郑 江，陈 富，邓忠良
Intramuscular nerve effects on repair of rectus femoris injury
Zheng Jiang, Chen Fu, Deng Zhong-liang

Abstract
BACKGROUND: Generally, repairing the injuries of sketetal muxcle is to suture the epimysial and exterior muscular nerve.
OBJECTIVE: To determine the intramuscular nerve effects on the recovery of lacerated musculus rectus femoris.
DESIGN, TIME AND SETTING: The randomized control animal experiment was performed at the Animal Experimental Center, Chongqing Medical University from September 2006 to August 2007.
MATERIALS: Twenty New Zealand rabbits weighing 2.0-2.5 kg were used to establish models of right skeletal muscle injury; left side was used as controls.
METHODS: Twenty rabbits were randomly divided into two groups. Rabbits in the intact intramuscular nerve group underwent complete muscle laceration with intramuscular nerve intact. Musculus rectus femoris was traversed at 4.0-5.0 mm from nerve entry point. Rabbits in the intramuscular neurotmesis group underwent complete muscle laceration, but intramuscular nerve was cut concomitantly at the same place as above.
MAIN OUTCOME MEASURES: 28 weeks after surgery, wet weight and isometric contraction of musculus rectus femoris were detected. Morphological change of musculus rectus femoris was observed by Hematoxylin & Eosin Staining. Fibrous degree was measured by Masson trichrism staining. Myofibrillar type was examined by myosin ATPase staining and tetrazolium staining method of reduced coenzyme Ⅰ to calculate cross-sectional area of muscle fiber.
RESULTS: Compared with the controls, wet weight and isometric contraction of musculus rectus femoris reduced in the intramuscular neurotmesis group (P < 0.05). Compared with the controls, cross-sectional area of type Ⅰ and Ⅱ a muscle fiber showed great improvement (P < 0.05), but type Ⅱ b was not good (P < 0.05) . Constituent ratio of muscle fiber was mostly recovered in all types. Cross-sectional area of type Ⅰ, Ⅱ a and Ⅱ b was poorly recovered in the intramuscular neurotmesis group (P < 0.05).
CONCLUSION: Intramuscular nerve promotes the muscle fiber regeneration of lacerated muscle, lightens muscle atrophy and fibrous degeneration, restores the morphous and construction of muscle fiber, which results in better functional recovery of skeletal muscle.

Zheng J, Chen F, Deng ZL. Intramuscular nerve effects on repair of rectus femoris injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4623-4627 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4623(ps).pdf]

摘要
背景：既往对损伤骨骼肌的处理主要是修复肌膜及肌外神经。
目的：实验拟观察肌内神经对损伤股直肌的修复作用。
设计、时间及地点：随机对照动物实验，组织学观察，于2006-09/2007-08在重庆医科大学动物实验中心完成。
材料：新西兰大白兔20只，体质量2.0~2.5 kg，右侧股直肌用于制备骨骼肌损伤模型，左侧股直肌作为对照。
方法：20只大白兔随机数字表法分为2组。肌内神经完整组采用不全离断方式，在神经入肌点以远4.0~5.0 mm 处横断股直肌而保留肌内神经完整，肌内神经断裂组采用完全离断方式在神经入肌点以远4.0~5.0 mm 处横断股直肌及肌内神经。
主要观察指标：①术后28周测量股直肌的湿重、股直肌等长收缩力的变化。②苏木精-伊红染色观察股直肌形态变化，Masson三色染色观察纤维化程度，肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色及还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶染色区别肌纤维的类型，并计算肌纤维横断面面积。
结果：①与对照侧相比，肌内神经断裂组实验侧股直肌湿重下降，等长收缩力下降（P < 0.05）。②与对照侧相比，肌内神经完整组Ⅰ型、Ⅱa型肌纤维横断面面积恢复较佳，Ⅱb型肌纤维较差（P < 0.05），各型肌纤维构成比例基本恢复；肌内神经断裂组Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型肌纤维横断面面积均恢复较差（P < 0.05）。
结论：肌内神经能够促进损伤骨骼肌的肌纤维再生，减轻肌肉萎缩及纤维变性，恢复肌纤维的正常形态及组成方式，从而促进损伤骨骼肌的恢复。
关键词：肌内神经；肌肉损伤；肌肉去神经化；肌肉纤维化；股直肌

郑江，陈富，邓忠良. 肌内神经对股直肌损伤修复的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4623-4627 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4623(ps).pdf]

