赵贤俊1，张水生2，李 燕2，金雄镇2，宋京郁3，高昇希2
Expression of connective tissue growth factor mRNA in the kidney of rats with diabetes mellitus after Hongshen chongcao capsule treatment

Zhao Xian-jun1, Zhang Shui-sheng2, Li Yan2, Jin Xiong-zhen2, Song Jing-yu3, Gao Sheng-xi2

Abstract
AIM: To observe the effect and mechanism of Hongshen chongcao capsule on the expression of renal connective tissue growth factor mRNA in rats with diabetes mellitus.
METHODS: The experiment was performed at the Laboratory of Pharmacology, and Laboratory of Pathology, Yanbian University Preclinical Medicine College and Institute of Regeneration Medicine of Jilin University from May 2005 to February 2006. Totally 70 Wistar rats of clean grade were selected and randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=20), benazepril-treated group (n=20) and traditional Chinese medicine (Hongshen chongcao capsule)-treated group (n=20). Hongshen chongcao capsule was provided by the manufacturing laboratory of Yanbian University Affiliated Hospital, and made by the powder mixture of hongshen and chongcao at certain ratio using milling machine. Rat model of diabetes was established by once intraperitoneal injection of streptozotocin (50 mg/kg). Automatic biochemistry analyser was used to measure the Levels of blood glucose, serum creatinine, urea nitrogen, and urine creatinine at the end of 12 weeks after administration, and the creatinine clearance was calculated. Urinary albumin was quantified using ELISA to calculate urinary albumin excretion rate. Connective tissue growth factor gene expression of renal cortex was measured with reverse transcription-polymerase chain reaction. Levels of renal fibronectin and type Ⅳ collagen protein expression were measured with immunohistochemical method.
RESULTS: Fasting blood glucose was significantly higher in the model group than in the model control group (P < 0.01), but was significantly lower in the traditional Chinese medicine-treated group than in the model group and benazepril-treated group (P < 0.01). Levels of urea nitrogen, serum creatinine, creatinine clearance and urinary albumin excretion rate were significantly higher in the model group than in the normal control group (P < 0.01), but significantly lower in the benazepril-treated group and traditional Chinese medicine-treated group than in the model group (P < 0.05-0.01). Expression of connective tissue growth factor mRNA of renal cortex in model group was 3.77 times that of normal control group. The expression of connective tissue growth factor mRNA of benazepril-treated group and traditional Chinese medicine-treated group was significantly decreased by 44.44% and 52.14%, respectively. Fibronectin and type Ⅳ collagen expressions were significantly higher in the model group than in the normal control group (P < 0.01), and those were significantly lower in the benazepril-treated group and traditional Chinese medicine-treated group than in the model group, but higher than normal control group (P < 0.01).
CONCLUSION: Hongshen chongcao capsule has protective effect on diabetic nephropathy, which may be correlated with reduce to the deposition of extracellular matrix by down-regulating the expression of connective tissue growth factor mRNA of renal cortex in rats with diabetes mellitus.

Zhao XJ, Zhang SS, Li Y, Jin XZ, Song JY, Gao SX. Expression of connective tissue growth factor mRNA in the kidney of rats with diabetes mellitus after Hongshen chongcao capsule treatment.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4637-4641(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4637(ps).pdf]

