鲍慧慧，程晓曙，陈 琦，洪 葵，李 萍，王 玲
Construction of eukaryotic expression vector pEGFP-N1/HSP22 containing gene heat shock protein 22 and its expression in vascular endothelial cells
Bao Hui-hui, Cheng Xiao-shu, Chen Qi, Hong Kui, Li Ping, Wang Ling
Abstract
BACKGROUND: Human heat shock protein 22 (HSP22) expressed in many tissues. Whether the construction of eukaryotic expression vector can transfect its expression in endothelial cells.
OBJECTIVE: To construct eukaryotic expression vector pEGFP-N1/HSP22 and observe its expression in endothelial cells.
DESIGN, TIME AND SETTING: The single sample experiment was conducted at the Molecule Center of Second Affiliated Hospital of Nanchang University from March to October 2007.
MATERIALS: The eukaryotic vector pEGFP-N1 and DH5αwere preserved at the Molecule Center of Second Affiliated Hospital of Nanchang University. MCF-7 cells were gifted by Biochemical Laboratory of Nanchang University. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were purchased from Nanjing Keygen Biotechnology Company.
METHODS: HSP22 cDNA was obtained from MCF-7 by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and linked to pEGFP-N1, and then recombinant plasmid pEGFP-N1/HSP22 was transformed into DH5α. Positive clones were identified by double enzyme digestion and sequencing. Recombinant plasmid pEGFP-N1/HSP22 was transfected into HUVECs with liposome.
MAIN OUTCOME MEASURES: HSP22 expression in HUVECS was identified by fluorescence microscope, RT-PCR and Western-blot.
RESULTS: Agarose gel electrophoresis detection showed that HSP22 DNA segment was about 613 bp, which accorded with the expectation. Positive clones were identified by enzyme digestion after HSP22 gene was cloned into pEGFP-N1, and the sequencing results indicated it was correct. RT-PCR methods showed HSP22 mRNA was expressed in transfected HUVECs. Western blot detected a specific protein band of HSP22.
CONCLUSION: The recombinant plasmid pEGFP-N1/HSP22 is successfully constructed and expressed positively in HUVECs.

Bao HH, Cheng XS, Chen Q, Hong K, Li P, Wang L. Construction of eukaryotic expression vector pEGFP-N1/HSP22 containing gene heat shock protein 22 and its expression in vascular endothelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4633-4636(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4633(ps).pdf]

摘要
背景：已有实验证实，人热休克蛋白22(Heat shock protein22,HSP22)存在于人的多种组织中，但构建其真核表达质粒是否可转染人血管内皮细胞并完整表达。
目的：构建pEGFP-N1/HSP22真核表达质粒并观察在内皮细胞中的表达。
设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-03/10在南昌大学第二附属医院分子中心完成。
材料：pEGFP-N1真核表达质粒及DH5α为南昌大学第二附属医院分子中心保存，MCF-7细胞来源于南昌大学生化实验室馈赠，人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）株购至南京基凯生物技术公司。
方法：采用反转录聚合酶链式反应从人MCF-7细胞中扩增热休克蛋白22基因,将热休克蛋白22基因连接到真核表达载体pEGFP-N1中，并转化DH5α，获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。用脂质体法将重组质粒转染人脐静脉血管内皮细胞。
主要观察指标：荧光显微镜、反转录-聚合酶链反应法及Western blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。
结果：①琼脂糖凝胶电泳检测聚合酶链反应扩增产物, 热休克蛋白22基因片段长约613 bp,与预期分子量相符，测序结果证实克隆完全正确；其阳性克隆进行酶切鉴定与热休克蛋白22理论值相符。②反转录-聚合酶链反应法检测转染的人脐静脉血管内皮细胞中有热休克蛋白22mRNA表达；Western blot检测可见一特异性热休克蛋白22蛋白条带存在。
结论：成功构建了携带人热休克蛋白22及pEGFP-N1真核表达质粒,并验证已在人脐静脉血管内皮细胞中表达。
关键词：热休克蛋白；克隆，生物；基因表达；转染；组织构建

