 μL（约400 ng）, 10×pfu Buffer（MgCl2 10 mmol/L）10 μL，dNTP Mixture （2.5 mmol/L）8 μL，上下游引物各0.4 μL，Pfu DNA聚合酶 0.8 μL，加ddH2O至100 μL。聚合酶链反应参数为：预变性，95 ℃，5 min；循环变性，94 ℃，30 s；复性，58 ℃，1 min；延伸，72 ℃，1 min，共30个循环，72 ℃，延伸5 min。最后4 μL DNA聚合酶72 ℃ 30 min。8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。按聚合酶链反应产物回收试剂盒说明书回收纯化目的片段，与线性pTA2?-T-easy克隆质粒载体连接：线性载体pTA2?-T-easy质粒1 μL，目的片段人骨形态发生蛋白2 cDNA 6 μL，10×T4 Ligase buffer 1 μL，T4 Ligase 1 μL，rATP 1 μL，构建10 μL连接体系混和均匀，4 ℃ 连接过夜。10 μL连接产物转化入感受态DH5α细胞，涂布于含X-gal及IPTG的氨苄LB平板上，过夜培养，挑选白色菌落。把转化成功后的菌落进行 37 ℃ 过夜培养，收集菌液后用碱裂解法提取质粒，BamHI/NheI双酶切鉴定，同时将菌液送至北京奥科生物技术有限责任公司测序，-80 ℃ 保存菌种。
构建含绿色荧光蛋白双顺反子重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2：重组克隆载体pTA2-hBMP2双酶切，先用NheI单酶切，再用BamHI单酶切，然后回收DNA片段，同样方法双酶切处理pSELECT-GFPzeo-MCS表达载体，T4DNA连接酶4 ℃ 连接过夜，连接产物转化入感受态DH5α细胞，涂布于含X-gal及IPTG的氨苄LB平板上，过夜培养，挑选白色菌落。把转化成功后的菌落进行37 ℃ 过夜培养，收集菌液后用碱裂解法提取质粒，BamHI/NheI双酶切产物进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳，检测酶切片段是否与预期大小一致。
主要观察指标：①人骨形态发生蛋白2聚合酶链反应结果。②pTA2-hBMP2重组质粒鉴定结果。③含绿色荧光蛋白双顺反子重组表达载体pSELECT-GFP zeo - rhBMP2鉴定。

2 结果

2.1 人骨形态发生蛋白2聚合酶链反应结果 以pcDNA3.1/CT-rhBMP2质粒为模板，经聚合酶链反应扩增后获得hBMP2DNA，长度1 216 bp，与预期片段相符，见图1。

2.2 pTA2-hBMP2重组质粒鉴定结果 酶切鉴定：BamHⅠ/NheⅠ双酶切产物进行8 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见一约1 216 bp的片段，见图2。余阴性对照和单酶切均无此条带。
测序鉴定：含pTA2-hBMP2重组质粒的菌液送至北京奥科生物技术有限责任公司测序，测序报告与GenBank检索的骨形态发生蛋白2基因序列（NM-001200）100%匹配。

2.3 含绿色荧光蛋白双顺反子重组表达载体pSELECT-GFP zeo - rhBMP2鉴定 酶切鉴定：BamHⅠ/ NheⅠ双酶切pSELECT-GFP zeo - rhBMP2，酶切产物进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见一约1 216 bp的片段，见图3。条带清晰，无非特异条带。

测序鉴定：含pSELECT-GFP zeo - rhBMP2重组质粒的菌液送至北京奥科生物技术有限责任公司测序，测序报告与GenBank检索的骨形态发生蛋白2基因序列（NM-001200）100%匹配。

3 讨论

人骨形态发生蛋白2染色体定位于第20对染色体p21区域，骨形态发生蛋白2基因N端具有一串疏水氨基酸和分泌性蛋白的特征，有4个糖基化位点，含有7个半胱氨酸的保守结构域，参与形成链内二硫键并连接两个单体形成二聚体的前蛋白。开放读码框架（open reading frame,ORF）1 188 bp，编码396个氨基酸的前体蛋白经进一步加工修饰，经蛋白酶切去N端的信号肽和中间的前肽，得到由114个氨基酸残基组成C端的成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠形成单体，两个人骨形态发生蛋白2单体连接形成二聚体，分泌到细胞外。成熟肽的同源或异源二聚体才具有生物活性[6-7]。
骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中活性最强的诱导成骨因子，通过基因克隆的方法可以将骨形态发生蛋白2基因转到细胞内，表达的骨形态发生蛋白2生长因子可激发一系列的细胞反应，包括趋化间充质干细胞、诱导间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，钙化软骨重建，骨组织生成，最后髓腔再通[8-11]。转基因细胞移植可以提高成骨细胞数量及成骨活性，改善骨重建功能，促进骨生成，达到治疗骨质疏松、骨缺损、骨不连、骨肿瘤、脊柱融合等疾病的目的[12-15]。局部基因治疗可使机体的局部组织细胞表达目的基因，细胞维持分泌功能，保证骨修复完成。本实验成功构建了能在真核细胞中高效表达的pSELECT-GFPzeo-rhBMP-2真核表达载体，为下一步重组人骨形态发生蛋白2在骨髓间充质干细胞中的表达及后续的组织工程化细胞移植打下了基础。
基因技术和表达载体的选择是实现骨形态发生蛋白2在骨修复局部持续稳定有效表达的关键。目前研究较多的是用携带骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体转染靶细胞，经检测证实有骨形态发生蛋白2蛋白分泌。但随着研究的不断进步，发现腺病毒虽然有转染率高等优点，但也出现一些免疫应答反应，进行体内实验有一定的风险。为减少不必要的副作用，可应用质粒为载体，通过脂质体进行转染，转染率达80%以上，质粒的使用安全性比腺病毒载体高，更适合临床应用[16-17]。为了能实现重组人骨形态发生蛋白2体内外表达的定位和跟踪，本实验选择了含增强型绿色荧光蛋白的双基因、双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS，选择该表达载体基于以下几点考虑：①从结构上看，该质粒载体为双顺反子真核表达载体，具有很强的复制力，足以保证目的基因稳定表达。②含有两个表达盒，插入外源基因的表达盒含有由延长因子1α和Ⅰ型人类T淋巴细胞白血病病毒长的末端重复序列共同构成的复合增强子[18-19]，SV40晚期PolyA信号肽做为终止信号确保了插入多克隆位点的外源基因稳定高水平表达[20]；另一个表达盒含有CMV增强子，EM7细菌增强子确保载体可以在原核细胞中正常表达，β球蛋白PolyA信号肽做为终止信号确保了绿色荧光蛋白的稳定转录和zeo抗性的稳定发挥[4]；最有特色的就是绿色荧光蛋白基因，翻译出来的绿色荧光蛋白和目的蛋白不是融合蛋白而是各具独立空间结构和生理活性，互不干扰。③含有Zeo抗性基因，便于使用Zeo抗生素筛选含此载体的靶细胞。本实验构建的pSELECT-GFPzeo-rhBMP真核表达载体，除了能够达到在真核细胞中实现分泌骨形态发生蛋白2蛋白的目的之外，还将利用绿色荧光蛋白作为报告基因实现目的基因在体内外表达的示踪定位。

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