摘要
目的：分析中药红参虫草胶囊对糖尿病大鼠干预过程中对肾脏结缔组织生长因子表达的影响及其机制。
方法：实验于2005-05/2006-02在延边大学医学部药理实验室、病理实验室和吉林大学再生医学研究所病理实验室完成。选择清洁级Wistar大鼠70只，按随机数字表法分为4组，正常对照组（10只）、模型组（20只）、苯那普利治疗组（20只）和红参虫草胶囊治疗组（20只）。红参虫草胶囊由延边大学附属医院制剂室提供，红参与冬虫夏草分别用中药磨粉机粉成细末，并按一定比例混合。采用单次腹腔注射链脲佐菌素（50 mg/kg）制备糖尿病大鼠模型。①采用全自动生化分析仪测定实验12周末大鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿肌酐，并计算内生肌酐清除率；尿微量白蛋白定量采用ELISA法测定，并计算尿白蛋白排泄率。②应用反转录-聚合酶链反应检测肾皮质结缔组织生长因子mRNA表达。③免疫组织化学检测肾内纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达水平。
结果：①空腹血糖：模型组明显高于正常对照组（P < 0.01），红参虫草胶囊治疗组较模型组和苯那普利治疗组显著降低（P < 0.01）。②尿素氮、血肌酐、内生肌酐清除率、尿白蛋白排泄率：模型组均明显高于正常对照组（P < 0.01），苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组明显低于模型组（P < 0.05~0.01）。③结缔组织生长因子mRNA表达：模型组大鼠肾皮质结缔组织生长因子mRNA表达升高，是正常对照组的3.77倍；苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组结缔组织生长因子mRNA的表达比模型组分别降低44.44%和52.14%。④纤维连结蛋白、Ⅳ型胶原蛋白的表达：模型组明显高于正常对照组（P < 0.01），苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组明显低于模型组，高于正常对照组（P < 0.01）。
结论：红参虫草胶囊对糖尿病肾脏病变有保护作用，该作用发挥是通过下调糖尿病模型大鼠肾脏结缔组织生长因子mRNA的表达，从而减少细胞外基质沉积来实现的。
关键词：糖尿病；结缔组织生长因子；红参虫草胶囊；细胞外基质

赵贤俊，张水生，李燕，金雄镇，宋京郁，高昇希. 结缔组织生长因子在红参虫草胶囊干预糖尿病大鼠肾脏的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4637-4641 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4637(ps).pdf]

>>本文导读<<

0 引言

结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是近年来发现的一种新的生长因子，它对肾细胞的分化、增生及细胞外基质的合成和降解具有很强的调控作用，其异常表达在各种类型肾脏疾病包括糖尿病肾病纤维化进程中起着至关重要的作用。目前认为CTGF是转化生长因子β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）的下游效应递质，但它只介导TGF-β1过度表达时促进细胞外基质积聚和组织纤维化的作用，而TGF-β1的抗增殖和抗炎症则由非CTGF途径介导[1]。因此，CTGF有可能成为防治糖尿病肾病的更为特异的新靶点。本实验旨在观察红参虫草胶囊对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并通过观察它对CTGF表达的影响探讨其作用机制。