鲍慧慧，程晓曙，陈琦，洪葵，李萍，王玲. 构建人热休克蛋白22基因真核表达载体pEGFP-N1/HSP22及在血管内皮细胞中的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4633-4636
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4633(ps).pdf]

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0 引言

缺氧复氧损伤后的内皮细胞可引起血管痉挛，研究显示内皮细胞凋亡可能是缺氧/复氧损伤的始发环节[1]。机体在缺血、缺氧、感染等应激状态下，会诱导产生一种内源性保护蛋白－热休克蛋白（Heat shock protein, HSP），其中热休克蛋白22是新近发现的一种小分子热休克蛋白，Depre等[2-6]证实热休克蛋白22对缺氧/复氧损伤心肌的保护可等同于缺血预适应。热休克蛋白22是一种细胞保护蛋白[7-8]，最近关于内皮细胞缺氧损伤研究中发现缺氧24h后热休克蛋白22 mRNA开始表达。热休克蛋白22的应激表达是否对缺氧复氧内皮具有一定的保护作用？作者克隆了热休克蛋白22基因，并转染到内皮细胞中使其产生过表达,鉴定其蛋白表达,为下一步观察其在缺氧/复氧损伤内皮细胞中可能的保护作用奠定实验基础。

1 材料和方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2007-03/10在南昌大学第二附属医院分子中心完成，该实验室的生物安全的防护水平符合BSL-3。
材料：pEGFP-N1真核表达质粒及DH5α为南昌大学第二附属医院分子中心保存，MCF-7细胞来源于南昌大学生化实验室馈赠，人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）株购至南京基凯生物技术公司。
人热休克蛋白22 基因的扩增：
反转录：热休克蛋白22在乳腺癌细胞株MCF-7 中表达[9],故利用南昌大学生化实验室保存的MCF-7细胞进行热休克蛋白22基因的制备。MCF-7培养至90%满底后, 43 ℃热休克3 h 以促进热休克蛋白22mRNA表达[10]，并按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，进行琼脂糖凝胶鉴定,再用M-MLV行反转录。
聚合酶链反应扩增：根据热休克蛋白22序列,利用Primer Premier5.0设计引物,得到上游引物5’CCG GAA TTC TGA TGG CTG ACG GTC AGA TGC 3’和下游引物5’CGG GGT ACC GTG GTA CAG GTG ACT TCC TGG C 3’。其中画线部分分别为EcoRⅠ和kpnⅠ酶切位点序列。总MCF-7细胞cDNA为模板进行聚合酶链反应扩增,聚合酶链反应条件为：94 ℃ 5 min , 94 ℃ 45 s ,60 ℃ 45 s , 72 ℃ 45 s , 30 个循环, 72 ℃ 10 min延伸。产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收鉴定正确的聚合酶链反应产物片段。
重组真核表达载体的构建和鉴定：
定向克隆：聚合酶链反应产物凝胶电泳后, 回收613 bp大小的DNA 片段,并用EcoRⅠ/kpnⅠ双酶切,再回收酶切片段。将pEGFP-N1用两种内切酶消化后,回收大片段,再用T4 连接酶连接后, 于16 ℃反应过夜,转化大肠杆菌DH5α。经卡那霉素平板筛选后,扩增阳性克隆,抽提质粒,再用EcoRⅠ/ kpnⅠ进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。
测序鉴定：用pEGFP-N1自带的上游测序引物5’ACA GCT TCA AGC CAG AGG AG3’和下游测序引物5’CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G 3’，将重组质粒送到上海捷瑞生物技术公司进行测序。
重组质粒的表达鉴定：人脐静脉血管内皮细胞生长80%满底时,按Lipofectamine 2000产品说明书,将重组质粒HSP22/pEGFP-N1转染至人脐静脉血管内皮细胞。24 h 后用荧光显微镜观察细胞转染，48 h后分别提取总RNA和蛋白，用于反转录-聚合酶链反应和Western blotting鉴定，用13%SDSPAGE胶电泳,4 ℃封闭2 h, 1∶500热休克蛋白22单克隆抗体4 ℃孵育过夜，1∶2 500抗小鼠二抗过夜，ECL发光液曝光。
主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应扩增热休克蛋白22基因结果。②重组质粒的酶切鉴定结果。③重组质粒的测序鉴定结果。④热休克蛋白22反转录-聚合酶链反应产物及蛋白Western blot检测结果。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一、三、六作者,评估为第四、五