>>本文导读<<

0 引言

骨骼肌具有再生功能，损伤后能够通过再生而进行自我修复。但是由于细胞外基质的过量产生及胶原的过度沉着导致纤维变性从而引起肌肉完全再生受阻，肌肉力量往往不能完全恢复且进程缓慢[1-5]。肌纤维再生与瘢痕组织形成的相互作用决定了肌肉恢复的速度与质量。目前促进肌肉恢复的生物学途径主要是促进肌纤维再生和减少纤维变性[2-3，6-12]。骨骼肌损伤位点远端肌肉会发生去神经化。众所周知，神经活性对于肌纤维和连接组织的改造与成熟以及损伤肌肉的功能恢复起着十分重要的作用[13]。目前对于损伤骨骼肌中可能随之断裂的肌内神经的作用知之甚少，这相当于损伤处远端肌肉的部分去神经化，而肌内神经往往未予修复。
肌内神经是否对损伤骨骼肌的恢复具有促进作用？如果主要肌内神经随骨骼肌的损伤而断裂，是否有必要对其进行显微修复？这是本实验的出发点。Garrett等[1]发现，损伤骨骼肌在修复后损伤位点远端会发生去神经化萎缩，即便予以修复，也会发生明显的功能丧失。肌肉损伤引起损伤位点远端发生去神经化，从而导致远端部分纤维变性增加，影响肌肉产生张力的能力及收缩能力[1，14]。修复位点的瘢痕或纤维化对肌纤维的连续性有直接影响，同时也影响到穿过修复位点的结缔组织、神经以及血管的发展[3]。但是，远端肌肉可以起着肌腱的作用，连接具有神经支配的部分和远端的肌腱，因此损伤肌肉在修复后能够恢复有用的功能，但不能达到正常程度[1]。
临床上对于损伤骨骼肌的处理，常规方法是采用肌膜缝合的方式修复肌肉断端，大多数情况下肢体功能的恢复缓慢而欠佳[1-5]。为了恢复肢体功能，在修复损伤骨骼肌时，对重要肌肉进行肌内神经修复是非常重要的。肌内神经的修复能最好地重建损伤位点远端骨骼肌的解剖学结构如肌纤维类型的分布及横断面面积，从而减少远端部分肌肉萎缩、瘢痕形成以及脂肪浸润的程度，使得肢体功能的恢复取得理想效果。损伤位点越接近近端，远端去神经化的部分也就越大，对神经的修复也就越重要。而损伤位点越接近近端，神经分支就越粗，对其定位就越容易，修复工作也就越容易进行。现在的肌内神经染色技术已经能够很好地染色和显示主要的肌内神经分支，从而为外科医生定位肌内神经提供了很大的帮助。本实验通过观察损伤骨骼肌修复28周后损伤位点远端部分的长期恢复效果，从而探讨肌内神经对损伤骨骼肌的恢复作用。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验；组织学观察。
时间及地点：实验于2006-09/2007-08在重庆医科大学动物实验中心完成。
材料：选择健康新西兰大白兔20只，雌雄不拘，兔龄3.0~4.0个月，体质量2.0~2.5 kg，由重庆医科大学动物实验中心提供。饲养环境温度22~26 ℃，湿度37%~42%，光照按12 h 昼夜交替（7：00~19：00）。