1 材料和方法

设计：随机分组设计、对照动物实验。
单位：延边大学附属医院中西医结合科。
材料：实验于2005-05/2006-02在延边大学医学部药理实验室、病理实验室和吉林大学再生医学研究所病理实验室（吉林省中医药管理局二级实验室）完成。选择清洁级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量150~200 g，由延边大学医学部动物中心提供（SCXK（吉）2003-0005）。试剂：链脲佐菌素（美国Sigma公司），红参虫草胶囊（延边大学附属医院制剂室，红参与冬虫夏草分别用中药磨粉机粉成细末，并按一定比例混合），兔抗鼠Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白多克隆抗体（即用型）、二氨基联苯胺显色及SABC试剂盒（博士德公司），反转录酶试剂盒（Invitrogen公司），Tag酶（北京鼎国生物技术发展中心），DL-2000 DNA Marker（Takara公司）。仪器：日立7600型全自动生化分析仪（日本），UV755B分光光度计（上海），TECHNE TC-312聚合酶链反应扩增仪（英国）及Tanon GIS-1000凝胶图像处理系统（上海）。
根据文后文献[2]合成CTGF和GAPDH两对寡核苷酸引物。CTGF及GAPDH引物序列分别为：CTGF上游5’ CTA AGA CCT GTG GAA TGG GC 3’，下游5’ CTC AAA GAT GTC ATT GTC CCC 3’，用这对引物可扩增出长度为383 bp的CTGF cDNA片段；GAPDH上游5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’，下游5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’，用这对引物可扩增出长度为452 bp的GAPDH cDNA片段。均由北京鼎国生物技术发展公司合成。引物合成后用5 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）溶解，使其终浓度均为10 μmol/L。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一、二作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
动物模型的建立及分组：按随机数字表法分为正常对照组（10只），模型组（20只），苯那普利治疗组（20只）；红参虫草胶囊治疗组（20只）。糖尿病大鼠模型的制作：单次腹腔注射链脲佐菌素 50 mg/kg（临用前用0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解，pH 4.2），正常对照组仅腹腔注射等体积上述缓冲液。注射链脲佐菌素48 h后，尾静脉采血测空腹血糖并同时测尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++以上者列入糖尿病观察对象。
给药及标本采集：造模7 d后，苯那普利治疗组灌服苯那普利15 mg/（kg?d），红参虫草胶囊治疗组灌服红参虫草胶囊2 g/（kg?d），正常对照组和模型组每日上午灌服等体积自来水。12周末以代谢笼内收集24 h尿液并离心（2 000 r/min）10 min，留标本待测尿蛋白和尿肌酐，称体质量。将大鼠乙醚麻醉下眶后静脉采血，肝素抗凝， 2 000 r/min离心10 min后，分离血清，留取标本。打开腹腔，快速切除肾脏，在腹主动脉插管后予4 ℃预冷的生理盐水反复灌洗后，滤纸吸干，去掉包膜，称质量。取一部分肾皮质切成小块，立即置入25 g/L戊二醛/0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）固定后制备电镜标本，部分肾脏立即置入体积分数为0.1的中性甲醛液固定，用于光学显微镜标本和免疫组织化学标本的制备。剩余部分液氮冷冻，-74 ℃冰箱里冻存，以备肾组织提取RNA。
一般项目检测：7600型全自动生化分析仪测定血糖、血肌酐、尿素氮，并计算内生肌酐清除率；尿微量白蛋白定量采用上海德波生物技术有限公司提供的试剂，用ELISA法测定，并计算尿白蛋白排泄率。
免疫组织化学检测：将体积分数为0.1的中性甲醛液固定的肾皮质标本，石蜡包埋，切片厚4 μm，采用SABC法，按试剂盒说明书进行，检测纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达。根据肾小球系膜及血管丛染色区变化和染色强度分为0~4分，即0分为无染色或染色极弱；1分为局部弱染、染色区<25%；2分为局部染色趋强、染色区25%~49%；3分为血管丛及系膜区染色增强、染色区50%~75%；4分为血管丛及系膜区强染>75%。由两位观察者对每个样本的肾组织病理光镜和免疫组织化学切片进行双盲法评分，每个样本观察40个肾小球，然后取两者的平均值进行半定量分析。
CTGF基因表达的检测：分别取各组实验大鼠的肾脏皮质100 mg，按Trizol试剂说明书方法操作，提取总RNA。在无核酶管中加入以下试剂：1 μL Oligo dT (500 mg/L)；1 ng~5 μg总RNA；1 μL dNTP (10 mmol/L)；加水至 12 μL。65 ℃加热5 min，迅速放置冰上，分别加入4 μL 5×缓冲液，2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNA酶抑制剂，1 μL SuperScript Ⅱ，短暂离心，于42 ℃ 孵育50 min后，将体系加温至70 ℃，持续15 min以充分灭活反转录酶，反转录成cDNA。CTGF预期扩增片段长度分别为383 bp，GAPDH的长度为452 bp， 25 μL聚合酶链反应体积中含10×聚合酶链反应缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA聚合酶1 U，cDNA模板1 μL，加水至25 μL。反应条件为:①cDNA预变性: 94 ℃ 2 min。②聚合酶链反应扩增：94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min共30个循环。③循环完毕后72 ℃延伸10 min。体积分数为0.015的琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭），每孔上样2.5 μL，同时上样DL-2000标准品（与1.0 μL上样缓冲液混匀），电泳20~30 min，紫外灯下拍照，用凝胶图像处理系统对每一样品聚合酶链反应产物扩增的特异性片段（CTGF和GAPDH）进行灰度扫描，并以GAPDH密度作为参考定量标准，CTGF表达量为CTGF与GAPDH光密度之比。
主要观察指标：①各组大鼠体质量、肾质量/体质量和空腹血糖。②各组大鼠尿素氮、血肌酐、内生肌酐清除率和尿白蛋白排泄率。③大鼠肾组织病理形态学改变。④大鼠肾皮质纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白的表达。⑤大鼠肾组织细胞CTGF mRNA的表达。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0进行数据处理，数据以x(_)±s表示，行方差分析及秩和检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠70只，51只进入结果分析。糖尿病模型大鼠症状典型，部分出现烂尾、肢体感染和溃疡、白内障等并发症。其中，模型组和苯那普利治疗组各死亡6只，红参虫草胶囊治疗组死亡7只。
2.2 各组大鼠体质量、肾质量/体质量和空腹血糖比较 与正常对照组比较，模型组大鼠体质量显著下降、肾质量/体质量和血糖明显增高（P < 0.05，P < 0.01）；苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组大鼠体质量、肾质量/体质量与模型组比较，上述指标明显改善（P < 0.05，P < 0.01），两组间差异无显著性，但红参虫草胶囊治疗组血糖较模型组和苯那普利治疗组下降明显（P < 0.01），见表1。