作者,均经过分子生物学培训，采用盲法评估。

2 结果

2.1 反转录-聚合酶链反应扩增热休克蛋白22基因结果 Trizol试剂抽提的总RNA,产物在琼脂糖凝胶电泳中显示出3条完整的带型，见图1。

反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖凝胶电泳后,可见清楚的约613 bp的条带,大小和热休克蛋白22 预期大小一致，见图2。

2.2 重组质粒的酶切鉴定结果 来自4个阳性克隆的质粒均可以被切开，电泳后分别与目的片段热休克蛋白22 (613 bp) 和载体pEGFP-N1 (4 733 bp) 的理论值相符。见图3。

2.3 重组质粒的测序鉴定结果 重组质粒送至上海捷瑞生物技术公司进行通测，测序结果证实插入片段序列与理论值完全一致，见图4。

2.4 热休克蛋白22反转录-聚合酶链反应产物及蛋白Western blot检测结果 瞬时转染 HSP22/pEGFP-N1质粒的人脐静脉血管内皮细胞，荧光显微镜观察绿色荧光，见图5。

转染48 h提取总RNA，行反转录-聚合酶链反应鉴定，见图6。

提取总蛋白进行Western blot检测热休克蛋白22蛋白表达，而转染空pEGFP-N1的细胞未出现目的条带，见图7，图8。每孔加35μL上样,其浓度为6.18 g/L。

3 讨论

热休克蛋白是机体在热休克、氧化应激、缺氧等状态下，产生的一类具有分子伴侣样作用的蛋白。研究证实休克蛋白的表达有助于阻止脂质过氧化、减轻活性氧导致的线粒体与DNA损伤、协助新生蛋白质的合成、修复损伤的蛋白质、抑制细胞凋亡等功能。
热休克蛋白22是新近发现的一种丝/苏氨酸激酶，又称为热休克蛋白B8和H11，它与热休克蛋白20、热休克蛋白27等均为sHSP家族成员[10-15]，它们C-末端的α-晶体蛋白有同源性，也是2型单纯疱疹病毒蛋白ICP10蛋白激酶(PK)的真核生物同源物，但热休克蛋白22蛋白又具有其自身的特点，如热休克蛋白22蛋白无sHSPs的α-晶体蛋白区的β-折叠结构，而是无规卷曲构象为主（占73％~80%）[16-18]。热休克蛋白22广泛分布于哺乳动物组织中，尤其肌肉、心脏等[19]，在一些肿瘤组织中亦有表达，如MCF-7细胞。
Alexander等[20]的研究显示热休克蛋白27通过抗凋亡作用而保护缺氧复氧损伤的内皮细胞。本课题组研究中发现内皮细胞在缺氧0，3，6，12 h均未出现热休克蛋白22 mRNA表达，而是在24 h开始出现热休克蛋白22 mRNA表达，36 h达高峰，持续到48 h，推测认为热休克蛋白22的较晚期表能在内皮细胞缺氧损伤的第二窗保护(SWOP)中发挥一定作用。
本实验利用乳腺癌细胞系MCF-7 ,用反转录-聚合酶链反应技术成功地扩增并克隆了全长热休克蛋白22基因,并在转染了重组真核表达质粒HSP22/pEGFP-N1的人脐静脉血管内皮细胞中检测到其特异的表达,为下一步研究热休克蛋白22在缺氧/复氧损伤内皮细胞中可能的保护作用及其机制打下了坚实的基础。

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