宋永周1，刘会玲1，崔慧先2，郭 威2，李 莎2
Seropharmacological effects of Kanggu Zengsheng capsules on the proliferation, apoptosis and matrix metalloproteinase secretion of chondrocytes in vitro
Song Yong-zhou1, Liu Hui-ling1, Cui Hui-xian2, Guo Wei2, Li Sha2

Abstract
BACKGROUND: Kanggu Zengsheng capsules exhibit efficacy in treating joint disease. There are many basic studies focusing on cervical syndrome or other joint diseases.
OBJECTIVE: To observe the seropharmacological effects of Kanggu Zengsheng capsules on the proliferation, apoptosis and secretion of matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) of chondrocytes induced byinterleukin-1β (IL-1β).
DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro cytology trial was performed at the Cell Laboratory of Department of Anatomy of Hebei Medical University from March to September 2007.
MATERIALS: One 1-week-old SD rat was prepared for chondrocyte culture; the serum of ten SD rats weighing 200 g was obtained after intragastric administration with medicine water solution.
METHODS：Articular chondrocytes were obtained from the cartilage of 1-week SD rat using digestion method by collagenase NB4, followed by primary culture and subculture of chondrocytes. It was divided into 3 groups: control group, 90%L-DMEM＋10% serum, and normal saline; IL-1β group, 90% DMEM＋10% serum+5 μg/L IL-1β; and Kanggu Zengsheng capsule-conditioned serum +IL-1β group, 90%DMEM＋10% medicine-conditioned serum+5 μg/L IL-1β). After 72 hours incubation, the chondrocytes were digested into single cell suspension. Then they were incubated in the 96-well culture plate with the density of 1×108 L-1 , 100 μL per well and six wells for per group.
MAIN OUTCOME MEASURES: The seropharmacological effects of Kanggu Zengsheng capsules on the proliferation of chondrocytes were observed by inverted microscope. The absorbance was measured by methyl thiazolyl tetrazolium method (MTT). The apoptosis ratio was analyzed by flow cytometry. The concentration of MMP-13 on the supernatants was measured by Elisa kit.
RESULTS: In normal condition, the chondrocytes aligned closely with uniform shape, and few died cells were seen. In control group, the proliferation was slow, and the chondrocytes were dispersed. In IL-1βgroup, the cells aligned scarcely, and vacuolus and irregular nucleus could be seen in some of chondrocytes. In Kanggu Zengsheng capsules serum+IL-1βgroup, the cellular proliferation was quicker than those in IL-1βgroup, cell body was significantly enlarged and nucleus was uniform. The quantity of chondrocytes in IL-1βgroup decreased obviously, while the apoptosis ratio increased significantly. The MMP13 concentration of its supernatants also increased obviously. Kanggu Zengsheng capsules could inhibit the effects induced by IL-1β.
CONCLUSION: Kanggu Zengsheng capsule-conditioned serum can inhibit chondrocyte apoptosis induced by IL-1βand reduce secretion of MMP-13 in vitro.

Song YZ, Liu HL, Cui HX, Guo W, Li S. Seropharmacological effects of Kanggu Zengsheng capsules on the proliferation, apoptosis and matrix metalloproteinase 13 secretion of chondrocytes in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(24):4642-4646 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4642(ps).pdf]