实验过程：
模型制备：选取新西兰大白兔右侧股直肌作为实验侧，左侧股直肌作为空白对照侧。称量动物体质量后，以速眠新（1 mL/kg）麻醉后仰卧位固定于手术台上。手术野常规备皮、消毒、铺巾，由腹股沟中点略偏外侧作一长约3 cm 的纵行切口，剪开皮下筋膜暴露缝匠肌。钝性分开缝匠肌，充分暴露股直肌。切开股直肌肌膜，在股直肌上部约2/5处可见进入股直肌的股神经分支及其伴行血管。以玻璃分针仔细分离肌外股神经分支及血管，在神经入肌点处沿神经走行分离其周边围绕的肌纤维及伴行血管，止于神经入肌点以下约6.0~7.0 mm。
干预分组：20只大白兔随机数字表法分为肌内神经完整组：采用不全离断方式，在神经入肌点以远4.0~ 5.0 mm 处横断股直肌而保留肌内神经完整；肌内神经断裂组：采用完全离断方式，在神经入肌点以远4.0~5.0 mm 处横断股直肌及肌内神经。依次缝合肌肉断端、肌膜、阔筋膜张肌、皮下组织、皮肤，术后切口涂以安尔碘，以青霉素钠2万U/kg 肌注1周，每8小时1次。允许动物在笼内活动，10 d 后拆除皮肤缝线。
指标检测：
机能学检查：术后28周，称量动物体质量，麻醉方式与手术方法同前。暴露股直肌后，测量其长度。钝性游离股直肌，用玻璃分针仔细分离支配股直肌的股神经分支及伴行血管，仔细而轻柔地剥离神经外膜。在膝关节上方股直肌汇入髌韧带处切断股直肌，将断端以4-0丝线连于力传感器上，调整力传感器位置，使丝线垂直，松紧度合适，肌肉长度为初始测量长度。将单钩保护电极挂于准备好的股神经分支上进行电刺激实验。刺激模式为单刺激，起始刺激强度：150 mv；刺激强度增量：50 mv；刺激时间间隔：3 s；延时：100 ms；波宽：1 ms；波间隔：99 ms；频率：10 Hz。重复2次，每次休息3 min 以防止肌肉疲劳。保持肌肉的长度不变，肌肉的等长收缩力通过BL-410生物机能实验系统记录。左边对照侧股
直肌也进行同样的实验。
形态学检查：在麻醉状态下切除双侧股直肌并测量其湿重，将股直肌切成3段，近段（断裂点近端）、中段（包括断裂点）和远段（断裂点远端）；对照侧也作相似划分。本实验以远段作为标本。远段标本立刻放入冷冻管于液氮中速冻，之后转移到-80 ℃ 冰箱保存。用冷冻切片机进行冰冻切片（恒冷室温度-25 ℃，冻头温度-23 ℃），取横断面，切片厚6 μm，用于苏木精-伊红染色、Masson三色染色、肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色及还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶染色。苏木精-伊红染色用于观察肌纤维的大小、分布，肌膜核的改变，Masson三色染色用于观察纤维化的程度，肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色及还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶染色用于区别肌纤维的类型、计算肌纤维横断面面积（Cross-sectional area，CSA）及纤维类型的构成比例。在肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色中，Ⅰ型肌纤维不显色，Ⅱa型肌纤维深黑色，Ⅱb型肌纤维浅黑色。在还原型辅酶Ⅰ四唑氮还原酶染色中，Ⅰ型肌纤维深蓝色，Ⅱ型肌纤维淡蓝色。利用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行分析。
主要观察指标：股直肌的湿重、等长收缩力，肌纤维CSA及构成比例。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0软件包完成统计处理，计量资料以x(_)±s表示，组内两侧比较用配对t检验，组间比较用ANOVA。P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入健康新西兰大白兔20只，饲养过程中肌内神经完整组死亡1只，肌内神经断裂组死亡2只，1只腹泻，1只真菌感染，余17只进入结果分析。
2.2 28周后各组动物体质量及股直肌湿重的变化 见表1。

与对照侧相比，肌内神经断裂组实验侧股直肌湿重显著下降（P < 0.05）。两组实验侧/对照侧股直肌湿重比率相比，差异有显著性意义（P < 0.05）。
2.3 术后28周各组动物股直肌等长收缩力的变化 见表2。

肌内神经断裂组实验侧股直肌与对照侧相比差异有显著性意义（P < 0.05），两组实验侧/对照侧股直肌等长收缩力比率相比，差异有显著性意义（P < 0.05）。
2.4 两组动物肌肉形态学的变化 各组动物实验侧及对照侧股直肌一般形态学变化见图1~4。

肌内神经完整组实验侧肌纤维的大小、分布接近对照侧，纤维化程度较轻，可见大量中央核肌纤维再生。肌内神经断裂组实验侧股直肌损伤位点远端肌肉呈现广泛的异常改变，包括肌纤维同型性成群、萎缩、大小变异以及少量中央核肌纤维再生，明显的脂肪浸润、单核增生、间质浸润以及瘢痕形成。
2.5 各组动物股直肌远端肌纤维类型的分布及横断面面积 见表3。