2.3 各组大鼠尿素氮、血肌酐、内生肌酐清除率和尿白蛋白排泄率比较 与正常对照组相比，模型组大鼠尿素氮、血肌酐、内生肌酐清除率和尿白蛋白排泄率均明显上升（P < 0.01），苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组的上述指标均较模型组显著下降（P < 0.05，P < 0.01）。见表2。

2.4 大鼠肾组织病理形态学改变 光镜下模型组大鼠肾小球系膜区弥漫性增宽，且PAS阳性的均质蛋白性物质明显增多，肾小球基底膜增厚，见图1a，红参虫草胶囊治疗组大鼠肾小球系膜增生、肾小球基底膜增厚均较轻，系膜区PAS阳性物质明显减少，见图1b。

2.5 大鼠肾皮质纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白的表达 实验12周末模型组肾皮质纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原免疫染色从强度到面积较正常对照组明显增加，红参虫草胶囊治疗组纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原免疫染色强度较模型组免疫染色明显减弱，见图2。

半定量分析结果见表3。表3结果表明，模型组达正常对照组的6倍以上（P < 0.01）。苯那普利治疗组与红参虫草胶囊治疗组两组比较差异无显著性（P > 0.05）。
2.6 大鼠肾组织细胞CTGF mRNA的表达 实验大鼠肾组织细胞CTGF及GAPDH基因的反转录-聚合酶链反应扩增片段与预期长度相符，见图3。模型组12周末大鼠肾皮质CTGF mRNA表达（1.17±0.16）较正常对照组 (0.31±0.04)明显增加（P < 0.01），为正常对照组的 3.77倍；苯那普利治疗组和红参虫草胶囊治疗组大鼠肾皮质CTGF mRNA表达水平明显下降，分别为0.65±0.07和0.56±0.09，较模型组分别下降了44.44%和52.14%，差异均有显著性意义（P < 0.05，P < 0.01），但仍高于正常对照组，分别为正常对照组的2.10倍和1.81倍，两组间差异有显著性（P < 0.05）。各组实验大鼠肾脏皮质CTGF mRNA的表达见图3。