摘要
背景：抗骨增生胶囊在治疗骨关节疾病方面有很好的疗效，基础研究多集中于颈椎病等骨关节疾病上。
目的：拟观察抗骨增生胶囊含药血清对白细胞介素1β引起的软骨细胞增殖凋亡及基质金属蛋白酶分泌的影响。
设计、时间及地点：分组对照体外细胞学实验，于2007-03/09在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。
材料：新生1周SD大鼠，用于培养软骨细胞；体质量200 g 左右SD大鼠10只，以中药水溶液灌胃后定时取血制备含药血清。
方法：采用胶原酶NB4消化法从大鼠关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养，实验分为3组：空白血清组：90%L-DMEM＋10%空白血清，每日给予同等量的生理盐水；白细胞介素1β组（90%DMEM＋10%空白血清＋白细胞介素1β）；中药血清＋白细胞介素1β组（90%DMEM＋10%中药血清＋白细胞介素1β）。白细胞介素1β加入量为5 μg/L，培养 72 h。将实验用细胞消化传代后制成单细胞悬液，以1×108 L-1 的密度接种于96孔培养板，100 μL/孔，每组6孔。
主要观察指标：倒置显微镜下观察中药含药血清对软骨细胞增殖的影响；四甲基偶氮唑盐比色法检测其各孔吸光度变化；流式细胞仪分析凋亡细胞百分率；基质金属蛋白酶13 Elisa试剂盒检测不同组基质金属蛋白酶13分泌情况。
结果：在正常培养基条件下，细胞形态均匀，死亡脱落细胞较少。空白血清组软骨细胞的增殖速度缓慢，细胞较稀疏。白细胞介素1β组细胞明显稀疏，部分细胞胞浆中空泡增多，细胞核形态不规则。在中药血清培养基作用下，软骨细胞增殖的速度较白细胞介素1β组快，胞体显著增大，细胞核形态规则。白细胞介素1β组细胞增殖数量减少，凋亡细胞百分率增加，其培养的细胞上清液中基质金属蛋白酶13含量升高，抗骨增生胶囊含药血清可对抗白细胞介素1β对软骨细胞的影响。
结论：体外条件下，抗骨增生胶囊含药血清能够抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡；降低基质金属蛋白酶13水平。
关键词：软骨细胞；凋亡；金属蛋白酶

宋永周，刘会玲，崔慧先，郭威，李莎. 抗骨增生胶囊含药血清对软骨细胞增殖凋亡及基质金属蛋白酶分泌的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(24):4642-4646 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-24/24k-4642(ps).pdf]

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0 引言

近年研究显示，骨性关节炎的发生与软骨细胞凋亡和细胞外基质的降解有关。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMPs）是细胞外基质降解的主要介质。越来越多的实验研究表明关节软骨局部基质金属蛋白酶的异常增高可能是导致软骨细胞外基质降解，使软骨逐渐出现一系列退变形成骨关节炎的重要原因[1-2]。MMP-13主要是由软骨细胞分泌并作用于Ⅱ型胶原的金属蛋白酶，本实验通过体外软骨细胞培养的方法，观察抗骨增生胶囊含药血清对其增殖凋亡及金属蛋白酶分泌的影响。

1 材料和方法

设计：分组对照体外细胞学实验。
时间及地点：实验于2007-03/09在河北医科大学解剖教研室细胞培养中心完成。
材料：新生1周SD大鼠，用于培养软骨细胞；体质量200 g 左右SD大鼠10只，以中药水溶液灌胃后定时取血制备含药血清，雌雄不拘，由河北医科大学实验动物中心提供（动物合格证编号：SCXK（冀）2003-1-003）。