3 讨论

由于肌内神经不完整，完全断裂骨骼肌（肌内神经断裂组）在经过肌外膜缝合后28周，发生了明显的去神经化萎缩，可以观察到明显的肌肉湿重下降、纤维变性、单核增生及脂肪浸润，肌纤维CSA减少，肌肉的等长收缩力与对照侧相比，差异具有显著性意义（P < 0.05）。并且更重要的是，肌纤维的组成方式产生了较大的变异。股直肌是一块快收缩肌，而在肌内神经断裂组，Ⅰ型肌纤维增加，Ⅱ型肌纤维减少并且萎缩，这表明保留或者修复肌内神经，可以减轻肌肉去神经化的程度，并且恢复肌纤维类型的组成[1，5]。在肌内神经完整组中，由于肌内神经完整，并且对肌肉予以修复，28周后可见修复侧肌肉湿重较肌内神经断裂组恢复良好，肌肉等长收缩力与对照侧相比并无明显差异，远端部分形态学改变接近正常，肌纤维CSA恢复较佳，表明肌内神经完整组恢复较好，也突出了保留或者修复肌内神经的重要性。
Garrett等[1]发现，损伤骨骼肌修复后，有用的功能能够不同程度地恢复，但是肌肉的形态、肌纤维的组成方式将永远难以恢复到正常。研究显示，在肌内神经断裂组中远端肌肉有部分在组织解剖学上呈现出与对照侧和肌内神经完整组相似的结果。究其原因，在于对于肌肉的横断轮廓非常清楚并且进行了简单的肌束和肌外膜缝合，从而可能导致肌肉自发性地恢复了神经的连续性。但这种自发重建是不完全的，重要肢体肌内神经的自发性恢复也是很少或者程度较低的，而且，即使发生了这种情况，也会导致肌纤维组合方式的永久性改变[15]。对一些不重要的肌肉可以进行这样的简单修复，但是对于一些很重要的肌肉来说，依靠其自发性的神经重建会因为不能较好地恢复损伤点远端肌肉的组织解剖学结构而损伤肢体功能。
大多数损伤骨骼肌恢复方面的研究表明，损伤处骨骼肌的再生因损伤位点的纤维变性而受阻[2-3，5]。在本实验中也可以看到，纤维变性和脂肪浸润是肌内神经断裂组远端肌肉的显著特征。抗纤维变性因子，如核心蛋白多糖、苏拉明、γ-干扰素、胰岛素样生长因子Ⅰ、成纤维细胞生长因子2，在实验中广泛应用，能够减少损伤位点的纤维变性，促进肌肉恢复[6-10，16-17]。但是它们在远端肌肉恢复中的作用如何尚待研究。被动运动锻炼也具有抗纤维化和促进肌肉再生的效果[18]。此外，临床上常用的非甾体类抗炎药会减少肌肉再生并促进纤维化的形成从而阻碍骨骼肌的恢复[19-20]。目前的研究表明，减少损伤位点远端肌肉纤维变性最有效的方法是恢复神经的连续性。
失去神经支配的肌肉由于其本身肌纤维的特性不同，恢复效果也不同[21]。近年来生肌性前体细胞在肌肉损伤中的作用得到广泛研究，尤以pax7的表达为特征的肌肉卫星细胞为多[3，22]。其他细胞，如肌肉旁群细胞（SP细胞）或者骨髓干细胞可能会参与骨骼肌的再生[23-24]。肌肉环境对自身或者植入的细胞具有非常重要的作用，利用最适合的干细胞群和改变主体肌肉环境有利于提升肌肉的再生能力[25]。去神经化后，与正常肌肉相比，受损肌肉的静止卫星细胞很难进入有丝分裂周期。有人认为去神经化能够刺激静止卫星细胞进入细胞周期，但需要存在一些适合的刺激物[12]。近来有研究表明，恢复神经支配会直接影响肌纤维的分子组成，导致纤维类型的改变，逆转去神经化导致的结果，而不会直接影响到卫星细胞，卫星细胞并不促进肌纤维的生长[26]。这些研究强调了重建损伤位点远端肌肉神经支配的重要性。而肌内神经的重建是否会对肌肉卫星细胞的增殖及分化产生影响，这将是进一步实验中要解决的问题。
本实验结果提示，修复后28周肌内神经断裂组股直肌中Ⅰ型肌纤维的比例较高，表明确实发生了肌纤维组合方式的永久性改变。肌肉的去神经化导致Ⅰ型肌纤维肥大增生，Ⅱ型肌纤维减少萎缩，从而改变了代谢状态，以适应自生能源的改变（如线粒体功能）。如果神经的再恢复较慢，或者发生了不恰当的交叉神经支配，这种改变将会一直保持下去[5]。肌纤维组合方式的改变将会严重影响到肌肉的收缩性能。
并非在所有肌肉损伤情况下都适合修复肌内神经。如果肌肉损伤是粉碎性的，清创后就不宜缝合肌内神经。这种情况下肌内神经的鉴别、定位反而可能会加重肌肉的损伤，而激活静止卫星细胞产生新的肌纤维的生长因子和减少瘢痕组织的抗纤维化因子可能更加有用。虽然由于肌内神经较小以及显微缝合神经的恢复效果尚不太理想，临床上在修复时还会受到技术的限制与挑战，但通过本实验对肌内神经作用于损伤骨骼肌的长期恢复效果的评估，表明完整的肌内神经能够促进损伤骨骼肌较好地恢复，临床上在遇到此种情况时有显微修复肌内神经的必要。

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