3 讨论

本实验采用了链脲佐菌素-糖尿病模型，糖尿病模型动物出现典型的“三多一少”表现，有些出现烂尾、肢体感染、白内障等并发症。理化检查结果表明，糖尿病大鼠血糖、血清尿素氮、血肌酐水平升高，尿糖阳性，尿蛋白排泄量增加，此外，内生肌酐清除率、肾质量/体质量比增加。病理学检查结果亦表明，糖尿病大鼠出现了较典型的早期糖尿病肾病的肾脏病理学改变。因此认为选择该动物模型进行红参虫草胶囊对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制的研究是适宜的。经红参虫草胶囊治疗12周后，糖尿病大鼠升高的血糖、尿素氮、血肌酐、尿白蛋白排泄率、内生肌酐清除率和肾质量/体质量比及肾脏病理形态学改变等有较明显的改善，表明该中药复方制剂对糖尿病所致的肾脏损害，有良好的保护作用。
在糖尿病肾病发病机制中，TGF-β被认为是具有糖尿病肾病肾小球硬化作用的重要细胞因子之一。Bradham等[3]于1991年最先从培养的人脐静脉内皮细胞中分离出CTGF，Mr 36 000~38 000。CTGF富含半胱氨酸的肝磷脂结合多肽，由349个氨基酸组产生，属于即刻早期基因，编码蛋白有明显丝裂原性和趋化性，属于CCN基因家族和胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白超家族。随后的研究发现它广泛表达于成人的心、脑、肾、肺、肝、胎盘和结缔组织等，尤其在肾脏中含量最高[4]，肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均能表达CTGF。人、小鼠和大鼠CTGF蛋白高度保守，90%以上氨基酸具有同源性。在TGF-β诱导下，它可由成纤维细胞等细胞分泌，并介导TGF-β发挥促细胞增生和细胞外基质合成等作用，因此CTGF已成为这一研究领域中新的热点[5-6]。
在生理状态下，根据CTGF及其作用的部位不同，它可显示出不同的生物学效应，但主要表现为促有丝分裂作用、趋化细胞、诱导黏附、促进细胞增生和细胞外基质合成等。此外，CTGF还可调节血管生成并参与机体组织的创伤修复。在病理情况下，CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生密切相关，特别是在肾小球硬化发生、发展过程中CTGF具有重要的意义。Riser等[7]研究了CTGF在糖尿病性肾小球硬化症中表达与调控，发现单独应用重组hCTGF可诱导肾小球系膜细胞增生并大量合成纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原；在TGF-β、高糖或循环机械张力刺激下，肾小球系膜细胞中CTGF mRNA表达明显增加，前两种因素可促进CTGF蛋白质表达。特异性抗TGF-β抗体可抑制高糖的作用，但对循环机械张力的效应无影响，提示高糖可能通过TGF-β起作用；在db/db 糖尿病小鼠动物模型中，小鼠在糖尿病肾病早期，即仅有轻度系膜增生，无蛋白尿和间质病变时，就可检测到系膜区CTGF mRNA表达明显增加，肾脏中其他部位无明显改变。这一系列现象表明，作为TGF-β的下游因子，CTGF在病理状态下过度表达，可能是导致糖尿病肾病系膜区基质沉积和进行性肾小球硬化的重要原因之一。
CTGF与TGF-β的关系密切，TGF-β可诱导多种细胞分泌CTGF，反过来CTGF又可作用于相关细胞，参与TGF-β对这些细胞的促增生和细胞外基质合成作用[8]。Abraham等[9]发现一个新的TGF-β应答元件，存在与CTGF的启动子-244至-166核苷酸序列中，故认为CTGF在TGF-β下游起作用，TGF-β的生物学作用部分是由CTGF介导的。大量的研究证实，TGF-β在糖尿病性肾小球硬化症的发生发展中起关键作用，是糖尿病性肾小球硬化症的治疗靶。然而，TGF-β具有双面刃作用，正常表达时能抑制炎症和细胞增生等，即正面效应；而过度表达时则可引起病理性改变，如细胞外基质积聚和组织器官纤维化，即负面效应。因此，干扰TGF-β的正面效应可能限制抗TGF-β措施的应用[10]。虽然CTGF是TGF-β的下游效应递质，但它只介导TGF-β的负面效应，其正面效应则由非CTGF途径介导。因此，CTGF可能成为防治糖尿病性肾小球硬化症的一个新治疗靶。
本实验结果显示，正常对照组大鼠肾皮质中CTGF mRNA有少量表达，模型组CTGF mRNA表达明显增加，为正常对照组的3.77倍，与Murphy等[2]研究结果基本相符；经红参虫草胶囊及苯那普利治疗12周后大鼠肾皮质CTGF mRNA表达水平显著低于模型组（P < 0.01），与肾小球及其系膜细胞细胞外基质主要成分Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白蛋白表达程度密切相关，表明CTGF在糖尿病肾病的发生、发展中起着极其重要的作用。由于CTGF作用相对单一，它仅介导TGF-β的部分生物学效应，主要是刺激细胞外基质合成，在促进组织纤维化方面起重要作用。因此，阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种更特异、更有效地防治糖尿病性肾小球硬化症的手段。红参虫草胶囊对糖尿病大鼠所表现出的肾脏保护效应，可能与较强的抑制CTGF基因过度表达有关。

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