实验过程：
中药血清制备：将1粒抗骨增生胶囊(0.35 g)于6.67 mL 生理盐水中充分溶解，取2 mL 中药水溶液灌胃，连续给药3 d，末次给药后2 h 戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min 离心10 min，分离血清后于56 ℃ 烤箱中灭活 30 min，0.22 μm 滤膜抽滤除菌，分装制成中药血清，-20 ℃ 低温保存备用。
培养基的配制：完全培养基的配制：90%DMEM和＋10%胎牛血清。中药血清、空白血清培养基配制：按10%比例加入含中药血清、空白血清于DMEM中。培养基中加入青霉素、链霉素10万U/L。
干预分组：实验分为3组：空白血清组：90%L-DMEM＋10%空白血清，每日给予同等量的生理盐水；白细胞介素1β组（90%DMEM＋10%空白血清＋白细胞介素1β）；中药血清＋白细胞介素1β组（90%DMEM＋10%中药血清＋白细胞介素1β）。白细胞介素1β加入量为5 μg/L。
软骨细胞的分离和培养：取新生1周SD大鼠脱颈处死，无菌条件下切取双侧髋膝关节软骨，放入培养皿，浸入DMEM中漂洗数次，剪碎至 1 mm×1 mm 大小，DMEM再次漂洗，除去上清液后将软骨组织移入另一培养皿，加入胶原酶NB4(0.3 U/mL)，37 ℃ 消化4 h。消化后将细胞悬液以150目不锈钢滤网过滤，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入含体积分数为0.1胎牛血清、双抗（青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL）的DMEM培养基，锥虫蓝染色检查死亡细胞比例，血球计数板计数，以1×108 L-1 的密度接种于培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。48 h 后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每二三天换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长情况。当倒置显微镜下观察软骨细胞汇合成片长满大部分培养瓶壁后，倾去培养液，加入2.5 g/L 胰蛋白酶+0.02%
EDTA进行传代培养。甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞的存在。待原代细胞长满后传代培养。取其二三代作为实验用细胞。
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：分别将原代培养及传代培养的软骨细胞接种于盖玻片上，培养7 d，取出制备好的细胞爬片，PBS冲洗，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，SABC法进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。以PBS代替一抗作为阴性对照。软骨细胞浆内分布着棕黄色颗粒，为阳性结果。
四甲基偶氮唑盐比色法检测软骨细胞增殖：将实验用细胞消化传代后制成单细胞悬液，以1×108 L-1 的密度接种于96孔培养板，100 μL/孔，每组6孔。以完全培养基培养24 h，待细胞贴壁后，根据分组情况更换为相应培养基，继续培养72 h。在培养结束前4 h 加入5 g/L 的四甲基偶氮唑盐20 μL/孔，放入培养箱4 h，吸取上清，加入二甲基亚砜200 μL/孔，置于37 ℃ 恒温水浴摇床中振荡10 min 混匀，在酶标仪上测490 nm 处的吸光度（A）值。同一条件下重复3次，取3次实验数值的均数作统计学处理。
流式细胞仪分析中药血清抑制软骨细胞凋亡作用：将实验用细胞消化传代，接种于培养瓶中以完全培养基培养24 h，待细胞贴壁后，根据分组情况更换为相应培养基，继续培养72 h。使用消化液消化，离心收集细胞，PBS洗涤1次，70%冷乙醇4 ℃ 分散固定过夜。加入碘化丙啶（PI）（PI：50 mg/L，Triton-X100 1.0%）1 mL，在4 ℃ 冰箱染色30 min，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液。将样品加入流式细胞仪，激发光源为15 mW 氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟和分析，计算出凋亡细胞百分率。
含药血清对软骨细胞分泌MMP-13的影响：将单细胞悬液以1×108 L-1 的密度接种于24孔板，1 mL/孔， 6孔/组，以完全培养基培养24 h，待细胞贴壁后，根据分组情况更换为相应培养基，继续培养120 h，收集各孔上清液，按试剂盒方法于可见光分光光度计上检测各孔吸光度，换算出MMP-13的大小。
主要观察指标：四甲基偶氮唑盐比色法检测其各孔吸光度变化；流式细胞仪分析凋亡细胞百分率；基质金属蛋白酶13 Elisa试剂盒检测不同组基质金属蛋白酶13分泌情况。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、三作者，干预实施为第一、二作者，评估为全部作者。均经过系统科研培训，未采用盲法评估。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0统计软件包进行单因素方差分析，实验数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 软骨细胞培养及鉴定 分离培养的原代软骨细胞呈圆球形，呈悬浮状态。

软骨细胞爬片经甲苯胺蓝染色后，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，可见一二个核仁。细胞内及细胞周围可见异染颗粒，细胞外基质为浅蓝色，见图2。

2.2 倒置显微镜下观察中药含药血清对软骨细胞增殖的影响

2.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果 按SABC法进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，软骨细胞胞浆被染成棕黄色，细胞相互接触少的地方棕色较淡，细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。说明在培养的软骨细胞和细胞外基质中有Ⅱ型胶原表达，即可以从细胞中分泌Ⅱ型胶原到细胞外基质，提示培养的细胞具有软骨细胞的特征，见图3。

2.4 四甲基偶氮唑盐法检测中药含药血清对软骨细胞增殖的影响 见表1。

2.5 流式细胞仪分析中药血清抑制软骨细胞的凋亡作用 见表2。

2.6 中药含药血清对软骨细胞分泌MMP-13的影响 见表3。
从表3可以看出，白细胞介素1β可以促进MMP-13的产生和分泌，含药血清可降低MMP-13水平。

3 讨论

中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出的，定义是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。这种研究方法避免了中药粗制剂直接加入体外实验体系造成的干扰，又因含药血清能反映药物刺激后体内各种细胞因子的变化，从而通过血清药理学研究的结果更加接近于体内的药理作用[3]。有学者应用中药血清药理学方法观察六味地黄汤、生脉片、马钱子碱对软骨细胞增殖和凋亡的影响[4-6]。近年来，应用含药血清来观察药物对各种细胞的影响报道很多[7-10]。
抗骨增生胶囊是治疗骨关节疾病的中成药，由熟地黄、肉丛蓉、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、牛膝、狗脊、女贞子、莱菔子等药物组成的复方制剂。本药以熟地黄为主药，补益肝肾，强健筋骨，辅以狗脊、肉丛蓉、淫羊霍、女贞子、骨碎补补精助阳、益肝强筋，温煦筋脉。牛膝、鸡血藤补肝肾、养血活血。配以莱菔子理气，补而不滞不燥。全方既有活血化瘀之力，又具有补肾强骨之功，在治疗骨关节疾病方面有很好的疗效[11]，基础研究多集中于颈椎病等骨关节疾病上[12-15]，本实验通过体外软骨细胞培养的方法，观察抗骨增生胶囊含药血清对其增殖凋亡及金属蛋白酶分泌的影响。
近年发现，骨关节炎关节软骨细胞外基质合成与降解失调是造成软骨变性的重要原因之一，组织金属蛋白酶家族被认为在软骨及骨的破坏过程中起了关键作用。基质金属蛋白酶是一组锌依赖性、对细胞外基质成分具有蛋白水解活性的肽链内切酶[16]。生理状态下，金属蛋白酶在基因转录、合成及激活等环节受细胞因子、生长因子、激素、药物和金属蛋白酶组织抑制剂等因素的影响[17-18]。参与MMPs的调节因素构成精密的网络，以保证机体细胞的正常功能和细胞外基质的重建；如果MMPs的调节紊乱，MMPs的产量增多或活性增强，细胞外基质降解增加，则引起骨关节炎等疾病[19-120]。软骨细胞可以特异性产生Ⅱ型胶原。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，可证实本法培养的细胞是纯化的软骨细胞，并保持了体内软骨细胞的基本特性。胶原酶类中的MMP-13(胶原酶-3)是主要由软骨细胞分泌的作用于Ⅱ型胶原的金属蛋白酶，在生理条件下，成骨细胞和软骨细胞均有表达，病理状态下，一系列细胞如骨关节炎软骨细胞、类风湿性关节炎滑膜等，有广泛的酶活性，可以裂解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅺ型胶原、明胶和糖胺多糖。它可以在胶原纤维的三螺旋区裂解胶原纤维，对裂解Ⅱ型胶原活性最强，作用强度是MMP-1、MMP-8的10倍。关节软骨基质中的胶原90%~95%是Ⅱ型胶原，所以观测MMP-13在骨关节炎软骨破坏过程中的表达尤为重要[21]。Freemont等[22]观察到骨关节炎病变部位存在软骨Ⅱ型胶原降解，用原位酶谱方法分析发现，在同一区域MMP-13 mRNA表达增强。
目前认为白细胞介素1是炎症反应的重要调节剂，是最经典的炎症调节剂。白细胞介素1β作为重要的炎性介质具有细胞破坏能力，其在退行性骨关节病中发挥着重要作用。它在软骨细胞降解及退变中起最重要的分解作用，能明显抑制蛋白多糖合成，刺激软骨释放破坏性蛋白酶，是一种有效的MMPs诱导剂，可促进MMP的产生和分泌。白细胞介素1β的系列作用降低了基质合成，促进蛋白多糖降解和软骨细胞破坏，使软骨细胞变性。白细胞介素1β还能够刺激中性蛋白酶和前列腺素E2的产生，加重关节的炎性反应，增加破骨细胞的活性，促进骨质吸收，并降低基质金属蛋白酶抑制因子2合成，鉴于以上原因，白细胞介素1β被用于诱导产生骨关节炎模型[23]。
本实验结果显示，抗骨增生胶囊对骨关节炎预防和治疗机制可能为：通过减轻白细胞介素1β介导的炎症反应及对细胞破坏作用，促进软骨细胞增殖，减轻关节软骨和滑膜的炎性反应；通过抑制软骨细胞的凋亡，减轻关节软骨的损伤与退变；通过抑制MMP-13的产生，抑制细胞外基质中Ⅱ型胶原的降解，抑制软骨基质的破坏，从而减轻关节软骨的降解与破坏。因此，抗骨增生胶囊对关节软骨起到了保护和一定的修复作用，从而对骨关节炎有一定的预防和治疗作用。

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